專利名稱：蘋果酸酶突變體及其應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于代謝工程和酶的定向進化領域，具體涉及一種蘋果酸酶突變體及其應用，即利用代謝工程改造的重組大腸桿菌定向進化蘋果酸酶，并將獲得的定向進化蘋果酸酶用于提高大腸桿菌琥珀酸的產(chǎn)量。
背景技術：
蘋果酸酶催化可逆反應丙酮酸+NADH+ CO2 ^蘋果酸+NAD+，
蘋果酸酶在中央代謝途徑的三碳(O)和四碳(C4)化合物的相互轉換過程中扮演著重要的角色，是固定(X)2的C4回補途徑的重要一員。與其它二氧化碳固定C4回補途徑相比，蘋果酸酶催化的反應途徑具有明顯的能量經(jīng)濟性，對研究生命碳循環(huán)、發(fā)展碳負性工業(yè)過程有著重要的意義。微生物的固碳C4回補途徑，主要包括由磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(P印C)、磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶(PepCK)、丙酮酸羧化酶(Pyc)、和蘋果酸酶(Mae)等催化的四條途徑。 蘋果酸酶Mae催化丙酮酸羧化固定(X)2實現(xiàn)C4回補，從磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)開始計算可以凈產(chǎn)生一個ATP，最大限度的回收了能量供細胞使用，因此具有能量經(jīng)濟性。同時，該反應不與大腸桿菌中主要的糖運輸途徑PTS系統(tǒng)競爭PEP (其底物之一是丙酮酸)，因此該反應具有明顯的代謝循環(huán)優(yōu)勢。而其它幾個C4回補酶都有各自的不足磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶催化磷酸烯醇式丙酮酸和HCO3-反應生成草酰乙酸和磷酸，沒有ATP的產(chǎn)生；磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶催化PEP羧化生成草酰乙酸并凈產(chǎn)生一個ATP，但是，該反應依賴于高濃度的PEP，與主要葡萄糖轉運系統(tǒng)PTS系統(tǒng)消耗PEP相矛盾；丙酮酸羧化酶催化丙酮酸羧化生成草酰乙酸，并消耗一個ATP，從PEP開始計算相當于沒有凈能量的產(chǎn)生，且該酶在大腸桿菌等一些微生物中不存在。因此，如何提高發(fā)酵菌中蘋果酸酶Mae的含量或效率就成為研究的一個重要方面。例如，Stols L等利用pTRC99a質(zhì)粒載體在一個大腸桿菌突變株中過表達MaeA，通過色譜柱純化了該酶，并且分別在Mn2+和Mg2+存在下測定了其對丙酮酸和蘋果酸的Km值， 發(fā)現(xiàn)Mn2+是更好的激活金屬離子。ImM的Mn2+存在下，該酶對丙酮酸的Km值為16mM，而對蘋果酸的Km值為0. ^mM(Stols and Donnelly 1997)。Jinxia Wang等也表達純化了大腸桿菌的MaeA，在最適pH7. 2條件下測定了蘋果酸和NAD+的Km值，分別為0. 42mM和0. 097mM, 并且發(fā)現(xiàn)高濃度的底物蘋果酸和NAD+都對脫羧反應酶活具有抑制作用(Wang，Tan et al. 2007)。i^derico P. Bologna等研究大腸桿菌的MaeA時發(fā)現(xiàn)其催化脫羧反應的效率約是羧化反應的30倍，而且發(fā)現(xiàn)脫羧反應的最適pH為7. 5，而羧化反應的最適pH為7. 0，該酶對蘋果酸和丙酮酸的Km值分別為0. 66mM和2. 59mM(Bologna，Andreo et al. 2007)。盡管酶的動力學研究表明在生理條件下蘋果酸酶傾向催化蘋果酸脫羧反應；但羧化反應的標準自由能變化為-2kCal/mol，所以熱力學應該更有利于羧化反應的進行。已有研究表明在生物體內(nèi)蘋果酸酶可以催化丙酮酸羧化反應，參與C4回補途徑。Stols等人報道在丙酮酸甲酸裂解酶和乳酸脫氫酶雙突變的大腸桿菌NZmil菌株中過表達大腸桿菌NAD依賴的蘋果酸酶，解決了原菌株在厭氧條件下丙酮酸過量積累造成的細胞毒性問題。 ^lle等人在丙酮酸羧化酶缺陷的釀酒酵母中過表達大腸桿菌NAD依賴的蘋果酸酶，獲得了更高ATP產(chǎn)量的葡萄糖厭氧發(fā)酵菌株，證實了蘋果酸酶催化的逆反應替代丙酮酸羧化酶發(fā)揮C4回補功能和有助于ATP積累的優(yōu)勢(Zelle，Harrison et al. 2011)?，F(xiàn)有的研究表明大腸桿菌NAD依賴的蘋果酸酶可以發(fā)揮C4回補功能。因此，改造蘋果酸酶的催化性能， 強化蘋果酸酶的表達，將之應用于代謝工程改造微生物，可望構建出具有高效C4回補途徑的工程菌株。發(fā)明目的本發(fā)明的目的在提供一種蘋果酸酶突變體及其應用，即通過進化方法快速并高通量的定向進化蘋果酸酶，增加進化機率并應用于琥珀酸等的生產(chǎn)。本發(fā)明的一個蘋果酸酶突變體，其蛋白序列為SEQ ID NO :1，具體就是69位氨基酸密碼子由原來的ACC變成了 AGC，氨基酸由Thr變成了 kr。本發(fā)明還包括編碼序列為SEQ ID NO 1的蘋果酸酶突變體的基因核苷酸，所述的基因序列的密碼子為大腸桿菌的優(yōu)勢密碼子。本發(fā)明還包括攜帶有編碼序列為SEQ ID NO 1的蘋果酸酶突變體基因的質(zhì)粒，例如 PSLS16。上述的基因，其序列為SEQ ID NO :2。本發(fā)明的另一個蘋果酸酶突變體，其序列為SEQ ID NO :3，具體就是181位氨基酸密碼子由GCC變成了 ACC，氨基酸由Ala變成Thr，其質(zhì)粒命名為pSLS17。本發(fā)明還包括編碼序列為SEQ ID NO :3的蘋果酸酶突變體的基因編碼核苷酸序列，所述的基因序列的密碼子為大腸桿菌的優(yōu)勢密碼子。本發(fā)明還包括攜帶有編碼序列為SEQ ID NO :3的蘋果酸酶突變體基因的質(zhì)粒，例如 PSLS17。上述的基因，其序列為SEQ ID NO :4。上述的質(zhì)粒轉入產(chǎn)琥珀酸的大腸桿菌中，用于提高琥珀酸的產(chǎn)量。本發(fā)明運用代謝進化與隨機突變相結合的定向進化方法篩選出蘋果酸酶突變體， 所篩選出的突變體能有效的提高大腸桿菌琥珀酸的產(chǎn)量，具有較好的經(jīng)濟應用前景。


圖1大腸桿菌C4回補進化體系的構建圖。圖2本發(fā)明的蘋果酸酶突變體質(zhì)粒構建和篩選過程示意圖。
具體實施例方式本發(fā)明實施例中涉及到的培養(yǎng)基配方如下LBi音養(yǎng)基(IL) :10g tryptone,5g yeast extract, 5g NaCl0NBS培養(yǎng)基配方如下
權利要求
1.一種蘋果酸酶突變體，其蛋白序列為SEQ ID NO :1或SEQ ID NO :3。
2.一種核苷酸，其特征在于，該核苷酸用于編碼權利要求1所述的蘋果酸酶突變體。
3.一種用于表達權利要求1所述的蘋果酸酶突變體的質(zhì)粒，其特征在于該質(zhì)粒攜帶有權利要求2所述的核苷酸。
4.如權利要求3所述的質(zhì)粒，其特征在于該質(zhì)粒所攜帶核苷酸的序列為SEQIDNO :2。
5.如權利要求3所述的質(zhì)粒，其特征在于該質(zhì)粒所攜帶核苷酸的序列為SEQIDNO :4。
6.一種提高菌株產(chǎn)琥珀酸量的方法，其特征在于是在產(chǎn)琥珀酸的菌株中表達權利要求 1所述的蘋果酸酶突變體。
7.如權利要求6所述的方法，其特征在于所述的表達蘋果酸酶突變體是將權利要求3 所述的質(zhì)粒轉入菌株中。
8.如權利要求7所述的方法，其特征在于所述的菌株其保藏編號為CGMCCN0.5108。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種蘋果酸酶突變體及其應用，即通過進化方法快速定向進化蘋果酸酶，增加了進化機率并能夠有效應用于琥珀酸等的生產(chǎn)。本發(fā)明篩選出的蘋果酸酶突變體，其蛋白序列為SEQ ID NO1或SEQ ID NO3。所篩選出的酶突變體能有效的提高產(chǎn)琥珀酸的大腸桿菌中琥珀酸的產(chǎn)量，具有很好的經(jīng)濟應用前景。
文檔編號C12R1/19GK102311943SQ20111026479
公開日2012年1月11日 申請日期2011年9月7日 優(yōu)先權日2011年9月7日
發(fā)明者劉嬌, 孫際賓, 鄭平 申請人:天津工業(yè)生物技術研究所