專利名稱：一種類芽孢桿菌中性植酸酶的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種類芽孢桿菌中性植酸酶，特別涉及編碼該中性植酸酶的基因序列及氨基酸序列。
背景技術(shù)：
植酸酶，又稱為肌醇六磷酸水解酶，是催化植酸和植酸鹽水解成肌醇和磷酸(或鹽)的一類酶的總稱，能水解植酸最終釋放出無機(jī)磷。近年來被廣泛用于促進(jìn)單胃動物的生長發(fā)育和提高飼料中磷的利用率，其研究對提高畜牧生產(chǎn)效益及降低環(huán)境污染有重要意義；在食品中應(yīng)用植酸酶可以改善鐵和鋅的吸收，有利于改善人群的營養(yǎng)。目前植酸酶在工業(yè)化生產(chǎn)上存在的主要問題是天然材料中表達(dá)水平低，不能完全滿足飼料加工的要求。通過構(gòu)建基因工程菌，可實現(xiàn)了植酸酶的高效表達(dá)。因此，找到一種新型的植酸酶，并通過基因工程手段克隆該植酸酶基因，然后在生物反應(yīng)器中高效表達(dá)植酸酶基因，可以使植酸酶的制備產(chǎn)業(yè)化。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種新的植酸酶基因，將該基因克隆并表達(dá)后，可以得到一種類芽孢桿菌中性植酸酶，該酶可以產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)，并具有較高的比活力。本發(fā)明通過如下工作提供了一種類芽孢桿菌中性植酸酶基因從新疆高溫照射環(huán)境中取得土壤，并進(jìn)行微生物富集培養(yǎng)，篩選出可分泌胞外植酸酶的類芽孢桿菌(Paenibacillu sp.)，進(jìn)行了基因組的提取與鑒定。該菌株16S rRNA的 PCR產(chǎn)物長度約1. 51Λ，測序后與GenBank數(shù)據(jù)庫中DNA序列進(jìn)行比對，發(fā)現(xiàn)該序列與類芽孢桿菌的16s rRNA基因序列相似性達(dá)98%。因此，將該菌株在分類學(xué)上鑒定為類芽孢桿菌；從Genbank中找到其他類芽孢桿菌植酸酶基因序列，設(shè)計簡并引物，并從該菌基因組中通過PCR的方法克隆得到一個中性植酸酶基因，命名為phyP。PCR產(chǎn)物經(jīng)過測序，得到的核苷酸序列如SEQ ID NO 1所示，此序列推導(dǎo)出的氨基酸序列如SEQ ID NO 2所示；將SEQ ID NO :1所示基因phyP克隆到表達(dá)載體pPIC9K，轉(zhuǎn)化到酵母菌GSl 15中。 利用甲醇誘導(dǎo)植酸酶的表達(dá)，通過鎳柱親和純化帶有組氨酸標(biāo)簽的植酸酶。通過SDS-PAGE 驗證植酸酶純化情況；對上述植酸酶進(jìn)行了性質(zhì)的測定，通過不同溫度和不同pH值的處理，得到該酶的最適溫度和最適PH值等性質(zhì)，發(fā)現(xiàn)該酶在較廣范圍內(nèi)都有活性，而在中性條件下6. 5-7. 5 之間活性最大。經(jīng)測定，本發(fā)明得到的新的植酸酶比活力約為1100U/mg。本發(fā)明提供的新的中性植酸酶基因，具有SEQ ID NO 1所示的核苷酸序列。SEQ ID NO :1所編碼的植酸酶蛋白具有SEQ ID NO :2所示的氨基酸序列或其衍生序列。
所述氨基酸序列的衍生序列包括以下情況(a)將SEQ ID NO :2氨基酸序列經(jīng)過一個或多個氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的，且具有植酸酶功能的多肽；(b)將SEQ ID NO 1所示的核酸分子的簡明序列所編碼的多肽；(c)在嚴(yán)謹(jǐn)條件下與SEQ ID NO 1所示核酸分子的互補(bǔ)鏈雜交的核酸所編碼的具有植酸酶活性的多肽；(d)由SEQ ID NO 1所示核酸分子的等位基因或天然變體所編碼的具有植酸酶活性的多肽；或(e)與SEQ ID NO :2所示的多肽序列具有至少70%同源性的具有植酸酶活性的多肽，優(yōu)選75%，80%，85%，90%或95%，特別是99%的同源性。(f)如權(quán)利要求的任一項分離的植酸酶，在其下列位置(根據(jù)SEQ ID NO :2中的編號方法進(jìn)行編號)包含一個或多個突變:1，3，4，5，6，7，8，10，11，13，15，16，18，19，41，42， 67，68，69，70，71，72，80，81，82，83，87，88，89，90，92，93，95，96，97，98，99，101，103，104， 106，107，108，109，110，112，113，114，115，122，123，124，125，126，127，128，129，130，131， 132，136，138，152，153，154，155，156，160，230，231，232，241，246，247，250，251，268，269， 276，277，278，279，283。經(jīng)實驗(見實施例6 8)證實本發(fā)明篩選的到得植酸酶在較廣范圍內(nèi)都有活性，在中性條件PH值6. 5-7.5之間活性最大。pH 7. 5的條件下，經(jīng)測定得到的植酸酶比活力約為1100U/mg。本發(fā)明提供的上述新的植酸酶基因phyP的用途是，可以用于產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)具有較高酶活性的中性植酸酶。如可以通過基因工程手段，包括人工合成該植酸酶基因PhyP或用其它方式克隆該基因，然后在生物反應(yīng)器中高效表達(dá)。


圖1 中性植酸酶PHYP的最適pH結(jié)果；圖2 :pPIC9K-phyP 的質(zhì)粒圖譜。序列信息編碼類芽孢桿菌的中性植酸酶成熟蛋白質(zhì)的DNA序列SEQ ID NO=I ；類芽孢桿菌的中性植酸酶成熟蛋白質(zhì)的氨基酸序列SEQ ID NO :2。
具體實施例方式以下實施例中所用的材料和試劑來源如下菌株與載體大腸桿菌菌株E. coli BL21 (DE3)購自Novagen公司，載體由本研究構(gòu)建并保存。巴斯德畢氏酵母GSl 15和表達(dá)載體pPIC9K購自invitrogen公司。酶與試劑盒限制性內(nèi)切酶，連接酶，Taq酶為NEB公司產(chǎn)品?；蚪M提取試劑盒為Omega公司產(chǎn)品。生化試劑DNA合成試劑為Milipore公司產(chǎn)品。引物合成為ABI公司Cyclone DNA 合成儀。IPTG、X-Gal、SDS及植酸酶鈉為Sigma公司產(chǎn)品。TEMED、過硫酸銨、丙烯酰胺及甲叉雙丙烯酰胺為Promega公司產(chǎn)品。NTA樹脂為Qiagen公司產(chǎn)品。
培養(yǎng)基大腸桿菌LB培養(yǎng)基為蛋白胨、0. 5%酵母提取物、l%NaCl，pH 7.0。 巴斯德畢氏酵母YPD培養(yǎng)基為2%蛋白胨、酵母提取物、2%葡萄糖，pH 7.0。富集培養(yǎng)為植酸鈉1%，酵母膏0.5%，蛋白胨0.3%，NaCl 0. 5%,pH6.0o篩選培養(yǎng)基為植酸鈉1%， NaN03 0. 3%, MgS04 0. 5%, KCl 0. 5%, K2HP04 0· 1 %，F(xiàn)eS04 · 7H200. 001 %，瓊月旨 1 %， ρΗ6· 0。實施例1產(chǎn)植酸酶的類芽孢桿菌的篩選從新疆高溫照射環(huán)境中取得土壤進(jìn)行微生物富集培養(yǎng)。稱取Ig 土壤放入富集培養(yǎng)基中，37°C，200r/min，培養(yǎng)6天。每日吸取少量培養(yǎng)液進(jìn)行梯度稀釋(10_2 10_1(1)，涂布于含有植酸鈉的篩選固體培養(yǎng)基中，37°C恒溫培養(yǎng)3天。待長出菌落后反復(fù)劃線分離，選取得到可水解植酸鈉且水解圈較大的菌落。實施例2類芽孢桿菌(Paenibacillus sp.)基因組的提取與鑒定將實施例1中選取的培養(yǎng)基中的菌落，挑取單菌落放入LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，取菌液用于該菌的基因組DNA的提取。使用Omega公司的細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒，按公司提供的試劑盒操作說明書提取該菌的基因組DNA。為了鑒定菌屬，以基因組DNA為模板， 進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增該菌株的16s rRNA基因序列。設(shè)計細(xì)菌16s rRNA 基因序列的引物F 27 5' -AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3‘R 1492:5, -TACGGTTACCTTGTTACGACTT-3‘PCR產(chǎn)物長度約1. 5kb，測序后與GenBank數(shù)據(jù)庫中DNA序列進(jìn)行比對，發(fā)現(xiàn)該序列與類芽孢桿菌的16s rRNA基因序列相似性達(dá)98%，因此，將該菌株在分類學(xué)上鑒定為類芽孢桿菌屬。實施例3類芽孢桿菌基因組中植酸酶基因的克隆從Genbank中找到其他類芽孢桿菌關(guān)于植酸酶基因序列，設(shè)計簡并引物，如下phyP F(EcoR I) 5' -GAATTCTTGGTTAAGTTGGAAAACGG-3‘
phyP R(Not I) 5' -GCGGCCGCTCTTGGAGACAACTTTCTTG-3‘下劃線部分為EcoR I (上游引物F)和Not I (下游引物R)識別位點。PCR產(chǎn)物經(jīng)0. 8%瓊脂糖凝膠電泳后，觀察長度約為1. 3kb。運用T4DNA連接酶連接到T-載體上(pGEM-T vector, Promega公司)。經(jīng)過測序，得到序列推導(dǎo)出的氨基酸序列如SEQ ID NO 2所示。實施例4類芽孢桿菌中植酸酶基因的酵母轉(zhuǎn)化及篩選表達(dá)連接T-載體的植酸酶DNA片段經(jīng)過限制性核酸內(nèi)切酶NotI和EcoRI消化，通過濃度為0. 8%的瓊脂糖凝膠電泳純化后，將線性化的植酸酶基因切割下來，使用DNA回收試劑盒(Tiangen)回收線性化的植酸酶DNA ；將載體質(zhì)粒pPIC9K用限制性核酸內(nèi)切酶Not I和EcoR I消化，運用濃度為0. 8%的瓊脂糖凝膠電泳純化后，將線性化的載體片段切割下來，使用DNA回收試劑盒(Tiangen)回收線性化的載體質(zhì)粒片段pPIC9K。用T4 DNA連接酶把兩段純化的DNA片段連接起來，轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109。新構(gòu)建的表達(dá)載體命名為 pPIC9K-phyP (圖2)。之后提取質(zhì)粒，使用限制性核酸內(nèi)切酶DraI將質(zhì)粒線性化。后懸浮于100μ 1電轉(zhuǎn)感受態(tài)畢赤酵母GS115細(xì)胞中，將混懸液轉(zhuǎn)移到0. Icm的電穿孔杯(BioRad) 中，使用Gene Pulser Xcell(BioRad)裝置，1800V、25 μ F和200 Ω進(jìn)行電激。電激后立即加入Iml的lmol/L的山梨醇，隨后涂布與含組氨酸缺陷的MM培養(yǎng)基平板上，30°C培養(yǎng)2天。PCR篩選含有phyP基因的轉(zhuǎn)化子。將活化的pPIC9K-phyP菌液Iml加入到100ml LB培養(yǎng)基中，37°C使菌液濃度達(dá) OD600 = 0. 6-0. 8時進(jìn)行甲醇誘導(dǎo)。30°C搖床(200rpm)用10ml/L的甲醇誘導(dǎo)，每12小時向培養(yǎng)基中添加一次甲醇，共誘導(dǎo)2天。由于植酸酶在酵母菌中的異源表達(dá)能有效地分泌到胞外，因此誘導(dǎo)后的菌液，經(jīng)離心得到上清即是植酸酶的粗酶液。實施例5來自類芽孢桿菌中重組植酸酶的純化將實施例4中得到的粗酶液，用Tris堿將粗酶液的上清pH調(diào)節(jié)到7 9。將上清通過PH 7. 9平衡的Ni-NTA層析柱子，流速控制在15ml/小時左右，收集穿透部分，用于SDS-PAGE分析蛋白質(zhì)的結(jié)合情況。層析用5倍NTA體積的NTA-O Buffer洗，流速控制在 30ml/ 小時左右。分別用 5 倍 NTA 體積的 NTA-20，NTA-40，NTA-60，NTA-80，NTA-100， NTA-200 Buffer洗脫，流速控制在15ml/小時左右，收集洗脫液，每管收集一個NTA體積。 通過SDS-PAGE確定目標(biāo)蛋白在洗脫液中的分布情況。將純化得到的植酸酶蛋白收集，低溫存放。實施例6類芽孢桿菌中異源表達(dá)的植酸酶酶活測定1、測定對象、目的將實施例5得到的純化酶液(取自有重組植酸酶的收集管中)用于測定植酸酶酶活；2、方法酶液上清用緩沖液(50mMTris_HCl，2mM CaC12，10% 甘油，ρΗ7· 0)稀釋 1000 倍后，取0. Iml酶液加入0. 9ml 0. 25mol/L乙酸緩沖液混合，37 V保溫5min，后加入 2ml7. 5mmol/L 植酸鈉溶液(IOOmM Tris-HCl, pH7. 0,0. 2mM CaC12)，37°C保溫 30min。加入2ml顏色終止液終止酶活反應(yīng)，終止液為33%的硝酸溶液100g/L鉬酸銨溶液2.35g/L釩酸銨溶液體積比為2 1 1的混合液。反應(yīng)后的溶液在室溫下靜置10 分鐘；以4000rpm轉(zhuǎn)速離心10分鐘，測定上清液在415nm波長處的吸光值。同時，取 0. Iml純化酶液加入0. 9ml 0. 25mol/L乙酸緩沖液混合，先加入2ml顏色終止液，混勻，后加入 2ml 7. 5mmol/L 植酸鈉溶液(IOOmM Tris-HCl, pH7. 0,0. 2mM CaC12)，37°C保溫 30min 后，以該溶液為空白調(diào)零使用；使用分光光度計測定樣品在415nm波長處的吸光值，計算植酸酶的活性。3、測定結(jié)果該重組植酸酶的活力約為966U/ml。酶活性單位(U)定義為上述條件下，每分鐘釋放Inmol無機(jī)磷所需的酶量為一個酶活性單位。實施例7來自類芽孢桿菌重組植酸酶的最適pH條件測定目的研究類芽孢桿菌中植酸酶的活性對pH的依賴性；方法按照實施例6測定酶活性的方法，分別在pH值為2. 5,3. 5,4. 5,5. 5,6. 5、 7. 5,8. 5,9. 5緩沖液的條件下，測定實施例5得到的植酸酶酶液中植酸酶的活性；結(jié)果類芽孢桿菌重組植酸酶在較廣范圍內(nèi)都有活性，而在中性條件下pH值 6. 5-7. 5之間活性最高(圖1)；
實施例8來自類芽孢桿菌中重組植酸酶PHYP的比活測定方法用實施例5的純化制備物來評估PHYP植酸酶的比活。使用考馬斯亮藍(lán)法測定蛋白質(zhì)的濃度。操作過程取實施例5植酸酶蛋白0. 5ml直接置于50ml容量瓶中，加生理鹽水至刻度，搖勻后，取0. Iml加入考馬斯亮藍(lán)G250試劑5. Oml (考馬斯亮蘭0. 25g，甲醇225ml, 冰醋酸46ml，蒸餾水225ml)，充分振蕩混合，放置5min后，使用分光光度計在595nm波長處測定樣品的吸光值，計算植酸酶蛋白濃度。結(jié)果測定的植酸酶蛋白濃度為0. 87mg/ml。因此計算得出來自類芽孢桿菌的重組植酸酶的比活力約為966 + 0. 87 = 1110U/mg。
權(quán)利要求
1.一種類芽孢桿菌中性植酸酶基因，具有SEQ ID NO :1所示的核苷酸序列。
2.—種由SEQ ID NO :1所編碼的中性植酸酶蛋白，具有SEQ ID NO :2所示的氨基酸序列或其衍生序列。
3.權(quán)利要求2所述的中性植酸酶蛋白，所述衍生序列包括(a)將SEQID NO :2氨基酸序列經(jīng)過一個或多個氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的具有中性植酸酶功能的多肽；(b)將SEQID NO 1所示的核酸的簡明序列所編碼的多肽；(c)在嚴(yán)謹(jǐn)條件下與SEQID NO :1所示核酸分子的互補(bǔ)鏈雜交的核酸所編碼的具有植酸酶活性的多肽；(d)由SEQID NO :1所示核酸分子的等位基因或天然變體所編碼的具有植酸酶活性的多肽；
4.一種中性植酸酶蛋白，其氨基酸序列與SEQ ID NO :2所示序列的同源性達(dá)70%以上。
5.權(quán)利要求2 4中任一所述的中性植酸酶蛋白，其氨基酸序列具有一個或多個突變， 所述突變氨基酸的位置選自SEQ ID N0:2中以下編號的一個或多個1、3、4、5、6、7、8、10、 11、13、15、16、18、19、41、42、67、68、69、70、71、72、80、81、82、83、87、88、89、90、92、93、95、 96、97、98、99、101、103、104、106、107、108、109、110、112、113、114、115、122、123、124、125、 126、127、128、129、130、131、132、136、138、152、153、154、155、156、160、230、231、232、241、 246、247、250、251、268、269、276、277、278、279 或 283。
6.一種重組表達(dá)載體，其特征是含有SEQ ID NO :1所示序列的基因。
7.權(quán)利要求6所述的載體，是pPIC9K-phyP。
8.權(quán)利要求6或7所述的載體，其宿主細(xì)胞為GS115。
全文摘要
本發(fā)明從類芽孢桿菌中得到了一種中性植酸酶基因，具有SEQ ID NO1所示的核苷酸序列。利用該基因可以生產(chǎn)具有較高酶活性的中性植酸酶。
文檔編號C12R1/84GK102286503SQ20111026033
公開日2011年12月21日 申請日期2011年9月5日 優(yōu)先權(quán)日2011年9月5日
發(fā)明者平淑珍, 林敏 , 燕永亮, 趙仲麟, 陸偉 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所