專利名稱：對dna目標序列進行信號放大和檢測的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及基因突變檢測技術領域。具體來說，涉及一種基于單脫堿基熒光探針與內切酶IV的放大體系，利用該放大體系實現(xiàn)高選擇性、高靈敏度的低豐度基因突變檢測。
背景技術：
基因突變與人類的癌癥密切相關，一些重要的突變可以作為癌癥診斷、治療和預后評價的生物標志物，所以基因突變的檢測有著重大的臨床意義。但是，由于腫瘤處在不同時期、遠端轉移以及腫瘤細胞與正常細胞融合等因素的影響，基因突變通常表現(xiàn)為低豐度。 因而要求檢測方法既具有高靈敏度(檢測到很低的絕對量)，又要具有高選擇性(在眾多野生型鏈中選出突變鏈)。最常用的檢測基因突變的方法是測序，包括Sanger sequencing和 Pyrosequencing，測序方法能夠提供具體的序列組成，但是該方法的選擇性不夠，檢測限只能達到5% -20%，而且，樣品的前處理過程非常繁瑣復雜?；赑CR的序列特異性熒光探針法(實時熒光PCR)克服了檢測限低的問題，兼具高靈敏度和高選擇性，但是PCR過程中實時檢測對探針的設計有很多限制性要求，包括探針3’末端不能與引物配對，探針與引物的距離受一定限制等等。近年來，發(fā)展了一些基于序列特異性探針的信號放大方法。主要包括限制性內切酶放大體系和外切酶III信號放大體系。這兩種方法都具有很高的靈敏度，能夠檢測到 Ifmol的匹配DNA序列。但是它們也有一些缺陷限制性內切酶放大體系由于使用的是限制性內切酶，因而對待測目標鏈有一定的序列要求，從而大大限制了該方法在實際中的應用范圍。而外切酶III放大體系中的外切酶III無法在較高溫度(50°C以上)工作，體系的檢測溫度低于錯配與匹配雙鏈的熔解溫度，從而使探針的區(qū)分能力大大喪失。因此，迫切需要開發(fā)出能選擇性放大突變信號的放大體系，用于高選擇性、高靈敏度的低豐度突變檢測。

發(fā)明內容
本發(fā)明目的是建立一種可選擇性放大突變信號的放大體系，實現(xiàn)高選擇性、高靈敏度的低豐度基因突變檢測。本發(fā)明的技術方案是，利用單脫堿基探針的區(qū)分作用，結合內切酶IV的切割，達到信號放大的目的，從而檢測DNA目標序列，尤其是含有特異性位點(如突變位點)的目標序列。在本發(fā)明的一方面，提供了一種對DNA目標序列進行信號放大和檢測的方法，包括如下步驟1)制備單脫堿基的雙標記熒光探針，該探針為單鏈DNA，一端標記熒光基團，另一端標記猝滅基團，除脫堿基位點外，其序列與DNA目標序列完全匹配，脫堿基位點距離探針5’末端和3’末端5個核苷酸殘基以上；2)將所述探針與待測體系混合，然后加入內切酶IV，在47-60°C的檢測溫度下進行實時熒光測定，在檢測溫度下，探針與目標序列特異性結合，所形成的雙鏈空位被內切酶 IV識別并切割，切割后的探針碎片從目標序列上解離下來，發(fā)出熒光，而釋放出的目標序列繼續(xù)與另一個探針特異性結合，重復上述過程，實現(xiàn)目標序列的信號放大和檢測，所檢測到的熒光強度越高表明待測體系中目標序列的含量越高，其中，所述檢測溫度低于探針與目標序列形成的雙鏈的熔解溫度，但高于探針與待測體系中其他序列形成的雙鏈的熔解溫度。本發(fā)明的探針是單脫堿基DNA探針，可以通過化學合成法直接制備得到單一位點脫堿基(嘌呤或嘧啶)的DNA單鏈，也可以通過其他途徑獲得，例如先制備含有單一尿嘧啶(U)脫氧核苷酸位點的雙標記熒光探針，然后用尿嘧啶-DNA-糖基化酶(toacil DNA-glycosylase, UDG)處理，切除尿嘧啶堿基，剩下脫氧核糖殘基，得到單脫堿基探針 (AP-probe)。上述方法所檢測的DNA目標序列通常是指具有特異性位點(如突變位點)的DNA 序列，下面以基因突變的檢測為例說明本發(fā)明的原理。在基因突變的檢測中，除脫堿基位點外，單脫堿基探針序列與突變體完全匹配，因此，與野生鏈有一個或多個堿基(針對單突變或多突變位點)是錯配的。由于錯配的影響， 探針與突變鏈形成的匹配雙鏈(perfect-match duplex, PM)的熔解溫度(記作Tpm)比探針與野生鏈形成的錯配雙鏈(mismatch duplex,MM)的熔解溫度(記作Tmm)高。于是，當把檢測溫度(記作T)升至兩熔解溫度之間時，即Tmm < T < TPM，探針與野生鏈形成的雙鏈無法穩(wěn)定存在而解鏈，探針卻可以在該溫度下特異性地結合突變鏈?？紤]到區(qū)分能力和非特異性結合，探針的長度一般設置為20-30核苷酸殘基，相應的檢測溫度一般會在50-60°C。內切酶IV是一種脫嘌呤/嘧啶(AP)核酸內切酶，水解DNA上的完整AP位點，切割 5’端與AP位點相連的第一個磷酸二酯鍵，產(chǎn)生3’羥基和5’脫氧核糖磷酸末端。內切酶IV 的推薦工作溫度為37°C，所以必須要探究酶在較高溫度(50-60°C)下是否具有活性。通過測試本發(fā)明的信號放大體系在47-60°C之間能否實現(xiàn)信號放大，證實內切酶IV在47-56°C 之間具有很高的活性，60°C時具有一定的活性。因此，本發(fā)明的放大體系在47-60°C之間都能正常工作。在合適的溫度下，單脫堿基探針選擇性地與突變鏈雜交，形成雙鏈空位。內切酶IV 具有切割雙鏈空位的性質，并且其切割速率遠大于切割單鏈空位的速率。因此，探針與突變鏈形成的雙鏈空位被內切酶IV識別并切割。切割后的探針碎片，由于長度較短，無法在檢測溫度下與目標鏈結合，于是從目標鏈上解離下來。解離前，完整探針兩端的熒光基團和猝滅基團由于熒光共振能量轉移(FRET)而處于猝滅狀態(tài)，解離后，兩基團遠離，熒光基團不再被猝滅，從而發(fā)出熒光信號。同時，解離釋放出的目標鏈可以繼續(xù)與另一個單脫堿基探針結合，重復上述過程，實現(xiàn)信號的放大?？捎糜诒景l(fā)明的熒光基團及其猝滅基團應當滿足熒光基團的發(fā)射光譜與猝滅基團的吸收光譜有效重疊，從而發(fā)生高效率的FRET。常見的包括FAM與TAMRA ；FAM與BHQl ； TET與BHQ2等等。在本發(fā)明的另一方面，提供了一種對DNA目標序列進行信號放大和檢測的試劑盒，在一定檢測溫度下，利用內切酶IV對特異性結合于DNA目標序列上的單脫堿基的雙標記熒光探針進行切割，使探針碎片從目標序列上解離下來，產(chǎn)生熒光信號，同時，解離后的目標序列可以與另一個單脫堿基探針結合，重復上述過程，實現(xiàn)信號的放大，從而實現(xiàn)目標序列的信號放大和檢測；該試劑盒包括單脫堿基的雙標記熒光探針和內切酶IV，其中所述探針為DNA單鏈，一端標記熒光基團，另一端標記猝滅基團，除脫堿基位點外，其序列與DNA 目標序列完全匹配，脫堿基位點距離探針5’末端和3’末端5個核苷酸殘基以上。進一步的，所述探針長度一般設置為20-30核苷酸殘基。所述探針上的熒光基團和猝滅基團選自常用的FRET基團對，如熒光基團FAM和猝滅基團BHQl，熒光基團FAM和猝滅基團TAMRA，熒光基團TET和猝滅基團BHQ2。相比于現(xiàn)有技術，本發(fā)明在檢測低豐度基因突變上具有一些顯著的優(yōu)點(1).普適性，由于內切酶IV的識別位點僅僅是雙鏈空位，且空位的位置可以根據(jù)所要測定的目標序列靈活的設計空位被切割后形成的兩個碎片短鏈的熔解溫度比完整單脫堿基探針的熔解溫度低10°c以上就可以達到較好的放大效果。一般而言，空位位置與探針5’末端和3’末端相距5個堿基以上可以滿足要求。所以，該信號放大和檢測方法可以適用于任何目標序列。(2).高選擇性，內切酶IV耐熱性使反應體系能夠在相對高溫下工作，從而有效利用了錯配熔解溫度差異的性質，同時，一個目標鏈與多個探針結合，實際上是進行了多次選擇，選擇性也得到了放大，從而實現(xiàn)了超高選擇性的檢測，選擇性比其他信號放大方法高出
一個數(shù)量級。(3).低檢測限，由于在檢測過程中，一個目標鏈與多個探針循環(huán)發(fā)生結合-切割-解離的過程，發(fā)出多個探針的熒光信號，實現(xiàn)了目標鏈信號的放大，所以用本發(fā)明方法檢測低豐度突變，能夠檢測到低至的突變體，比其他PCR后檢測方法的檢測限都要低。(4).聯(lián)用性，本發(fā)明方法可以方便的與PCR聯(lián)用，包括選擇性PCR如AS-PCR， C0LD-PCR，實現(xiàn)更靈敏的檢測。與其他方法相比，聯(lián)用只需要加入相關的酶和探針，操作簡單易行。


圖1是應用本發(fā)明對DNA目標鏈進行信號放大和檢測的原理示意圖。圖2是實施例1對低濃度DNA目標序列進行檢測的熒光值變化曲線。圖3是應用本發(fā)明對低豐度突變進行信號放大和檢測的原理示意圖。圖4是實施例2對低豐度突變進行檢測的熒光值變化曲線。
具體實施例方式下面結合附圖，通過具體實施例進一步闡述本發(fā)明。本領域的技術人員應當理解， 這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。實施例1<低濃度匹配DNA序列檢測>在該實施例中，目標物為完全匹配的DNA單鏈，實驗中設置一系列DNA單鏈的濃度梯度，希望能檢測到盡可能少的目標鏈。檢測原理參見圖1，具體步驟如下1.使用UDG酶處理含有尿嘧啶脫氧核苷酸殘基的雙標記熒光探針，得到單脫堿基探針；2.將得到的單脫堿基探針與不同濃度的目標DNA序列混合，然后加入內切酶IV， 迅速測定混合溶液內切酶IV熒光值隨時間的變化。在該實施例中，設計的探針序列如下5，-FAM-TCGTCTCCACUGAAACATACTCCATAA-TAMRA-3，(SEQ ID No. 1)目標序列堿基組成如下5’-GTTTTAAATTATGGAGTATGTTTCTGTGGAGACGAGAGTAAG-3，(SEQ ID No. 2)不同濃度目標序列的50 μ L反應體系中探針量5pmol ；目標序列量5pmol， Ipmol，0· lpmol，IOfmol，Ifmol ；各反應體系中加入IU的內切酶IV?？瞻讓φ阵w系探針5pmol，目標序列量0。熱程序53°C 900s,每k測定一次熒光值。熒光測定儀器為實時熒光PCR儀rotor-gene 6000，檢測時檢測器的靈敏度(gain level)為7. 33。檢測結果熒光值變化曲線如圖2所示，在反應前100s，熒光值隨著時間逐漸增大，7min后，目標序列量多于Ipmol的反應體系中，熒光值達到平臺。實施例2<低豐度突變檢測>在該實施例中，待測體系為野生鏈、突變鏈的混合體系，兩種鏈的總量為5pmol，但設置一系列不同的突變比例，希望能檢測到盡可能低的突變比例。檢測原理參見圖3，具體實施步驟如下1.制備單脫堿基探針，方法同實施例1中步驟1 ；2.分別測定單脫堿基探針與野生鏈、突變鏈形成的雙鏈的熔解溫度，確定合適的檢測溫度；3.將單脫堿基探針與含有不同比例突變鏈的混合目標體系混合，加入內切酶IV， 迅速升溫至步驟2中確定的檢測溫度，測定熒光值隨時間的變化。在該實施例中，設計的探針序列如下5，-FAM-TCTCCACf/GA A ACATACTCCA-BHQ1-3，(SEQ ID No. 3)突變鏈序列組成如下5' -GTTTTAAATTATGGAGTATGT T TCTGTGGAGACGAGAGTAAG-3 ‘ (SEQ ID No. 4)野生鏈序列組成如下5' -GTTTTAAATTATGGAGTATGT G TCTGTGGAGACGAGAGTAAG-3 ‘ (SEQ ID No. 5)(黑體下劃線標記的是突變堿基的位置)不同比例突變體的50 μ L反應體系探針量5pmol ；突變比例100%，10%，5%， 2. 5%，1%，混合鏈總量均為5pmol ；各反應體系中加入IU的內切酶IV?？瞻讓φ战M探針量5pmol ；突變比例0%。熱程序52. 50C 600s,每k測定一次熒光值。熒光測定儀器為實時熒光PCR儀rotor-gene 6000，檢測時檢測器的靈敏度(gain level)為6. 77。檢測結果熒光值變化曲線如圖4所示，熒光值隨著時間逐漸增大，突變體含量 100 %的體系中，熒光值迅速達到平臺。
權利要求
1.一種對DNA目標序列進行信號放大和檢測的方法，包括如下步驟1)制備單脫堿基的雙標記熒光探針，該探針為單鏈DNA，一端標記熒光基團，另一端標記猝滅基團，除脫堿基位點外，其序列與DNA目標序列完全匹配，脫堿基位點距離探針5’末端和3’末端5個核苷酸殘基以上；2)將所述探針與待測體系混合，然后加入內切酶IV，在47-60°C的檢測溫度下進行實時熒光測定，在檢測溫度下，探針與目標序列特異性結合，所形成的雙鏈空位被內切酶IV 識別并切割，切割后的探針碎片從目標序列上解離下來，發(fā)出熒光，而釋放出的目標序列繼續(xù)與另一個探針特異性結合，重復上述過程，實現(xiàn)目標序列的信號放大和檢測，所檢測到的熒光強度越高表明待測體系中目標序列的含量越高，其中，所述檢測溫度低于探針與目標序列形成的雙鏈的熔解溫度，但高于探針與待測體系中其他序列形成的雙鏈的熔解溫度。
2.如權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟1)通過化學合成法制備所述單脫堿基的雙標記熒光探針。
3.如權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟1)先制備含有單一尿嘧啶脫氧核苷酸位點的雙標記熒光探針，然后用尿嘧啶-DNA-糖基化酶對其進行處理，切除尿嘧啶堿基，得到單脫堿基的雙標記熒光探針。
4.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述DNA目標序列是指含有突變位點的DNA 序列。
5.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述探針長度為20-30核苷酸殘基。
6.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述熒光基團和猝滅基團是下列基團對之一 =FAM 和 TAMRA，F(xiàn)AM 和 BHQl，或者 TET 和 BHQ2。
7.—種對DNA目標序列進行信號放大和檢測的試劑盒，在一定檢測溫度下，利用內切酶IV對特異性結合于DNA目標序列上的單脫堿基的雙標記熒光探針進行切割，使探針碎片從目標序列上解離下來，產(chǎn)生熒光信號，同時，解離釋放出的目標序列繼續(xù)與另一個探針特異性結合，重復上述過程，從而實現(xiàn)目標序列的信號放大和檢測；該試劑盒包括單脫堿基的雙標記熒光探針和內切酶IV，其中所述探針為DNA單鏈，一端標記熒光基團，另一端標記猝滅基團，除脫堿基位點外，其序列與DNA目標序列完全匹配，脫堿基位點距離探針5’末端和 3’末端5個核苷酸殘基以上。
8.如權利要求7所述的試劑盒，其特征在于，所述探針長度為20-30核苷酸殘基。
9.如權利要求7所述的試劑盒，其特征在于，所述熒光基團和猝滅基團是下列基團對之一 FAM 和 TAMRA，F(xiàn)AM 和 BHQl，或者 TET 和 BHQ2。
10.如權利要求7所述的試劑盒，其特征在于，所述DNA目標序列是指含有突變位點的 DNA序列。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種對DNA目標序列進行信號放大和檢測的方法，制備單脫堿基的雙標記熒光探針，該探針一端標記熒光基團，另一端標記猝滅基團，除脫堿基位點外，其序列與DNA目標序列完全匹配；在一定檢測溫度下，該探針與目標序列特異性結合形成雙鏈空位，利用內切酶IV識別并切割該雙鏈空位，切割后的探針碎片從目標序列上解離下來，產(chǎn)生熒光信號，而解離釋放出的目標序列可以繼續(xù)與另一個探針結合，重復上述過程，從而實現(xiàn)目標序列的信號放大和檢測。本發(fā)明方法可實現(xiàn)高選擇性、高靈敏度的低豐度基因突變檢測。
文檔編號C12Q1/68GK102296116SQ20111025911
公開日2011年12月28日 申請日期2011年9月2日 優(yōu)先權日2011年9月2日
發(fā)明者宋晨, 張晨, 肖先金, 蘇昕, 趙美萍 申請人:北京大學