專利名稱：Fxyd6胞內(nèi)區(qū)蛋白的表達(dá)和純化方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體地，涉及FXYD6胞內(nèi)區(qū)蛋白的表達(dá)與純化。
背景技術(shù)：
FXYD6基因定位于11號染色體長臂(llq23. 3)，F(xiàn)XYD6蛋白是FXYD家族新成員，全稱為包含F(xiàn)XYD結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)運(yùn)調(diào)節(jié)因子6 (FXYD domain-containing ion transportregulator 6)。它屬于單跨膜蛋白，其結(jié)構(gòu)包含有細(xì)胞外固定的FXYD序列的單跨膜片段，為離子通道或離子通道調(diào)節(jié)器。FXYD6蛋白作為膜蛋白的功能區(qū)分布信號肽位于第l-18aa，胞外區(qū)位于19_38aa，跨膜區(qū)位于39_56aa，57_95aa是胞內(nèi)區(qū)。FXYD6對于大鼠生后和成熟大腦的神經(jīng)元的興奮性有很大的作用，然而在FXYD6與精神分裂癥的易感性的相關(guān)性方面的研究，美國、日本和中國的研究者得出的結(jié)論不一致。近期的研究顯示FXYD6蛋白通過調(diào)節(jié)Na+-K+-ATPase的活性，有助于產(chǎn)生和維持內(nèi)淋巴的內(nèi)耳蝸勢能和保證離子成分穩(wěn)定，有助于內(nèi)耳聽神經(jīng)的平衡功能。有關(guān)FXYD6與腫瘤關(guān)系的研究鮮見報(bào)道，但FXYD家族突變或缺失很可能引起嚴(yán)重病理變化。國內(nèi)周寧新教授領(lǐng)導(dǎo)的課題小組在對FXYD6與腫瘤的關(guān)系方面做了深入的研究，首先從不同分化膽管癌組織中分離得到的差異表達(dá)的L2cDNA片段，反向Northern雜交證實(shí)它在正常膽管組織低表達(dá)，在膽管癌組織中高表達(dá)，且在不同分化膽管癌組織中表達(dá)差異顯著，在低分化膽管癌中高表達(dá)，而高分化膽管癌中相對低表達(dá)。FXYD6 unigene拼接序列中包含L2cDNA，與定位于llq23. 3的FXYD基因家族中的新基因FXYD6高度同源(同源性98. 90%),并從組織cDNA文庫(肝、腦)獲得FXYD6基因全長序列。隨后又在基因和蛋白水平上對FXYD6在膽管癌組織表達(dá)進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)人FXYD6基因在RNA水平上，在正常膽管、膽管癌中均存在表達(dá)，基因的表達(dá)量在正常膽管與膽管癌之間存在明顯差異，與膽管癌分化程度呈負(fù)相關(guān)。體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)，人FXYD6反義核酸可明顯抑制人膽管癌細(xì)胞細(xì)胞(QBC939)的體外增殖能力。出現(xiàn)上述研究結(jié)果的可能原因?yàn)镕XYD6基因定位于11號染色體長臂(llq23. 3)，而11號染色體長臂是包括膽管癌、胰腺癌、肝癌在內(nèi)的多種腫瘤細(xì)胞最常見的異常區(qū)。因此表達(dá)并純化FXYD6蛋白，進(jìn)而制備FXYD6蛋白的單克隆抗體，可以為研究該分子在大腦組織中的具體功能和一些腫瘤發(fā)生及進(jìn)展過程中的分子作用機(jī)制提供重要的工具。檢測該分子在不同組織中的分布情況，定量檢測FXYD6蛋白也有助于我們對一些腫瘤的早期診斷及鑒別診斷。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的主要目的是提供一種經(jīng)過純化的FXYD6胞內(nèi)區(qū)蛋白，為研究該分子在大腦組織中的具體功能和一些腫瘤發(fā)生及進(jìn)展過程中的分子作用機(jī)制提供工具。為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案一種FXYD6胞內(nèi)區(qū)蛋白的表達(dá)和純化的方法，其步驟如下a.采用核苷酸序列如SEQ ID No 2和SEQ ID No 3所示的引物對，利用PCR技術(shù)擴(kuò)增FXYD6胞內(nèi)區(qū)基因；b.將擴(kuò)增出的FXYD6胞內(nèi)區(qū)基因插入到已用BamH I和Xho I雙酶切后的表達(dá)載體PGEX-6P-1中，構(gòu)建重組載體pGEX-6P-l-FXYD6胞內(nèi)區(qū)；C.將重組載體PGEX-6P-1-FXYD6胞內(nèi)區(qū)轉(zhuǎn)化于宿主細(xì)胞中，并在宿主細(xì)胞中表達(dá)FXYD6胞內(nèi)區(qū)蛋白；d.表達(dá)的FXYD6胞內(nèi)區(qū)蛋白采用蛋白質(zhì)免疫印記(Western Blot)進(jìn)行鑒定，之后通過親和層析柱進(jìn)行純化，經(jīng)過純化的蛋白再通過聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分析
鑒定純度。如上所述的方法，其中，所述宿主細(xì)胞優(yōu)選為原核細(xì)胞。如上所述的方法，其中，所述宿主細(xì)胞優(yōu)選為大腸桿菌?！ひ粚τ糜贔XYD6胞內(nèi)區(qū)蛋白的表達(dá)和純化的引物，其中，上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No :2所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No :3所示。一種可在宿主細(xì)胞中表達(dá)FXYD6胞內(nèi)區(qū)蛋白的重組載體，其是采用核苷酸序列如SEQ ID No :2和SEQ ID No :3所示的引物對、利用PCR技術(shù)擴(kuò)增FXYD6胞內(nèi)區(qū)基因后，將擴(kuò)增出的FXYD6胞內(nèi)區(qū)基因插入到已用BamH I和Xho I雙酶切后的表達(dá)載體pGEX_6P_l中，所得到的重組載體。一種可在宿主細(xì)胞中表達(dá)FXYD6胞內(nèi)區(qū)蛋白的重組載體，其核苷酸序列如SEQ IDNo 4所示。一種含有如上所述的重組載體的宿主細(xì)胞。如上所述的宿主細(xì)胞，其優(yōu)選為原核細(xì)胞。如上所述的宿主細(xì)胞，其優(yōu)選為大腸桿菌。本發(fā)明的有益效果為本發(fā)明提供了 FXYD6胞內(nèi)區(qū)的純化蛋白，進(jìn)一步可應(yīng)用于制備FXYD6蛋白胞內(nèi)區(qū)的單克隆抗體。制備的FXYD6單克隆抗體可以應(yīng)用于免疫組化、Western Blot、ELISA等實(shí)驗(yàn)，這樣就為進(jìn)一步研究FXYD6組織分布提供了有利工具，也可以用FXYD6單克隆抗體通過免疫印跡和免疫沉淀來研究FXYD6與其它蛋白相互作用情況。


圖I為原核質(zhì)粒pGEX-6P-l的表達(dá)載體圖譜。圖2為重組質(zhì)粒pGEX-6P-l-FXYD6胞內(nèi)區(qū)的PCR鑒定結(jié)果。圖3為FXYD6胞內(nèi)區(qū)重組蛋白表達(dá)的SDS-PAGE分析結(jié)果。圖4為FXYD6胞內(nèi)區(qū)重組蛋白表達(dá)的Western Blot檢測結(jié)果。圖5為純化后的FXYD6胞內(nèi)區(qū)重組蛋白的SDS-PAGE分析結(jié)果。
具體實(shí)施例方式一、實(shí)驗(yàn)材料UTaq DNA聚合酶、限制性內(nèi)切酶BamH I、Xho I和T4 DNA連接酶(TaKaRa公司)2、FXYD6全長cDNA序列(武漢三鷹生物技術(shù)有限公司)3、克隆質(zhì)粒載體 pMDl8_T Simple Simple (TaKaRa 公司)
4、表達(dá)質(zhì)粒載體 pGEX_6P_l (TaKaRa 公司)5、質(zhì)粒提取試劑盒(TaKaRa公司)6、克隆宿主大腸桿菌Trans 10、表達(dá)宿主大腸桿菌BL21 (TaKaRa公司)7、鼠抗GST標(biāo)簽單克隆抗體(HaiGene公司)8、GST融合蛋白親合層析柱(Sigma公司)9、HRP (辣根過氧化物酶)標(biāo)記羊抗小鼠IgG(北京經(jīng)緯博恒生物科技開發(fā)有限責(zé)任公司)KKWestern Blot Kit高靈敏度化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒(北京康為世紀(jì)生物有限公司)二、實(shí)驗(yàn)方法I、引物設(shè)計(jì)與合成FXYD6蛋白的開放閱讀框cDNA序列如序列表SEQ ID No : I所示，其中，169-288位核苷酸序列為胞內(nèi)區(qū)序列。參考如圖I所示的原核質(zhì)粒PGEX-6P-1的圖譜，為方便克隆且保證目的基因片段以一個(gè)方向插入質(zhì)粒中，克隆FXYD6胞內(nèi)區(qū)序列，并在克隆的同時(shí)，在其上下游分別添加BamH I和Xho I酶切位點(diǎn)，此位點(diǎn)為質(zhì)粒pGEX_6P_l所帶有。為實(shí)現(xiàn)上述目的，設(shè)計(jì)以下一對引物上游引物Pl(SEQ ID No. 2) :5' -ggatccctaa gtcgcaggtg caag-31 ,其中 ggatcc為BamH I酶切位點(diǎn)；下游引物P2 (SEQ ID No. 3) 5 1 -ctcgagtcag ttctctgctt tctgg-3 1，其中ctcgag為Xho I酶切位點(diǎn)。2、目的基因的擴(kuò)增(I)PCR反應(yīng)體系如表I所示。表IPCR 反應(yīng)體系(50 μ L)
序號成分各成分用量
1FXYD6 cDNA2\ ,
2Pl2\ ,
3P22\ ,
4IOxbuffer5pL
52.5mM dNTPSμL
6DNATaqIpL
7ddH203 (^L(2)PCR反應(yīng)條件的設(shè)置如表2所示。表2PCR反應(yīng)條件的設(shè)置
權(quán)利要求
1.一種FXYD6胞內(nèi)區(qū)蛋白的表達(dá)和純化的方法，其特征在于，步驟如下 a.采用核苷酸序列如SEQID No :2和SEQ ID No :3所示的引物對，利用PCR技術(shù)擴(kuò)增FXYD6胞內(nèi)區(qū)基因； b.將擴(kuò)增出的FXYD6胞內(nèi)區(qū)基因插入到已用BamHI和Xho I雙酶切后的表達(dá)載體PGEX-6P-1中，構(gòu)建重組載體pGEX-6P-l-FXYD6胞內(nèi)區(qū)； c.將重組載體PGEX-6P-1-FXYD6胞內(nèi)區(qū)轉(zhuǎn)化于宿主細(xì)胞中，并在宿主細(xì)胞中表達(dá)FXYD6胞內(nèi)區(qū)蛋白； d.表達(dá)的FXYD6胞內(nèi)區(qū)蛋白采用蛋白質(zhì)免疫印記進(jìn)行鑒定，之后通過親和層析柱進(jìn)行純化，經(jīng)過純化的蛋白再通過聚丙烯酰胺凝膠電泳分析鑒定純度。
2.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，所述宿主細(xì)胞為原核細(xì)胞。
3.如權(quán)利要求I或2所述的方法，其特征在于，所述宿主細(xì)胞為大腸桿菌。
4.一對用于FXYD6胞內(nèi)區(qū)蛋白的表達(dá)和純化的引物，其特征在于，上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No :2所示,下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No :3所示。
5.—種可在宿主細(xì)胞中表達(dá)FXYD6胞內(nèi)區(qū)蛋白的重組載體，其特征在于，其是采用核苷酸序列如SEQ ID No 2和SEQ ID No 3所示的引物對、利用PCR技術(shù)擴(kuò)增FXYD6胞內(nèi)區(qū)基因后，將擴(kuò)增出的FXYD6胞內(nèi)區(qū)基因插入到已用BamH I和Xho I雙酶切后的表達(dá)載體PGEX-6P-1中，所得到的重組載體。
6.一種可在宿主細(xì)胞中表達(dá)FXYD6胞內(nèi)區(qū)蛋白的重組載體，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID No 4所示。
7.一種含有權(quán)利要求5或6所述的重組載體的宿主細(xì)胞。
8.如權(quán)利要求7所述的宿主細(xì)胞，其特征在于，所述宿主細(xì)胞為原核細(xì)胞。
9.如權(quán)利要求7所述的宿主細(xì)胞，其特征在于，所述宿主細(xì)胞為大腸桿菌。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種FXYD6胞內(nèi)區(qū)蛋白的表達(dá)和純化的方法，是采用核苷酸序列如SEQ ID No2和SEQ ID No3所示的引物對、利用PCR技術(shù)擴(kuò)增FXYD6胞內(nèi)區(qū)序列后，將擴(kuò)增出的FXYD6胞內(nèi)區(qū)序列插入到表達(dá)載體pGEX-6P-1中，構(gòu)建重組載體pGEX-6P-1-FXYD6胞內(nèi)區(qū)；再將重組載體轉(zhuǎn)化于宿主細(xì)胞中，并在宿主細(xì)胞中表達(dá)FXYD6胞內(nèi)區(qū)重組蛋白；表達(dá)的重組蛋白進(jìn)行鑒定后，通過親和層析柱進(jìn)行純化，經(jīng)過純化的蛋白再通過SDS-PAGE分析鑒定純度。本發(fā)明提供了FXYD6胞內(nèi)區(qū)的純化蛋白，進(jìn)一步可應(yīng)用于制備FXYD6蛋白胞內(nèi)區(qū)的單克隆抗體。為進(jìn)一步研究FXYD6組織分布提供了有利工具。
文檔編號C12N15/11GK102978210SQ201110259079
公開日2013年3月20日 申請日期2011年9月2日 優(yōu)先權(quán)日2011年9月2日
發(fā)明者周寧新 申請人:周寧新