專利名稱：一種nk和/或nkt細(xì)胞的培養(yǎng)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種NK和/或NKT細(xì)胞的培養(yǎng)方法。
背景技術(shù)：
NK細(xì)胞，是骨髓來源的淋巴細(xì)胞，可以識(shí)別并殺死病毒感染的細(xì)胞或轉(zhuǎn)化的惡性細(xì)胞。NK細(xì)胞是體內(nèi)快速反應(yīng)細(xì)胞，能迅速被募集至損傷部位，在體外I小時(shí)、體內(nèi)4小時(shí)即可見到殺傷效應(yīng)。NK細(xì)胞的功能是其他免疫細(xì)胞無法替代的，其殺傷腫瘤細(xì)胞的效應(yīng)無MHC限制，因此稱為自然殺傷活性；而且，NK細(xì)胞通過分泌IFN-gamma以及與DC相互作用促進(jìn)Thl型T細(xì)胞活化。體外培養(yǎng)的NK細(xì)胞包括⑶56弱表達(dá)和⑶56強(qiáng)表達(dá)伴隨⑶16表達(dá)或不表達(dá)細(xì)胞群。CD56強(qiáng)表達(dá)細(xì)胞群通過非MHC限制途徑殺傷腫瘤細(xì)胞；而CD56弱表達(dá)且⑶16+細(xì)胞群則通過⑶16-Fc途徑直接產(chǎn)生ADCC，且腫瘤相關(guān)抗原的刺激能進(jìn)一步促進(jìn)ADCC。鑒于NK細(xì)胞在抗腫瘤免疫中的重要功能，有必要開發(fā)一種有效的體外培養(yǎng)并大量擴(kuò)增具有腫瘤殺傷活性的NK細(xì)胞的方法。 現(xiàn)有的NK細(xì)胞體外培養(yǎng)方法盡管已比較成熟，能夠培養(yǎng)出對(duì)腫瘤細(xì)胞殺傷性很高的NK細(xì)胞，但增殖數(shù)量還不夠滿意。IL-2、IL-15和IL-7可以通過與NK細(xì)胞表面的多聚蛋白體受體的結(jié)合而刺激細(xì)胞活化、增殖。此外，一些研究還發(fā)現(xiàn)這三種細(xì)胞因子與NK細(xì)胞的分化相關(guān)。然而，在培養(yǎng)基中僅添加IL-2、IL-15只能使NK細(xì)胞擴(kuò)增10倍左右，并且通常需要飼養(yǎng)層細(xì)胞共同培養(yǎng)，操作復(fù)雜，細(xì)胞得率低。RetroNecinn是TAKARA Bio Inc的專利產(chǎn)品，屬于重組人纖維連接蛋白片段，它含有人纖維連接蛋白CS-I位點(diǎn)和central cell-binding domain,分子量約為63K,其生理活性為參與細(xì)胞的附著、伸展、分化和增殖。RetroNectin的CS-Isite及centralcell-binding domain可與T細(xì)胞表面的VLA結(jié)合,從而刺激細(xì)胞大量繁殖。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種培養(yǎng)NK和/或NKT細(xì)胞的方法。本發(fā)明提供的方法，包括如下步驟將離體的NK和/或NKT細(xì)胞接種到如下培養(yǎng)體系A(chǔ)中培養(yǎng)，即得到增殖的NK和/或NKT細(xì)胞；所述培養(yǎng)體系A(chǔ)為如下I)或2):I)所示培養(yǎng)體系A(chǔ)由抗⑶3抗體、Retronectin、培養(yǎng)基和誘導(dǎo)因子組成；2)所示培養(yǎng)體系A(chǔ)由抗⑶3抗體、培養(yǎng)基和誘導(dǎo)因子組成。所述抗⑶3抗體與所述培養(yǎng)基的配比為5 μ g 5ml;所述Retronectin與所述培養(yǎng)基的配比為25 μ g : 5ml;所述誘導(dǎo)因子為IL-2和IL-15 ；所述IL-2在所述培養(yǎng)體系A(chǔ)中的濃度為800-1200IU/ml，所述IL-2在所述培養(yǎng)體系A(chǔ)中的濃度具體為1000IU/ml ；
所述IL-15在所述培養(yǎng)體系A(chǔ)中的濃度為18ng/ml-22ng/ml,所述IL-15在所述培養(yǎng)體系A(chǔ)中的濃度具體為20ng/ml。I)所示培養(yǎng)體系A(chǔ)中的所述抗⑶3抗體和Retronectin由緩沖液A提供每2ml所述緩沖液A按照如下方法制備將25 μ g Retronectin、5 μ g抗⑶3抗體和濃度為O. 01M、PH值為7. 2的PBS緩沖液混合，用所述PBS緩沖液補(bǔ)至2ml ；2)所示培養(yǎng)體系B中的所述抗⑶3抗體由緩沖液B提供每2ml所述緩沖液B按照如下方法制備將25 μ g Retronectin和濃度為O. 01M、PH值為7. 2的PBS緩沖液混合，用所述PBS緩沖液補(bǔ)至2ml ；所述培養(yǎng)時(shí)間為70小時(shí)-74小時(shí)，所述培養(yǎng)時(shí)間具體為72小時(shí)，所述培養(yǎng)溫度為350C -38°C，所述培養(yǎng)溫度具體為37°C，所述培養(yǎng)所需CO2的濃度為4. 5% -5. 5% (體積百分含量)，所述培養(yǎng)所需CO2的濃度具體為5% (體積百分含量)。 在所述培養(yǎng)步驟后，還包括如下步驟將所述培養(yǎng)得到的細(xì)胞移入不含有抗⑶3抗體和Retronectin的培養(yǎng)體系B中繼續(xù)培養(yǎng)，得到增殖的NK和/或NKT細(xì)胞；所述培養(yǎng)體系B和所述培養(yǎng)體系A(chǔ)的區(qū)別為不含有抗⑶3抗體和Retronectin，其它組分和各組分濃度均相同。所述緩沖液A、所述緩沖液B和所述誘導(dǎo)因子均為獨(dú)立包裝。所述培養(yǎng)基為10% (體積百分含量)離體血漿的T503培養(yǎng)基，即為10% (體積百分含量)自體血漿的T503培養(yǎng)基；所述抗⑶3抗體為單抗或者多抗；所述抗⑶3抗體具體為Anti-⑶3 (單抗)。所述離體的血漿與所述離體的NK和/或NKT細(xì)胞來源于同一物種；所述物種具體為人或動(dòng)物；所述離體的血漿與所述離體的NK和/或NKT細(xì)胞來源于同一個(gè)體。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種用于培養(yǎng)NK和/或NKT細(xì)胞的培養(yǎng)體系。本發(fā)明提供的用于培養(yǎng)NK和/或NKT細(xì)胞的培養(yǎng)體系，所述培養(yǎng)體系A(chǔ)為如下I)或2)I)所示培養(yǎng)體系A(chǔ)由抗⑶3抗體、Retronectin、培養(yǎng)基和誘導(dǎo)因子組成；2)所示培養(yǎng)體系A(chǔ)由抗⑶3抗體、培養(yǎng)基和誘導(dǎo)因子組成。所述抗⑶3抗體與所述培養(yǎng)基的配比為5 μ g : 5ml;所述Retronectin與所述培養(yǎng)基的配比為25 μ g : 5ml;所述誘導(dǎo)因子為IL-2和IL-15 ;所述IL-2在所述培養(yǎng)體系A(chǔ)中的濃度為800_1200IU/ml，所述IL-2在所述培養(yǎng)體系A(chǔ)中的濃度具體為1000IU/ml ；所述IL-15在所述培養(yǎng)體系A(chǔ)中的濃度為18ng/ml_22ng/ml，所述IL-15在所述培養(yǎng)體系A(chǔ)中的濃度具體為20ng/ml。I)所示培養(yǎng)體系A(chǔ)中的所述抗⑶3抗體和Retronectin由緩沖液A提供每2ml所述緩沖液A按照如下方法制備將25 μ g Retronectin、5 μ g抗⑶3抗體和濃度為0. 01M、PH值為7. 2的PBS緩沖液混合，用所述PBS緩沖液補(bǔ)至2ml ；
2)所示培養(yǎng)體系B中的所述抗⑶3抗體由緩沖液B提供每2ml所述緩沖液B按照如下方法制備將25 μ g Retronectin和濃度為O. 01M、PH值為7. 2的PBS緩沖液混合，用所述PBS緩沖液補(bǔ)至2ml ；所述培養(yǎng)基為含10% (體積百分含量)離體血漿的T503培養(yǎng)基；所述抗⑶3抗體為單抗或者多抗；所述抗CD3抗體具體為Anti_CD3。所述緩沖液A、所述緩沖液B和所述誘導(dǎo)因子均為獨(dú)立包裝。所述抗⑶3抗體具體為Anti-⑶3。Anti-⑶3為抗⑶3抗體，為單克隆抗體，購自寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司進(jìn)口產(chǎn)品，原產(chǎn)地古巴分子免疫學(xué)中心，商品名愛歐山，進(jìn)口藥品注冊(cè)證號(hào)S20030084。 所述離體的血漿與所述離體的NK和/或NKT細(xì)胞來源于同一物種；所述物種具體為人或動(dòng)物；所述離體的血漿與所述離體的NK和/或NKT細(xì)胞來源于同一個(gè)體。本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明的方法中，將RetroNectin引入NK細(xì)胞的培養(yǎng)體系，利用NK和NKT細(xì)胞同樣表達(dá)VLA的特點(diǎn)，通過Retronectin的刺激達(dá)到細(xì)胞大量增殖的效果，⑶3mAb可通過與T細(xì)胞表面的TCR結(jié)合刺激細(xì)胞增殖，由于NKT細(xì)胞表面也表達(dá)TCR分子，因此在培養(yǎng)體系中，還加入了⑶3mAb刺激細(xì)胞增殖。Retronectin和⑶3mAb還可以共同作用激活酪氨酸激酶PP125FAK，通過Ras途徑刺激細(xì)胞的增殖和分化。因此，將提取自外周血的PBMC經(jīng)過磁珠分離富集后，獲得高純度的CD56+細(xì)胞，在體外培養(yǎng)體系中加入Retronectin和⑶3mAb兩種蛋白共同刺激，同時(shí)輔以IL-2和IL-15兩種因子誘導(dǎo)，建立一個(gè)可獲得大量具有高殺傷活力的NK和NKT細(xì)胞的培養(yǎng)方法。


圖I為磁珠富集前外周血⑶3和⑶56細(xì)胞表型分析圖2為磁珠富集后將用于培養(yǎng)的細(xì)胞⑶3和⑶56表型結(jié)果圖3為細(xì)胞培養(yǎng)14天的增值倍數(shù)圖4為細(xì)胞培養(yǎng)14天各組細(xì)胞⑶3，⑶16，⑶56表型圖5為細(xì)胞培養(yǎng)14天各組細(xì)胞中NK、NKT、T細(xì)胞的比例圖6為細(xì)胞培養(yǎng)14天各組細(xì)胞殺傷實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖7為細(xì)胞培養(yǎng)14天總細(xì)胞的殺傷效率
具體實(shí)施例方式下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。實(shí)施例I、NK細(xì)胞的分離和培養(yǎng)I、蛋白包被Retronectin購自寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司，目錄號(hào)T200H ；Anti-⑶3為抗⑶3抗體，為單克隆抗體，購自寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司進(jìn)口產(chǎn)品，原產(chǎn)地古巴分子免疫學(xué)中心，商品名愛歐山，進(jìn)口藥品注冊(cè)證號(hào)S20030084 ；
濃度為O. 01M、PH值為7. 2的PBS緩沖液按照如下方法配制將8gNaCl、0. 2g KC1、
I.44g Na2HPO4 和 0. 24g KH2PO4 溶于 1000ml 去離子水中。每2ml包被液A按照如下方法制備將25 μ g Retronectin、5 μ g Anti-Q)3和濃度為O. 01M、PH值為7. 2的PBS緩沖液，用PBS緩沖液補(bǔ)至2ml ；每2ml包被液B按照如下方法制備將25 yg Retronectin和濃度為O. 01M、PH值為7. 2的PBS緩沖液，用PBS緩沖液補(bǔ)至2ml。在培養(yǎng)前一天分別用包被液A和包被液B包被培養(yǎng)瓶，4°C包被過夜(12h)，得到培養(yǎng)瓶I和培養(yǎng)瓶2。2、PBMCs 的分離I)注射器預(yù)吸入Iml肝素，抽取人外周血30ml，得到離體的人外周血。 2)將離體的人外周血，用水平轉(zhuǎn)子離心，2000rpm，20分鐘，得到下層的血細(xì)胞和上層的血漿，吸取上層血漿，56°C滅活30min，保存于4°C待用，得到自體血漿。用等體積濃度為O. 01M、PH值為7. 2的PBS緩沖液重懸下層的血細(xì)胞，得到血細(xì)胞懸液。3)在50ml離心管中預(yù)先加入人淋巴細(xì)胞分離液(Ficoll)(購自天津血液研究所，TBD200ml)，按照血細(xì)胞懸液Ficoll為2 : I (體積比)的比例將25ml血細(xì)胞懸液緩慢加在ficoll上層，保持兩種液體之間存在清晰的液面。水平離心，2000rpm，20分鐘，吸取中間白色層面的細(xì)胞，加入IOml濃度為O. 01M、PH值為7. 2的PBS中，1200rpm離心10分鐘，棄去上清。濃度為O. 01M、PH值為7. 2的PBS重復(fù)洗滌細(xì)胞2次，計(jì)數(shù)，得到3. 3X IO7個(gè)PBMCs。將PBMCs細(xì)胞標(biāo)記⑶3和⑶56抗體(產(chǎn)品均來自美國(guó)貝克曼庫爾特公司。⑶3即為CD3-ECD目錄號(hào)頂2705U，單克隆抗體，克隆號(hào)UCHTl ;CD56即為CD56-PECY5目錄號(hào)頂2654U，單克隆抗體，克隆號(hào)_01(順1(-1))，41避光孵育301^11。每管加入4ml PBS,1000RPM離心5min，棄上清，細(xì)胞用400 μ I PBS重懸，上機(jī)流式細(xì)胞檢測(cè)，結(jié)果如圖I所示，CD56+細(xì)胞占 11. 1%ο3.磁珠分選CD56+細(xì)胞I)將上述獲得的PBMC按每IO7個(gè)細(xì)胞加入80μ I磁珠buffer和20 μ I標(biāo)記⑶56磁珠(標(biāo)記⑶56磁珠及磁珠buffer購自德國(guó)美天旖公司。標(biāo)記⑶56磁珠目錄號(hào)130-050-401 ;磁珠 buffer 由 MACS BSA Stock Solution (目錄號(hào)130-0910376)與 MACSRinsing Solution (目錄號(hào)130-091-222) I 20 混合配得)，4°C孵育 15 分鐘。2)加入2ml磁珠buffer, IOOOrpm離心10分鐘，棄去上清，調(diào)整細(xì)胞濃度為2 XlOVml ο3)將磁珠吸附柱(磁珠吸附柱購自德國(guó)美天旖公司，目錄號(hào)130-041-401)置于磁場(chǎng)中，加入Iml磁珠buffer潤(rùn)透吸附柱,緩慢將細(xì)胞滴入柱中，加入3ml磁珠buffer洗去未標(biāo)記⑶56磁珠的細(xì)胞。4)吸附柱脫離磁場(chǎng)，加入Iml磁珠buffer，快速推動(dòng)助推器收集CD56+細(xì)胞。5)經(jīng)過⑶56磁珠陽選后，獲得細(xì)胞4.6X106個(gè)，占總PBMC的13.9%，⑶56+細(xì)胞計(jì)數(shù)為I. 25X 107。將管中收集的細(xì)胞標(biāo)記⑶3和⑶56抗體，4°C避光孵育30min。每管加入4ml PBS,1000RPM離心5min，棄上清，細(xì)胞用400 μ I PBS重懸，上機(jī)流式細(xì)胞檢測(cè)，結(jié)果顯示，⑶56+的細(xì)胞占到了 99%，其中NK細(xì)胞占21%，NKT細(xì)胞占78% (圖2)。4、接種細(xì)胞I)蛋白包被的培養(yǎng)瓶I和培養(yǎng)瓶2分別用PBS小心沖洗3次。2)將步驟3獲得的⑶56+細(xì)胞分為三組，A組細(xì)胞加入未包被的培養(yǎng)瓶3中，加入5ml含10% (體積百分含量)自體血漿的T503培養(yǎng)基(購自寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司，目錄號(hào)GT-T503)，調(diào)整細(xì)胞濃度為5X105/ml，再加入IL-2(購自北京四環(huán)生物制藥有限公司，終濃度為1000IU/ml)和IL-15 (購自美國(guó)Santa Cruz公司，目錄號(hào)sc-4607,終濃度為20ng/ml)；B組細(xì)胞加入蛋白包被的培養(yǎng)瓶2 (接受Retronectin單一蛋白刺激)中，加入5ml含10% (體積百分含量)自體血漿的T503培養(yǎng)基，調(diào)整細(xì)胞濃度為5 X 105/ml，再加入 IL-2(終濃度為 1000IU/ml)和 IL_15(終濃度為 20ng/ml)；C組細(xì)胞加入蛋白包被的培養(yǎng)瓶I (接受Retronectin和Anti-⑶3兩種蛋白刺激)中，加入5ml含10% (體積百分含量)自體血漿的T503培養(yǎng)基，調(diào)整細(xì)胞濃度為5 X105/ml，再加入 IL-2(終濃度為 1000IU/ml)和 IL_15(終濃度為 20ng/ml)；以上3組細(xì)胞均放入37°C,5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中。5、細(xì)胞脫瓶I)將上述3組細(xì)胞于刺激72小時(shí)后反復(fù)沖洗培養(yǎng)瓶底將細(xì)胞充分吹散成分散狀態(tài)，并分別計(jì)數(shù)；2)將3組刺激后的細(xì)胞均分別移入無蛋白包被培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)，37°C，5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，加入含10% (體積百分含量)自體血漿的T503培養(yǎng)基，調(diào)整細(xì)胞數(shù)為2. 5 XlOVml，再加入 IL-2(終濃度為 1000IU/ml)和 IL-15 (終濃度為 20ng/ml)；3)每?jī)商旒?xì)胞計(jì)數(shù)并調(diào)濃度為2. 5X105/ml、補(bǔ)液、補(bǔ)因子。經(jīng)過14天的培養(yǎng)，臺(tái)盼藍(lán)計(jì)數(shù)法檢測(cè)A、B和C三組細(xì)胞的擴(kuò)增倍數(shù)，結(jié)果如圖3所示，培養(yǎng)4、6、8、10、12、14天A組細(xì)胞擴(kuò)增倍數(shù)分別為1,2. 14,2. 68,6. 43、10. 57、17. 86 ；培養(yǎng)4、6、8、10、12、14天B組細(xì)胞的擴(kuò)增倍數(shù)分別為1,3. 8、17、55、74、97 ;培養(yǎng)4、6、8、10、12、14天C組細(xì)胞的擴(kuò)增倍數(shù)分別為1,3. 1,11. 9,47. 62,190,371. 43 ;A、B、C組經(jīng)過14天的培養(yǎng)的擴(kuò)增細(xì)胞倍數(shù)分別為18倍、97倍和371倍?？梢钥闯?，B組細(xì)胞由于增加了Retronectin的刺激，增殖效果有了明顯的提高。C組細(xì)胞在接受兩種蛋白刺激后，增殖效果較僅接受Retronectin刺激B組又有了較大的提高。將經(jīng)過14天的培養(yǎng)得到的A、B、C三組細(xì)胞分別標(biāo)記⑶3、⑶16 (即為⑶16-FITC目錄號(hào)6604894，單克隆抗體，克隆號(hào)3G8)和CD56抗體，4°C避光孵育30min。每管加入4ml PBS, 1000RPM離心5min，棄上清，細(xì)胞用400 μ I PBS重懸，上機(jī)流式細(xì)胞檢測(cè)，結(jié)果如圖4和圖5所示，圖4看出，三組細(xì)胞培養(yǎng)后絕大多數(shù)細(xì)胞為NK細(xì)胞和NKT細(xì)胞。圖5看出，A組細(xì)胞的NK細(xì)胞、NKT和T細(xì)胞(非NK樣的T細(xì)胞群)比例分別為15. 6%,84. 8%,0. 5%；Β組細(xì)胞的NK細(xì)胞、NKT和T細(xì)胞(非NK樣的T細(xì)胞群)比例分別為27·5%、71·7%、0·6% ;C組細(xì)胞的NK細(xì)胞、NKT和T細(xì)胞(非NK樣的T細(xì)胞群)比例分別為 5. 4%,89. 9%,4. 5% ；B組細(xì)胞與A組細(xì)胞相比，NK細(xì)胞比例提高，提示Retronectin蛋白具有刺激NK細(xì)胞的增殖的作用。促進(jìn)增殖的機(jī)制可能是Retronectin通過結(jié)合NK細(xì)胞表面的VLA從而刺激其增殖。C組細(xì)胞與B組細(xì)胞相比，NKT的比例更高，因?yàn)锳nti-⑶3是通過⑶3-TCR復(fù)合物起到協(xié)同刺激作用的，因此NKT的增殖更為明顯。同時(shí)，C組細(xì)胞相比較于其他兩組。⑶3表達(dá)陽性的細(xì)胞比例明顯提高，其中還出現(xiàn)了 4. 5%的非NK樣的T細(xì)胞群。這部分細(xì)胞可能是在利用磁珠進(jìn)行分選時(shí)摻雜進(jìn)來的T細(xì)胞，在接受了 CD3mAb的刺激后細(xì)胞數(shù)量被放大產(chǎn)生的。將培養(yǎng)14天得到的A、B、C組細(xì)胞分別記作NK_A、NK-B, NK-C細(xì)胞。實(shí)施例2、NK細(xì)胞體外殺傷實(shí)驗(yàn)I、準(zhǔn)備工作I)提前培養(yǎng)人胰腺癌JF305細(xì)胞(可從上海復(fù)祥生物科技有限公司購買)和人結(jié)腸癌HCTl 16細(xì)胞；

2)配置含5% (體積百分比)FBS的無酚紅1640培養(yǎng)基；2、調(diào)整細(xì)胞濃度并加入96孔板中I)PBS洗滌細(xì)胞3次，每次IOOOrpm離心5分鐘，棄去上清。用含5% (體積百分比)FBS的無酚紅1640培養(yǎng)基調(diào)整腫瘤細(xì)胞JF305濃度為2X 105/ml ；2) PBS洗滌細(xì)胞3次，每次1200rpm離心5分鐘，棄去上清。依照效靶比為10 1，20 1,40 I的比例用含5% FBS的無酚紅1640培養(yǎng)基調(diào)整由實(shí)施例I得到的NK-A、NK-B、NK-C 細(xì)胞濃度均分別為 2X107ml，4X106/ml，8X106/ml ；3)板中加入不同濃度的NK-A、NK-B、NK_C細(xì)胞，每孔50ul。4)在已加入NK-A、NK-B, NK-C細(xì)胞的孔中分別加入人胰腺癌JF305，每孔50ul。5)加入空白背景對(duì)照(加入的是5% FBS無酚紅1640)每孔50 μ I。6)補(bǔ)齊體積，不足100 μ I的孔補(bǔ)入50μ I含5% FBS1640培養(yǎng)基。腫瘤細(xì)胞和NK細(xì)胞共孵育4小時(shí)。每孔加入20 μ IMTS標(biāo)記染色。等待4小時(shí)，等顏色有明顯梯度差別時(shí)酶標(biāo)儀檢測(cè)，檢測(cè)波長(zhǎng)為490nm。細(xì)胞殺傷率=(ODs^l ODmis)/ODmam X 100%, OD 為吸光值。結(jié)果如圖6所示，在效靶比為10/1，20/1和40/1時(shí)，針對(duì)JF-305細(xì)胞的殺傷率A組細(xì)胞(NK-A)為 14. 6%，29. 6%和 54. 5% ；B 組細(xì)胞(NK-B) % 48. 5%, 55. 8%,63. 6% ；C組細(xì)胞(NK-C)為22. 9%，47. 5%，62. 6%。14天的細(xì)胞表型顯示，B組的NK細(xì)胞含量較高，因而產(chǎn)生的殺傷效果較明顯；另一方面，C組的NK細(xì)胞比例低于B組，而NKT比例較高，但NKT的直接殺傷效果不及NK，因此B組能夠產(chǎn)生更明顯的效果。以上兩個(gè)因素使體外4小時(shí)的殺傷結(jié)果為相同數(shù)量效應(yīng)細(xì)胞情況下，B組細(xì)胞具有最好的殺傷結(jié)果。比較總殺傷效率(總殺傷效率=相同細(xì)胞時(shí)的殺傷效率X擴(kuò)增倍數(shù))，結(jié)果如圖7所示，針對(duì)JF-305細(xì)胞的總殺傷效率A組細(xì)胞(NK-A)為14. 64%,29. 63%,54. 47% ；B 組為 48. 54%,55. 75%,63. 6% ；B 組細(xì)胞(NK-B)為 14. 64%,29. 63%,54. 47% ；B 組為48. 54%,55. 75%,63. 6% ；C組的總殺傷效率要遠(yuǎn)遠(yuǎn)好于其他兩組，擴(kuò)增倍數(shù)的優(yōu)勢(shì)在這里得到了體現(xiàn)。采用同樣的方法檢測(cè)對(duì)HCTl 16細(xì)胞殺傷力，結(jié)果與對(duì)JF-305細(xì)胞的趨勢(shì)相同。
權(quán)利要求
1.一種培養(yǎng)NK和/或NKT細(xì)胞的方法，包括如下步驟 將離體的NK和/或NKT細(xì)胞接種到如下培養(yǎng)體系A(chǔ)中，培養(yǎng)，即得到增殖的NK和/或NKT細(xì)胞； 所述培養(yǎng)體系A(chǔ)為如下I)或2): 1)所示培養(yǎng)體系A(chǔ)由抗CD3抗體、Retronectin、培養(yǎng)基和誘導(dǎo)因子組成； 2)所示培養(yǎng)體系A(chǔ)由抗CD3抗體、培養(yǎng)基和誘導(dǎo)因子組成。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于 所述抗⑶3抗體與所述培養(yǎng)基的配比為5 ii g 5ml; 所述Retronectin與所述培養(yǎng)基的配比為25 y g : 5ml ； 所述誘導(dǎo)因子為IL-2和IL-15 ； 所述IL-2在所述培養(yǎng)體系A(chǔ)中的濃度為800-1200IU/ml，所述IL-2在所述培養(yǎng)體系A(chǔ)中的濃度具體為1000IU/ml ； 所述IL-15在所述培養(yǎng)體系A(chǔ)中的濃度為18ng/ml-22ng/ml，所述IL-15在所述培養(yǎng)體系A(chǔ)中的濃度具體為20ng/ml。
3.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的方法，其特征在于 1)所示培養(yǎng)體系A(chǔ)中的所述抗CD3抗體和Retronectin由緩沖液A提供 每2ml所述緩沖液A按照如下方法制備將25iig Retronectin、5ii g抗⑶3抗體和濃度為0. 01M、PH值為7. 2的PBS緩沖液混合，用所述PBS緩沖液補(bǔ)至2ml ； 2)所示培養(yǎng)體系B中的所述抗CD3抗體由緩沖液B提供 每2ml所述緩沖液B按照如下方法制備將25iig Retronectin和濃度為0.01M、PH值為7. 2的PBS緩沖液混合，用所述PBS緩沖液補(bǔ)至2ml ； 所述培養(yǎng)時(shí)間為70小時(shí)-74小時(shí)，所述培養(yǎng)時(shí)間具體為72小時(shí)，所述培養(yǎng)溫度為350C -38°C，所述培養(yǎng)溫度具體為37°C，所述培養(yǎng)所需CO2的濃度為4. 5% -5. 5% (體積百分含量)，所述培養(yǎng)所需CO2的濃度具體為5% (體積百分含量)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于 在所述培養(yǎng)步驟后，還包括如下步驟 將所述培養(yǎng)得到的細(xì)胞移入不含有抗CD3抗體和Retronectin的培養(yǎng)體系B中繼續(xù)培養(yǎng)，得到增殖的NK和/或NKT細(xì)胞； 所述培養(yǎng)體系B和所述培養(yǎng)體系A(chǔ)的區(qū)別為不含有抗⑶3抗體和Retronectin，其它組分和各組分濃度均相同。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一所述的方法,其特征在于 所述緩沖液A、所述緩沖液B和所述誘導(dǎo)因子均為獨(dú)立包裝。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5中任一所述的方法,其特征在于 所述培養(yǎng)基為含10% (體積百分含量)離體血漿的T503培養(yǎng)基； 所述抗CD3抗體為單抗或者多抗； 所述抗⑶3抗體具體為Anti-⑶3 ； 所述離體的血漿與所述離體的NK和/或NKT細(xì)胞來源于同一物種； 所述物種具體為人或動(dòng)物。
7.一種用于培養(yǎng)NK和/或NKT細(xì)胞的培養(yǎng)體系，所述培養(yǎng)體系A(chǔ)為如下I)或2):1)所示培養(yǎng)體系A(chǔ)由抗CD3抗體、Retronectin、培養(yǎng)基和誘導(dǎo)因子組成； 2)所示培養(yǎng)體系A(chǔ)由抗CD3抗體、培養(yǎng)基和誘導(dǎo)因子組成。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的培養(yǎng)體系，其特征在于 所述抗⑶3抗體與所述培養(yǎng)基的配比為5 ii g 5ml; 所述Retronectin與所述培養(yǎng)基的配比為25 y g : 5ml ； 所述誘導(dǎo)因子為IL-2和IL-15 ； 所述IL-2在所述培養(yǎng)體系A(chǔ)中的濃度為800-1200IU/ml，所述IL-2在所述培養(yǎng)體系A(chǔ)中的濃度具體為1000IU/ml ； 所述IL-15在所述培養(yǎng)體系A(chǔ)中的濃度為18ng/ml-22ng/ml，所述IL-15在所述培養(yǎng)體系A(chǔ)中的濃度具體為20ng/ml。
9.根據(jù)權(quán)利要求7或8所述的培養(yǎng)體系，其特征在于 1)所示培養(yǎng)體系A(chǔ)中的所述抗CD3抗體和Retronectin由緩沖液A提供 每2ml所述緩沖液A按照如下方法制備將25iig Retronectin、5ii g抗⑶3抗體和濃度為0. 01M、PH值為7. 2的PBS緩沖液混合，用所述PBS緩沖液補(bǔ)至2ml ； 2)所示培養(yǎng)體系B中的所述抗CD3抗體由緩沖液B提供 每2ml所述緩沖液B按照如下方法制備將25iig Retronectin和濃度為0.01M、PH值為7. 2的PBS緩沖液混合，用所述PBS緩沖液補(bǔ)至2ml ； 所述培養(yǎng)基為含10% (體積百分含量)離體血漿的T503培養(yǎng)基； 所述抗CD3抗體為單抗或者多抗； 所述抗⑶3抗體具體為Anti-⑶3。
10.根據(jù)權(quán)利要求7-9中任一所述的培養(yǎng)體系，其特征在于 所述離體的血漿與所述離體的NK和/或NKT細(xì)胞來源于同一物種； 所述物種具體為人或動(dòng)物。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種培養(yǎng)NK和/或NKT細(xì)胞的方法。本發(fā)明提供了一種培養(yǎng)NK和/或NKT細(xì)胞的方法，包括如下步驟將離體的NK和/或NKT細(xì)胞接種到如下培養(yǎng)體系A(chǔ)中培養(yǎng)，即得到增殖的NK和/或NKT細(xì)胞；所述培養(yǎng)體系A(chǔ)由含有抗CD3抗體和/或Retronectin的緩沖液和誘導(dǎo)因子組成。本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)證明，將提取自外周血的PBMC經(jīng)過磁珠分離富集后，獲得高純度的CD56+細(xì)胞，在體外培養(yǎng)體系中加入Retronectin和CD3mAb兩種蛋白共同刺激，同時(shí)輔以IL-2和IL-15兩種因子誘導(dǎo)，建立一個(gè)可獲得大量具有高殺傷活力的NK和NKT細(xì)胞的培養(yǎng)方法。
文檔編號(hào)C12N5/0783GK102676453SQ20111023550
公開日2012年9月19日 申請(qǐng)日期2011年8月16日 優(yōu)先權(quán)日2011年3月17日
發(fā)明者趙平, 趙晨, 馬潔 申請(qǐng)人:中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤研究所