專利名稱：乙型肝炎病毒核苷類似物耐藥突變檢測試劑盒的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及基因領域，具體是一種乙型肝炎病毒(HBV)核苷類似物耐藥突變檢測
試齊U盒。
背景技術：
慢性乙型肝炎是一種嚴重危害健康、威脅生命的進展性疾病。我國約有1. 2億人攜帶乙肝病毒，其中慢性乙肝患者約3000萬例，每年約有35萬人死于慢性乙肝相關疾病。 在目前的醫(yī)學條件下，一旦乙肝病毒感染慢性化，就很難將之從體內徹底清除。近年來，國內外權威的治療指南都指出，慢性乙型肝炎的治療目標是長期抑制病毒，延緩疾病進展。越來越多的專家已經認識到，長期的核苷類似物治療是一個現實的治療方案，能夠幫助患者實現上述治療目標。然而，過去由于只有拉咪呋定一種口服抗病毒藥物應用于臨床，治療的選擇受到限制，并因YMDD變異等相關耐藥問題受到臨床醫(yī)生的關注。 隨著阿德福韋酯、恩替卡韋的上市及逐步應用，特別是2006年10月我國《乙肝防治指南》的發(fā)布，抗病毒治療在乙型肝炎治療中的作用得到極大的重視，而核苷類似物由于其療效確切、副作用較少、安全可靠、服藥方便而在抗病毒治療中得到越來越普遍的應用。但是，對藥物產生耐藥性是長期抗病毒治療過程中不可避免的重要問題。據文獻報道，拉咪呋定初治慢性乙型肝炎1年至5年的耐藥發(fā)生率分別為^^^42%,53^^70%和70% ；阿德福韋酯初治患者ι年至5年的耐藥發(fā)生率分別So^d^ui^us^^n^1^;恩替卡韋的耐藥率發(fā)生較低，其初治患者1年至3年的耐藥發(fā)生率分別為0%、0^^Π< 1%，且往往需在YMDD 變異的基礎上才出現。一旦產生耐藥性變異，往往會發(fā)生病毒學的反彈和臨床表現的惡化， 需要及時調整和更換治療方案。可以看出，耐藥性的發(fā)生隨著治療時間的延長而增高，且不少藥物之間還存在著交叉耐藥性，因此，及時檢測并發(fā)現耐藥性變異的發(fā)生，可以有效的評估治療效果，進一步指導治療藥物的選擇，具有重要的臨床意義。目前使用的方法主要檢測基因型耐藥，包括直接測序、聚合酶鏈式反應-限制性片段長度多態(tài)性(PCR-RFLP)、序列特異性PCR、線性探針雜交技術及基因芯片等，但對各種方法的準確度作對比與評價的報道不多。其中，基因序列測定是最直接的方法，但過程復雜，成本高。序列特異性PCR特異性不夠，臨床已基本不用。PCR-RFLP方法是一種簡明和較為完善的方法，以錯配PCR結合限制性片段長度多態(tài)性方法，快速檢測患者體內YMDD變異株的發(fā)生情況，該方法通過錯配PCR引入獨特的酶切位點，再用酶切分析，圖譜簡單，容易判斷。此方法具有較好的可靠性和可行性。由于酶切方法只能檢測單點突變，對于可能伴隨其它變異需經過測序分析，因此實際應用中應結合PCR-RFLP篩檢和PCR產物克隆后測序互相證實和補充。線性探針雜交技術(LiPA)除了能夠對HBV進行基因分型外，能夠同時檢測耐藥株和野生株，結果相對準確，但由于其寡核苷酸探針必須是針對已知的突變位點，一個變異位點可能需要多個探針，無法測得未知變異，得到的信息有限，且價格昂貴。
而基因芯片是將寡核苷酸片段作為探針有序及高(或低)密度地固定于基質載體上，與待測的用熒光(或生物素)標記的待測核酸按照堿基配對的原則進行雜交，經相關檢測設備進行結果分析。作為一種高通量的DNA分析技術，可以對眾多疾病相關基因、耐藥分型及多種疾病病種進行并行的高時效分析，國內外均有應用于YMDD變異檢測的成功報道， 特別適用于高通量信息的篩查，是今后發(fā)展的一個重點方向。在以上各種檢測方法中，直接測序法因其原理簡單，重復性好，可以同時檢測多個位點的突變，是目前在臨床上應用最多的一種方法，已經有商業(yè)化的試劑盒銷售，也可以在各實驗室自行完成，但操作步驟多，檢測周期長，費用較高，需要有一定經驗的專業(yè)人員操作，對病毒載量有一定的要求；而基因芯片作為一種高通量的DNA分析技術，可以對眾多疾病相關基因、耐藥分型及多種疾病病種進行并行的高時效分析，是一種信息全面、功能強大的基因分析技術。國內已有應用基因芯片檢測拉咪呋定相關的YMDD變異，但能同時檢測阿德福韋酯、恩替卡韋等多種核苷類似物相關的耐藥性變異未見報道，且往往需要對樣本核酸進行PCR擴增，國內亦無相關產品。有關HBV耐藥性檢測的試劑仍由國外產品主導，且普遍價格昂貴，操作復雜，在國內尚無普遍應用，無法適應我國當前對乙肝病毒耐藥性檢測的實際需求，而國產商業(yè)化的檢測試劑仍是空白，因此急需開發(fā)出一種操作簡便，價格低廉，可以進行快速、準確、高通量檢查的檢測試劑和儀器。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是提供一種具有相近的Tm值，涵蓋檢測4種乙肝抗病毒核酸類似物 (拉米夫定、阿德福韋酯、恩替卡韋、替比夫定)最常見突變位點(共14個)的乙型肝炎病毒核苷類似物耐藥突變檢測試劑盒。本發(fā)明的乙型肝炎病毒核苷類似物耐藥突變檢測試劑盒，包括(1) 一個基因芯片，其上帶有①抗乙肝病毒核苷類似物14個突變類型的探針以及8個正常對照探針，探針選自 SEQ ID Nos 1-43 ；②標記有生物素點的DNA序列(Bio)，用于監(jiān)控雜交是否成功，序列為SEQ ID No. 44 ；③帶有編碼β-球蛋白部分的DNA序列(IC)，作為內控點，用于監(jiān)控PCR體系是否成功，序列為 SEQ ID Nos. 45-46 ；(2)引物，用于擴增乙肝病毒基因組中橫跨P區(qū)(DNA聚合酶逆轉錄酶區(qū))的一段高保守序列引物，DNA序列選自SED ID Nos. 47-48。具體序列如下
權利要求
1.一種乙型肝炎病毒核苷類似物耐藥突變檢測試劑盒，包括(1)一個基因芯片，其上帶有①抗乙肝病毒核苷類似物14個突變類型的探針以及8個正常對照探針，探針選自SEQ ID Nos 1-43 ；②標記有生物素點的DNA序列，序列為SEQID No. 44 ；③帶有編碼β-球蛋白部分的DNA序列，作為內控點，序列為SEQID Nos. 45-46 ；(2)引物，DNA序列選自SED ID Nos. 4了_48。
2.權利要求1所述試劑盒，其特征在于，所述探針5'或3'端經過胺基化處理。
3.權利要求1所述試劑盒，其特征在于，所述基因芯片包括用于定位探針的位置標記。
4.權利要求1所述試劑盒，其特征在于，所述基因芯片的探針是固定在尼龍膜上。
5.權利要求1所述試劑盒，其特征在于，所述引物的5'端標記有生物素。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種乙型肝炎病毒核苷類似物耐藥突變檢測試劑盒，包括(1)一個基因芯片，其上帶有①抗乙肝病毒核苷類似物14個突變類型的探針以及8個正常對照探針，探針選自SEQID Nos1-43；②標記有生物素點的DNA序列，序列為SEQ IDNo.44；③帶有編碼β-球蛋白部分的DNA序列，作為內控點，序列為SEQ ID Nos.45-46；(2)引物，DNA序列選自SED IDNos.47-48。本發(fā)明試劑盒提供了檢測4種抗乙肝藥物常見的14個耐藥突變位點的平臺，檢測突變點較多，操作方便，結果準確可靠，對于慢性HBV感染抗病毒治療中耐藥性的確定和監(jiān)測具有重要的意義。
文檔編號C12Q1/70GK102286635SQ20111020290
公開日2011年12月21日 申請日期2011年7月15日 優(yōu)先權日2011年7月15日
發(fā)明者朱娟娟 申請人:廣東凱普生物科技股份有限公司