專利名稱：一種檢測綿羊支原體肺炎的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體說是涉及一種與綿羊支原體肺炎(MP)相關(guān)的MBL基因啟動子區(qū)CpG島甲基化狀態(tài)及其應(yīng)用，還提供了檢測綿羊支原體肺炎的方法。
背景技術(shù)：
目前基因啟動子甲基化在表觀遺傳調(diào)控機制中的研究較為深入，與基因表達密切相關(guān)，在疾病研究領(lǐng)域較為廣泛深入，哺乳動物表遺傳學表達調(diào)控的主要形式是DNA甲基化修飾，是指基因組中CpG島的胞嘧啶環(huán)上的第5位碳原子的甲基化，這種修飾是可逆和可遺傳的；除了印記基因和失活的X染色體外，在正常組織中包括啟動子區(qū)在內(nèi)大部分基因的CpG島是非甲基化或低甲基化的，而免疫發(fā)生發(fā)展過程中經(jīng)常能檢測到各種基因的異常甲基化，目前，綿羊MBL基因啟動子區(qū)研究在國內(nèi)外均未報道，因此，研究綿羊MBL基因啟動子區(qū)甲基化狀態(tài)，特別是在該基因的研究上是否存在著關(guān)鍵位點的甲基化導致MBL表達量減低，從而導致對許多疾病的防御能力減弱的現(xiàn)象也有待于進一步證實，對了解該基因的表達調(diào)控等具有重要的意義。綿羊肺炎支原體(Mycoplasma ovipneumoniae,MO)是引起羊支原體性肺炎主要的病原體之一，感染綿羊肺炎支原體后的主要表現(xiàn)為咳嗽、喘氣、漸進性消瘦以及肺間質(zhì)增生性炎癥等臨床癥狀。由于本病感染后常呈慢性表現(xiàn)，康復羊可長期帶菌，因此該病的控制和消滅是比較困難的；綿羊肺炎支原體感染造成的直接損失是羔羊死亡率增加，對養(yǎng)羊業(yè)造成慢性營養(yǎng)消耗、體重減輕、上市推遲、繁殖率降低等間接損失；同時，由于綿羊肺炎支原體與其他能夠引起羊支原體性肺炎的病原缺乏交叉免疫保護性，給免疫預(yù)防帶來困難，因此可通過篩選一些抗感染的基因成為防控該病的主要途徑；甘露聚糖結(jié)合凝集素(marman-binding lectin, MBL)，是一種存在于血清中的C 型血清凝集素，其構(gòu)成補體系統(tǒng)的成分糖蛋白之一，在天然免疫中能防御抵抗多種病原微生物，通過補體第三激活途徑激活補體系統(tǒng)參與構(gòu)成抗感染第一道防線，已表明與一般免疫缺陷、特異性感染等多種疾病相關(guān)，這已在人類的相關(guān)研究中得到證實，而綿羊作為一種重要的家養(yǎng)動物，將該基因作為重要的抗病候選基因有待于進一步深入研究。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供了一種與綿羊支原體肺炎(MP)相關(guān)的MBL基因啟動子區(qū)CpG 島甲基化狀態(tài)及其應(yīng)用，還提供了檢測綿羊支原體肺炎的方法，具體涉及MBL啟動子區(qū)甲基化檢測、人工感染驗證的一種檢測綿羊支原體肺炎的方法，以克服上述不足。本發(fā)明的目的是由以下技術(shù)方案實現(xiàn)的—種檢測綿羊支原體肺炎的方法，包括與綿羊支原體肺炎(MP)相關(guān)的MBL基因啟動子區(qū)CpG島甲基化狀態(tài)及其應(yīng)用，其特征是一種檢測綿羊支原體肺炎的方法，具體涉及 MBL啟動子區(qū)甲基化檢測、人工感染驗證。MBL啟動子區(qū)甲基化檢測
首先證實MBL水平在綿羊支原體肺炎下調(diào)的原因是MBL基因啟動子CpG島的甲基化所致，包括一下步驟(1)樣品采集和DNA提取，采用BSP甲基化檢測技術(shù)對該基因啟動子區(qū)序列進行甲基化檢測，成功地檢測了擴增出的234bp目的片段，甲基化分析發(fā)現(xiàn)，感染MP綿羊MBL基因啟動子區(qū)中的6個CpG位點有5個為甲基化位點，而正常綿羊MBL基因啟動子區(qū)中的6個 CpG位點有4個發(fā)生甲基化，說明樣品中基因啟動子CpG島的甲基化狀態(tài)，與正常對照組相比甲基化狀態(tài)不同，表示其個體患有綿羊支原體肺炎或支原體肺炎易感性高于正常綿羊， 提供了更敏感和準確的綿羊支原體肺炎檢測方法；(2)人工感染驗證人工感染驗證，選用3月齡綿羊43只構(gòu)建試驗群體攻毒組37只，對照組6只，用綿羊肺炎支原體M. ovipneumonia標準株Y-98對攻毒組進行氣管內(nèi)接種，運用BSP甲基化檢測技術(shù)，成功檢測了 37只攻毒組綿羊及6只對照組綿羊中MBL基因啟動子區(qū)甲基化及血清中MBL濃度水平情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)3個與MBL水平相關(guān)的差異顯著CpG甲基化位點，提示相對于攻毒前后MBL水平降低，MBL基因啟動子區(qū)甲基化可能是血清MBL水平降低更顯著的一個特征，有望通過該方法更敏感和準確的檢測綿羊支原體肺炎感染和易感性個體。一種檢測綿羊支原體肺炎的方法，其特征是包括組織基因組DNA按基因組總DNA 的標準提取法提取，采用CpGenome DNA Modification Kit試劑盒，按照說明書對所提取的基因組DNA進行重亞硫酸鹽修飾，方法如下(1)3M NaOH每次用前新配溶解Ig的NaOH顆粒到8. 3mL的水中；20mM Na0H/90% EtOH每次用前新配將900 μ L 100% Et0H、93. 4 μ L去離子水和6. 6 μ L 3Μ NaOH均勻混合；溶解Reagent I每次用前新配，開蓋前使瓶子熱至室溫。修飾一個樣本需要稱0. 227g 的DNA Modification Reagent I和加入0. 571mL水，渦旋充分混勻。處理該試劑時應(yīng)適當謹慎，因為它對呼吸系統(tǒng)和皮膚是有刺激性的。用約20 μ L的3Μ NaOH調(diào)節(jié)ρΗ到5. 0，用 PH試紙檢測ρΗ值試紙變濕時立即讀出，避光保存Reagent I溶液；溶解Reagent II 開蓋前使瓶子熱至室溫。加IpL的β-巰基乙醇到20mL的去離子水中。修飾一個樣本，需加 750 μ L上述溶液到1. 35g的DNA Modification II，混勻至完全分散，剩余的試劑可儲藏在包有錫箔紙的容器里，2°C 8°C黑暗條件下保存6周；(2) 1. 5-2. OmL 的螺旋微量離心管加 7. 0 μ L 的 3M NaOH 到 100 μ L 含 1. 0 μ g DNA的水中IOng/μ L，混勻。注意若樣本少于l.Oyg DNA，力卩2μ L的DNA Modification reagent IV到樣本DNA中，用水加至100 μ L，然后加7. 0 μ L 3Μ NaOH混勻；(3) 50°C孵育DNA IOmin加熱板或水浴；(4)力卩 550 μ L 新配制的 DNA Modification Reagent I，渦旋混勻；(5)50°C中避光孵育4_16h，加熱板或水浴中；(6)初始脫鹽a.劇烈渦旋DNA Modification III至懸浮；用ImL塑料吸管端反復吸打懸浮液10次，分散剩余的凝塊兒；b.加5μ L混勻的DNAModification Reagent III 到DNA溶液管里；c.加750yL的DNA Modification Reagent II，并簡單混勻；d.室溫放置 5-10min ；e. 5，000X g離心IOs白色沉淀物析出，除去上清液；f.加入1. OmL 70%的EtOH, 渦旋混勻，5，OOOXg離心10s，去除上清液。重復3次；g.第3次洗滌的上清液被移除后，高速離心管子2min，用塑料吸頭除去剩余的上清液；
(7) 2次脫鹽a.加501^的20福Na0H/90% EtOH溶液到適當樣本中；b.簡單渦旋使顆粒懸浮，室溫放置5min ；c. 5，000X g離心10s，除去管尖的所有東西。加入1. Oml 90% 的肚0禮渦旋洗滌沉淀，再次離心并去除上清液，額外重復該步驟；d.兩次洗滌去除上清液后，高速離心樣本3min ；(8)用塑料吸管除去所剩余的上清液，在室溫下晾干管子10-20min(酒精味應(yīng)變小)；(9)加TE緩沖液；(10) 50_60°C下孵育樣品 15min 來洗脫 DNA ；(11)高速離心2_;3min，用塑料吸管轉(zhuǎn)移樣品上清液到新管中，_15°C _25°C儲存 2個月，在-80°C可儲存6個月，避免反復凍融，可分裝儲存。參照所獲得的綿羊的MBL基因啟動子區(qū)序列，設(shè)計引物，用于以重亞硫酸鹽修飾的基因組DNA為模板的PCR擴增。上游引物為5' -TTTGATTTTTTTTATATTAAGGTGAGGA-3 ‘；下游弓 | 物為 5’ -AACCCACACTATACCTAATTCTCCC-3’，欲擴增片段長度為234bp。PCR擴增、產(chǎn)物回收、克隆及鑒定、測序分析。本發(fā)明的優(yōu)點是本發(fā)明甘露聚糖結(jié)合凝集素(MBL)廣泛存在于動物和人的肝臟及血液中，它由肝臟細胞合成后分泌進入血液循環(huán)中，通過識別與甘露聚糖結(jié)合，發(fā)揮其免疫調(diào)節(jié)作用，或者激活補體系統(tǒng)，發(fā)揮調(diào)理素的作用，MBL是人類天然免疫系統(tǒng)中重要的一線抗感染分子。綿羊MBL基因的表達調(diào)控、MBL基因啟動子區(qū)甲基化與去甲基化與疾病的關(guān)系等方面還有待進一步研究。本實驗首次采用BSP法成功建立了綿羊MBL基因啟動子區(qū)甲基化檢測平臺， 可在本實驗得到的綿羊MBL基因啟動子區(qū)序列和3個顯著CpG甲基化位點基礎(chǔ)上，參考基因轉(zhuǎn)錄表達調(diào)控機制深入研究綿羊MBL基因調(diào)控機理；發(fā)展分子生物學水平的綿羊支原體肺炎易感性科學檢測技術(shù)；結(jié)合MBL去甲基化分析MBL表達的表觀遺傳機制；分析MBL基因型、血清表達水平與各種疾病的相關(guān)性，為綿羊的抗病育種提供理論基礎(chǔ)；結(jié)合現(xiàn)有研究利用綿羊MBL在人類進行臨床治療，觀察結(jié)果。這不僅對綿羊MBL的研究有著重要的意義，更對表觀遺傳學的作用機制有著更為深刻的意義和廣闊的前景；本發(fā)明擬以綿羊支原體肺炎這個嚴重影響了新疆綿羊產(chǎn)業(yè)的傳染病作為疾病模型，首先克隆綿羊MBL基因的啟動子區(qū)序列，并對MBL基因啟動子區(qū)的結(jié)構(gòu)特征和CpG島甲基化分析，結(jié)合MBL血漿蛋白濃度的分析，篩選出可引起綿羊MBL表達量改變的甲基化位點，證實這些關(guān)鍵位點甲基化與綿羊MP感染率間的關(guān)系，并進一步通過綿羊進行活體感染實驗，驗證綿羊MBL基因啟動子區(qū)甲基化與MP之間的相關(guān)性，并在此基礎(chǔ)上篩選更為敏感和有效的抗病基因型，為綿羊支原體肺炎抗性基因品種的遺傳改良提供基因資源。


圖1是本發(fā)明用于PCR擴增的綿羊基因組DNA的示意圖；圖2是本發(fā)明綿羊MBL基因PCR擴增產(chǎn)物電泳結(jié)果示意圖；圖3是本發(fā)明重組克隆載體pGM-T的鑒定結(jié)果示意圖；圖4是本發(fā)明DNAssist比對結(jié)果示意圖5是本發(fā)明BIQ-Analyzer分析結(jié)果示意圖；圖6是本發(fā)明甲基化檢測及分析示意圖。下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進一步描述，
具體實施例方式實施例如圖1-圖6所示，一種檢測綿羊支原體肺炎的方法，本發(fā)明提供與綿羊支原體肺炎(MP)相關(guān)的MBL基因啟動子區(qū)CpG島甲基化狀態(tài)信息及其應(yīng)用，還提供了檢測綿羊支原體肺炎的方法，具體涉及MBL啟動子區(qū)甲基化檢測、人工感染驗證。(1)、綿羊MBL基因啟動子區(qū)甲基化檢測方法的建立。對綿羊MBL基因啟動子區(qū)的甲基化狀況檢測選擇目前DNA甲基化檢測的金標準一重亞硫酸氫鹽測序法(bisulfite genomic sequencing PCR，BSP)，可以精確檢測給定區(qū)域內(nèi)每個CpG位點的甲基化狀態(tài)及頻率，為我們提供其啟動子區(qū)具體每一個CpG位點的特定甲基化狀態(tài)準確信息。本實驗應(yīng)用重亞硫酸氫鹽測序法如下綿羊基因組DNA中非甲基化胞嘧啶在重亞硫酸氫鹽修飾作用下，可脫去氨基轉(zhuǎn)化為尿嘧啶，經(jīng)PCR反應(yīng)擴增后， 該尿嘧啶變成胸腺嘧啶而產(chǎn)生T A配對，但重亞硫酸氫鹽對已甲基化的胞嘧啶則沒有作用，DNA甲基化狀態(tài)不同的片段就可轉(zhuǎn)化為有堿基序列差異的2個片段，再通過克隆測序， 可以在測序過程中把目的序列全部CpG給完整測出，還可以明確目的序列每個CpG的甲基化狀態(tài)，這就為綿羊MBL基因啟動子區(qū)甲基化與綿羊MP感染的相關(guān)性研究提供了完整的信息和科學依據(jù)。1、1材料和方法組織基因組DNA按基因組總DNA的標準提取法提取，采用CpGenome DNAModification Kit試劑盒，按照說明書對所提取的基因組DNA進行重亞硫酸鹽修飾， (1)3M NaOH(每次用前新配)溶解Ig的NaOH顆粒到8. !BmL的水中；20mM Na0H/90 % EtOH(每次用前新配)將900yL 100% Et0H、93. 4 μ L去離子水和6. 6 μ L 3Μ NaOH均勻混合；溶解Reagent I (每次用前新配)開蓋前使瓶子熱至室溫。修飾一個樣本需要稱0. 227g 的DNA Modification Reagent I和加入0. 571mL水，渦旋充分混勻。處理該試劑時應(yīng)適當謹慎，因為它對呼吸系統(tǒng)和皮膚是有刺激性的。用約20 μ L的3Μ NaOH調(diào)節(jié)ρΗ到5. 0，用 PH試紙檢測ρΗ值(試紙變濕時立即讀出)。避光保存Reagent I溶液；溶解Reagent II 開蓋前使瓶子熱至室溫。加IpL的β-巰基乙醇到20mL的去離子水中。修飾一個樣本， 需加750 μ L上述溶液到1. 35g的DNA Modification II。適當混勻至完全分散，剩余的試劑可儲藏在包有錫箔紙的容器里，2°C 8°C黑暗條件下保存6周；( 1. 5-2. OmL的螺旋微量離心管力口 7. 0 μ L的3M NaOH到100 μ L含1. 0 μ g DNA的水中(IOng/ μ L)，混勻。注意 若樣本少于1. 0 μ g DNA，加2 μ L的DNA Modification reagent IV到樣本DNA中，用水加至100 μ L，然后加7. OyL 3Μ NaOH混勻；(3) 50°C孵育DNA IOmin (加熱板或水浴)；(4)加 550yL新配制的DNA Modification Reagent I，渦旋混勻；(5) 50°C中避光孵育4_16h，加熱板或水浴中；(6)初始脫鹽a.劇烈渦旋DNAModification III至懸浮。用ImL塑料吸管端反復吸打懸浮液10次，分散剩余的凝塊兒；b.力卩5 μ L混勻的DNA Modification Reagent III到DNA溶液管里；c.加750yL的DNA Modification Reagent II，并簡單混勻；d.室溫放置5-10min ；e. 5，000X g離心IOs (白色沉淀物析出)，除去上清液；f.加入1. OmL 70%的Κ0Η，渦旋混勻，5，000X g離心10s，去除上清液。重復3次；g.第3次洗滌的上清液被移除后，高速離心管子2min，用塑料吸頭除去剩余的上清液。(7)2次脫鹽a.加50 μ L的20mM Na0H/90% EtOH溶液到適當樣本中；b.簡單渦旋使顆粒懸浮，室溫放置5min ；c. 5，000X g 離心10s，除去管尖的所有東西。加入1.0ml 90%的肚0!1，渦旋洗滌沉淀，再次離心并去除上清液，額外重復該步驟；d.兩次洗滌去除上清液后，高速離心樣本:3min。(8)用塑料吸管除去所剩余的上清液，在室溫下晾干管子10-20min(酒精味應(yīng)變小)；(9)加TE緩沖液； (10)50-60°C下孵育樣品15!^11來洗脫0嫩；(11)高速離心2_;3min，用塑料吸管轉(zhuǎn)移樣品 (上清液)到新管中，_15°C _25°C儲存2個月，在-80°C可儲存6個月，避免反復凍融，可分裝儲存；參照所獲得的綿羊的MBL基因啟動子區(qū)序列，設(shè)計引物，用于以重亞硫酸鹽修飾的基因組DNA為模板的PCR擴增。上游引物為5' -TTTGATTTTTTTTATATTAAGGTGAGGA-3 ‘；下游弓 | 物為 5’ -AACCCACACTATACCTAATTCTCCC-3’，欲擴增片段長度為234bp。PCR擴增、產(chǎn)物回收、克隆及鑒定、測序分析。2、結(jié)果1、用于PCR擴增的綿羊基因組DNA從圖1可以看出采用酚氯仿提取法所得的綿羊基因組DNA，純度和濃度都很高，可進行下一步PCR擴增實驗。2、PCR擴增結(jié)果以重亞硫酸氫鹽修飾的基因組DNA為模板進行擴增，PCR產(chǎn)物用2 %的瓊脂糖凝膠電泳檢測。結(jié)果顯示，擴增片段長度約為234bp，與目的片段長度相符(圖2)。3、PCR克隆鑒定結(jié)果對回收的DNA片段分別進行TA克隆和菌液PCR檢測，菌液PCR擴增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果，與以綿羊肝臟基因組DNA為模板的PCR產(chǎn)物純化回收電泳結(jié)果相一致(圖 3)，表明重組克隆載體pGM-T構(gòu)建成功。4、測序結(jié)果及分析綿羊MBL基因目的片段測序圖譜清晰、波峰大小適中、無明顯的雜帶。測序所得序列經(jīng)DNAssist軟件分析比對發(fā)現(xiàn)重亞硫酸修飾后序列與GenBank中的比較發(fā)現(xiàn)，非CpG 位點中的非甲基化的“C”均轉(zhuǎn)化為“T”，而其余堿基完全一致(圖4)。圖4DNAssist比對結(jié)果，上排為測序序列，下排為原序列一經(jīng)重亞硫酸修飾后所有非甲基化的胞嘧啶“C”均轉(zhuǎn)化為胸腺嘧啶“T” ；所有6個CpG位點中的甲基化的胞嘧啶“C”仍保持不變運用生物軟件BIQ-Analyzer對序列進行分析后發(fā)現(xiàn)，目的片段中的6個CpG位點中有4個為甲基化位點，有2個位非甲基化位點(圖5)。分析發(fā)現(xiàn)，感染MP綿羊MBL基因啟動子區(qū)中的6個CpG位點有5個為甲基化位點，而正常綿羊MBL基因啟動子區(qū)中的6個 CpG位點有4個發(fā)生甲基化，差異較大，證明本實驗建立的BSP技術(shù)平臺準確可靠，可以幫助我們獲取綿羊MBL基因啟動子區(qū)CpG位點的甲基化狀態(tài)，推測該甲基化狀態(tài)與綿羊MP的感染有一定相關(guān)性，為我們下一步大樣本量的人工感染實驗奠定了穩(wěn)定的檢測基礎(chǔ)，也為綿羊MBL基因啟動子區(qū)甲基化與綿羊MP感染的相關(guān)性研究提供了可靠地科學依據(jù)，更有利于進一步研究綿羊MP表觀遺傳學異常機制。
圖eBIQ-Analyzer分析結(jié)果，深點上排為正常綿羊分析結(jié)果，淺點下排為患病綿羊分析結(jié)果；淺點代表非甲基化位點，代表甲基化位點上排為正常綿羊分析結(jié)果，下排為患病綿羊分析結(jié)果；淺點代表非甲基化位點，深點代表甲基化位點。(2)人工感染驗證啟動子區(qū)CpG島甲基化與MBL水平的相關(guān)性1、材料和方法將實驗羊群隨機分組，攻毒組37只，其中中國美利奴羊新疆軍墾型羔羊33只，湖羊4只，均由氣管內(nèi)接種綿羊肺炎支原體(M. ovipneumonia)標準株Y_98，每只羊接種5ml ； 對照組為6只中國美利奴羊新疆軍墾型，氣管內(nèi)接種相同量滅菌生理鹽水，接種時要將針頭貼在氣管內(nèi)壁上緩慢推注。之后對攻毒組、對照組兩組羔羊給予正常的飼養(yǎng)管理，飼喂過程均不添加抗生素，注意進行臨床觀察。分不同時間段采集血樣，具體時間段為攻毒前一周、攻毒后一天、攻毒后一周、攻毒后二周、攻毒后三周。血液基因組DNA按基因組總DNA的標準提取法提取。參照上述BSP甲基化檢測方法檢測該羊群患病和未患病羊只的甲基化狀態(tài)。2、結(jié)果2. IMBL濃度檢測結(jié)果采用ELISA對供試羊群血清中MBL濃度檢測，使用SPSS 13. 0進行數(shù)據(jù)分析，結(jié)果顯示，所有供試羊群MBL水平在攻毒后都有降低，其中對照組的MBL水平在攻毒前后差異不顯著，而攻毒組的MBL水平卻在攻毒前后的差異極顯著(表1)。2.2甲基化檢測及分析運用生物軟件BIQ-Analyzer對序列進行分析后發(fā)現(xiàn)，6個CpG位點中有2 6個為甲基化位點，有1 4個位非甲基化位點，并按照CpG位點分別編號為CpGl、CpG2、CpG3、 CpG4、CpG5、CpG6(圖 5)深點代表非甲基化位點，淺點代表甲基化位點1、2號為對照組綿羊，3 9號為攻毒組綿羊；O代表非甲基化位點， 代表甲基化位點，圖6分析結(jié)果，2. 3甲基化與MBL水平相關(guān)分析；MBL水平統(tǒng)計分析顯示，對照組的MBL水平在攻毒前后差異不顯著，而攻毒組中的 MBL水平在攻毒后都極顯著降低；供試群體甲基化檢測對比分析顯示，所選目的片段中共6 個CpG位點，對照組有2 4個甲基化位點，其中CpG3、CpG6的甲基化率為3/6，而CpG4、 CpG5均未發(fā)生甲基化；而攻毒組中有4 6個甲基化位點，其中CpG4甲基化率為20/37， CpG5的甲基化率為四/37，CpG6的甲基化率為30/37，死亡6只，見表(1)表IMBL水平與甲基化位點分析Table3 Analysis between methylation and MBL levels
MBL水平(mg.mL」) 中貓化位點死亡率
攻母前攻削53 4 5 6
對照組 4.419±0.625a 4.020士0.381a3 0 0 30/6
攻毒組 4.642±0.509a 1.115±0.199b34 20 29 306/37
針對CpG3 CpG6位點甲基化與MBL水平進行相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)CpG3、CpG4位點甲基化與MBL水平差異顯著(ρ < 0. 05)，CpG5位點的甲基化與MBL水平差異極顯著(ρ < 0.01)，而CpG位點6甲基化與MBL水平差異不顯著(表2)。研究發(fā)現(xiàn)，MBL基因啟動子區(qū)甲基化CpG數(shù)量和甲基化發(fā)生的位點都與血清MBL水平有關(guān)，而且MBL基因啟動子區(qū)每個CpG的甲基化對于MBL血清水平的影響是有所不同的，實驗分析顯示，在檢測到甲基化并且血清水平MBL極顯著降低的6只攻毒試驗中死亡的綿羊標本中，CpGl和CpG2位點甲基化發(fā)生率在攻毒組和對照組間則沒有統(tǒng)計學意義差異，而CpG5甲基化發(fā)生率是最高的，極顯著高于其它5個CpG檢測位點，CpG3和CpG4甲基化發(fā)生率顯著高剩余3個CpG位點，這提示MBL基因中啟動子區(qū)靠近編碼序列的CpG位點(CpG3、CpG4、CpG5)甲基化可能對于調(diào)控MBL蛋白表達具有更為重要的意義。
權(quán)利要求
1.一種檢測綿羊支原體肺炎的方法，包括綿羊支原體肺炎(MP)相關(guān)的MBL基因啟動子區(qū)CpG島甲基化狀態(tài)及其應(yīng)用，其特征是具體涉及MBL啟動子區(qū)甲基化檢測、人工感染驗證MBL啟動子區(qū)CpG島甲基化與綿羊支原體肺炎及MBL水平的相關(guān)性，包括以下步驟(1)樣品采集和DNA提取，采用BSP甲基化檢測技術(shù)對該基因啟動子區(qū)序列進行甲基化檢測，成功地檢測了擴增出的234bp目的片段，甲基化分析發(fā)現(xiàn)，感染MP綿羊MBL基因啟動子區(qū)中的6個CpG位點有5個為甲基化位點，而正常綿羊MBL基因啟動子區(qū)中的6個CpG 位點有4個發(fā)生甲基化，說明樣品中基因啟動子CpG島的甲基化狀態(tài)，與正常對照組相比甲基化狀態(tài)不同，表示其個體患有綿羊支原體肺炎或支原體肺炎易感性高于正常綿羊，提供了更敏感和準確的綿羊支原體肺炎檢測方法；(2)人工感染驗證人工感染驗證，選用3月齡綿羊43只構(gòu)建試驗群體攻毒組37只，對照組6只，用綿羊肺炎支原體M. ovipneumonia標準株Y-98對攻毒組進行氣管內(nèi)接種，運用BSP甲基化檢測技術(shù)，成功檢測了 37只攻毒組綿羊及6只對照組綿羊中MBL基因啟動子區(qū)甲基化及血清中MBL濃度水平情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)3個與MBL水平相關(guān)的差異顯著CpG甲基化位點，即CpG3、 CpG4、CpG5，提示相對于攻毒前后MBL水平降低，MBL基因啟動子區(qū)甲基化可能是血清MBL 水平降低更顯著的一個特征，有望通過該方法更敏感和準確的檢測綿羊支原體肺炎感染和易感性個體。
2.一種檢測綿羊支原體肺炎的方法，其特征是包括組織基因組DNA按基因組總DNA 的標準提取法提取，采用CpGenome DNA Modification Kit試劑盒，按照說明書對所提取的基因組DNA進行重亞硫酸鹽修飾(1) 3M NaOH每次用前新配溶解Ig的NaOH顆粒到 8. 3mL 的水中；20mM Na0H/90% EtOH 每次用前新配將 900 μ L 100% Et0H、93. 4 μ L 去離子水和6. 6 μ L 3Μ NaOH均勻混合；溶解Reagent I每次用前新配，開蓋前使瓶子熱至室溫，修飾克隆測序，分析正常組和患病組的CpG島甲基化狀態(tài)，方法如下一個樣本需要稱0. 227g 的DNA Modification Reagent I和加入0. 571mL水，渦旋充分混勻。處理該試劑時應(yīng)適當謹慎，因為它對呼吸系統(tǒng)和皮膚是有刺激性的。用約20 μ L的3Μ NaOH調(diào)節(jié)ρΗ到5. 0，用 PH試紙檢測ρΗ值試紙變濕時立即讀出，避光保存Reagent I溶液；溶解Reagent II 開蓋前使瓶子熱至室溫。加IpL的β-巰基乙醇到20mL的去離子水中。修飾一個樣本，需加 750 μ L上述溶液到1. 35g的DNAModification II，混勻至完全分散，剩余的試劑可儲藏在包有錫箔紙的容器里，2°C 8°C黑暗條件下保存6周；(2)1. 5-2. OmL的螺旋微量離心管加7. 0 μ L的3M NaOH到100 μ L含1. 0 μ g DNA的水中 IOng/ μ L,混勻。注意若樣本少于 1. 0 μ g DNA,力卩 2 μ L 的 DNA Modification reagent IV到樣本DNA中，用水加至100 μ L，然后加7.0 μ L3M NaOH混勻；(3)50°C孵育DNA IOmin加熱板或水浴；(4)加550 μ L 新配制的 DNA Modification Reagent I，渦旋混勻；(5)50°C中避光孵育4-16h，加熱板或水浴中；(6)初始脫鹽a.劇烈渦旋DNAModification III至懸?。挥肐mL塑料吸管端反復吸打懸浮液10次，分散剩余的凝塊兒；b.加5 μ L混勻的DNAModification Reagent III到 DNA溶液管里；c.加750yL的DNA Modification Reagent II，并簡單混勻；d.室溫放置5-10min ；e. 5，000X g離心IOs白色沉淀物析出，除去上清液；f.加入1. OmL 70%的EtOH, 渦旋混勻，5，000X g離心10s，去除上清液。重復3次；g.第3次洗滌的上清液被移除后， 高速離心管子2min，用塑料吸頭除去剩余的上清液；(7)2次脫鹽a.加50 μ L的20mM Na0H/90% EtOH溶液到適當樣本中；b.簡單渦旋使顆粒懸浮，室溫放置5min;c. 5，000X g離心10s，除去管尖的所有東西。加入1. Oml 90% 的Κ0Η，渦旋洗滌沉淀，再次離心并去除上清液，額外重復該步驟；d.兩次洗滌去除上清液后，高速離心樣本3min ；(8)用塑料吸管除去所剩余的上清液，在室溫下晾干管子10-20min(酒精味應(yīng)變小)；(9)加TE緩沖液；(10)50-60°C下孵育樣品15min來洗脫DNA ；(11)高速離心2-aiiin，用塑料吸管轉(zhuǎn)移樣品上清液到新管中，-15°C _25°C儲存2個月，在-80°C可儲存6個月，避免反復凍融，可分裝儲存，參照所獲得的綿羊的MBL基因啟動子區(qū)序列，設(shè)計引物，用于以重亞硫酸鹽修飾的基因組DNA為模板的PCR擴增。上游引物為5，-TTTGATTTTTTTTATATTAAGGTGAGGA-3’ ；下游引物為5，-AACCCACACTATACCTAATTCTCCC-3，，欲擴增片段長度為234bp。PCR擴增、產(chǎn)物回收、克隆及鑒定、測序分析。采用BSP甲基化檢測技術(shù)對該基因啟動子區(qū)序列進行甲基化檢測，成功地檢測了擴增出的234bp目的片段，甲基化分析發(fā)現(xiàn)，感染MP綿羊MBL基因啟動子區(qū)中的6個CpG位點有5個為甲基化位點，而正常綿羊MBL基因啟動子區(qū)中的6個CpG位點有4個發(fā)生甲基化， 說明樣品中基因啟動子CpG島的甲基化狀態(tài)，與正常對照組相比甲基化狀態(tài)不同，表示其個體患有綿羊支原體肺炎或支原體肺炎易感性高于正常綿羊，提供了更敏感和準確的綿羊支原體肺炎檢測方法。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物檢測技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種檢測綿羊支原體肺炎的方法，提供與綿羊支原體肺炎(MP)相關(guān)的MBL基因啟動子區(qū)CpG島甲基化狀態(tài)及其應(yīng)用，還提供了檢測綿羊支原體肺炎的方法，涉及MBL啟動子區(qū)甲基化檢測、人工感染驗證；對綿羊MBL基因啟動子區(qū)的甲基化狀況檢測選擇重亞硫酸氫鹽測序法，精確檢測給定區(qū)域內(nèi)每個CpG位點的甲基化狀態(tài)及頻率，發(fā)現(xiàn)3個與MBL水平相關(guān)的差異顯著CpG甲基化位點，即CpG3、CpG4、CpG5，提示相對于攻毒前后MBL水平降低，MBL基因啟動子區(qū)甲基化可能是血清MBL水平降低更顯著的一個特征，該方法更敏感和準確的檢測綿羊支原體肺炎感染和易感性個體，綿羊MBL基因啟動子區(qū)甲基化與綿羊MP感染研究提供了完整的信息和科學依據(jù)。
文檔編號C12Q1/68GK102363804SQ201110241708
公開日2012年2月29日 申請日期2011年8月23日 優(yōu)先權(quán)日2011年8月23日
發(fā)明者余鵬, 劉賢俠, 張慧, 張紅梅, 王建梅, 賈斌, 趙鳳, 趙宗勝 申請人:趙宗勝