蘋果酸酶(nadp-me)基因及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了蘋果酸酶(NADP-ME)基因及其應(yīng)用，本發(fā)明提供的新型NADP-ME基因可在小麥中穩(wěn)定表達(dá)與遺傳，光合效率較受體材料明顯提高，為利用C4型高光效基因改良C3作物的光合效能，選育產(chǎn)量水平大幅度提高的高光效轉(zhuǎn)基因小麥品種提供了重要的基因來源和親本材料支撐。
【專利說明】蘋果酸酶(NADP-ME)基因及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體的涉及一種蘋果酸酶(NADP-ME)基因及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]小麥?zhǔn)俏覈饕募Z食作物，其生產(chǎn)能力及供需狀況始終關(guān)系到我國國民經(jīng)濟(jì)發(fā)展和糧食安全等重 大戰(zhàn)略問題。從世界范圍來看，世界糧食生產(chǎn)狀況始終與各國政治、經(jīng)濟(jì)發(fā)展?fàn)顩r緊密聯(lián)系，糧食生產(chǎn)量和儲備量一有下降，國際糧價就大幅攀升，恐慌情緒就大勢蔓延，對各國的政治經(jīng)濟(jì)形勢造成重大影響；從國內(nèi)來看，隨著我國人口的增長，工業(yè)化和城鎮(zhèn)化的快速發(fā)展，對糧食的需求將持續(xù)加大。同時，由于我國糧食作物種植面積不可能大幅度恢復(fù)增長，因此要保障我國糧食安全，唯一的出路是持續(xù)提高單產(chǎn)，這就要求在小麥、水稻等主要糧食作物的產(chǎn)量性狀遺傳改良方面獲得跨越性的進(jìn)展。
[0003]光合作用是一切綠色植物物質(zhì)生產(chǎn)的基礎(chǔ)，據(jù)估計(jì)，植物地上部干物質(zhì)的90%來自于光合作用。因此，提高作物產(chǎn)量的關(guān)鍵是提高光能利用效率，從而提高單位面積的產(chǎn)量。而要大幅度提高光能利用率和實(shí)現(xiàn)超高產(chǎn)，必須采取合理株型(外在光合效率)和高光效(內(nèi)在光合效率)相結(jié)合的技術(shù)路線。目前小麥、水稻等農(nóng)作物單產(chǎn)水平的提高，主要是由于品種產(chǎn)量潛力遺傳改良和生產(chǎn)條件改善的結(jié)果，而產(chǎn)量潛力的遺傳改良主要是通過形態(tài)性狀的改良和雜種優(yōu)勢等途徑來實(shí)現(xiàn)的，在現(xiàn)有小麥、水稻等農(nóng)作物品種產(chǎn)量水平已相對較高，且都已具有良好的形態(tài)結(jié)構(gòu)，葉面積指數(shù)和收獲系數(shù)都已接近極限的情況下，再單純依靠上述途徑已很難實(shí)現(xiàn)產(chǎn)量潛力的跨越式提高。在此背景下，國內(nèi)外許多學(xué)者把目光紛紛投向光能利用效率的遺傳改良研究，希望通過提高光合效率來實(shí)現(xiàn)生物學(xué)產(chǎn)量的大幅度提高，進(jìn)而獲得產(chǎn)量潛力改良的突破性進(jìn)展。
[0004]根據(jù)光合作用途徑的不同，植物可分為C3型，C4型和CAM(景天酸)型。C4和CAM植物是在逆境下經(jīng)過長期馴化，從C3植物進(jìn)化而來的。與小麥、水稻、大豆等C3植物相比，玉米、高粱、甘蔗等C4植物具有CO2濃縮機(jī)制，光補(bǔ)償點(diǎn)高，CO2補(bǔ)償點(diǎn)低，光呼吸弱，特別在高溫、干旱等逆境條件下具有明顯的光合優(yōu)勢。由于C4植物具有高光合、高水分、高氮素利用效率以及高生物學(xué)產(chǎn)量，因此將C4途徑引入C3植物以提高其光合效率和籽粒產(chǎn)量，一直是國內(nèi)外生物學(xué)研究領(lǐng)域的重大科學(xué)命題。以前此方面的研究主要途徑是同室篩選、細(xì)胞融合和遠(yuǎn)緣雜交等方法，但一直未獲得突破性進(jìn)展。近年來日趨成熟的轉(zhuǎn)基因技術(shù)由于可以打破物種間的生殖隔離，實(shí)現(xiàn)基因在不同物種中的交流，因此已成為解決農(nóng)作物重要性狀遺傳改良瓶頸問題的主要技術(shù)途徑。
[0005]目前將C4途徑關(guān)鍵酶基因已有一些報道，但C4途徑高光效關(guān)鍵基因?qū)隒3作物后，其作用機(jī)理一直尚未明確。因此，以導(dǎo)入C4型高光效基因的C3作物為研究材料，深入研究〇4聞光效基因的導(dǎo)入對受:體材料相關(guān)代謝途徑廣生的影響，揭不C4途徑關(guān)鍵基因在C3作物中的作用機(jī)理，可為利用C4途徑關(guān)鍵基因改良C3作物的光合效能與產(chǎn)量潛力提供堅(jiān)實(shí)的
理論基礎(chǔ)。[0006]葉綠體內(nèi)的NADP-蘋果酸酶是C4型光合途徑中的關(guān)鍵酶之一，它存在于維管束鞘細(xì)胞的葉綠體中。目前，在玉米、高粱、黃花菊屬、擬南芥等多種植物中已克隆分離了 C4型nadp-me的cDNA均已被克隆。玉米nadp-me的cDNA全長2184bp,編碼636個氨基酸殘基，前體蛋白分子量為69.8KD,除去轉(zhuǎn)運(yùn)肽后，成熟蛋白分子量為60或63KD，翻譯起始點(diǎn)在轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)的下游115bp處。高粱中克隆出的nadp-me基因的cDNA全長2139bp，含有1911bp的開放閱讀框，編碼636個氨基酸和一個終止密碼子，其N末端含有一段轉(zhuǎn)運(yùn)肽序列，負(fù)責(zé)將ME的蛋白前體轉(zhuǎn)運(yùn)至葉綠體內(nèi)部，剪接生成成熟蛋白。 [0007]在C4型nadp-me基因的基因工程研究方面，Honda等(2000)將CAM植物A 1earborescens的nadp-me基因轉(zhuǎn)入水稻中，在轉(zhuǎn)基因水稻植株中檢測到有生物活性的NADP-ME。1991年Ku等研究指出，NADP-ME活性與光呼吸活性呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。兩個日本研究小組分別獨(dú)立地將水稻Cab啟動子與玉米C4型nadp-me基因全長cDNA構(gòu)成的融合基因轉(zhuǎn)入水稻。免疫電鏡研究顯示，超量表達(dá)的NADP-ME定位于葉綠體中，且轉(zhuǎn)基因植株的葉綠體無基粒，類似C4植物維管束鞘細(xì)胞的葉綠體，因而葉綠體內(nèi)NADP-ME的高活性可能是影響葉綠體發(fā)育的重要因素。
[0008]nadp-me基因的活性與光呼吸的速率呈負(fù)相關(guān)，將nadp-me基因轉(zhuǎn)入C3植物，應(yīng)該是降低C3植物的光呼吸，提高其光合效率的一個有效途徑。但是目前研究工作表明，NADE-ME活性的提高對提高植物的光合效率似乎沒有多大作用，有些研究報道還指出它的表達(dá)與光合效率呈負(fù)相關(guān)。Chi等(2004)將高粱的nadp-me轉(zhuǎn)入水稻，轉(zhuǎn)基因植物中酶的活性提高了 1-7倍，丙酮酸上升20%，蘋果酸降低30%，但Rubisco，PPDK，NADP-MDH和PEPC活性均沒有明顯變化，光合作用也沒有提高。Takeuchi等(2000)將玉米的nadp-me轉(zhuǎn)入水稻，在轉(zhuǎn)基因植物的葉片中NADP-ME酶活增加了 20-70倍，但轉(zhuǎn)基因植物的葉綠體生長畸形，沒有類囊體膜垛疊在一起而構(gòu)成的基粒。而且，葉綠素的含量和光系統(tǒng)的活性與NADP-ME的含量成反比。因此，克隆新的，具有良好功能的C4型nadp-me基因?qū)τ诟牧糃3植物的光合效能具有重要意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009]本發(fā)明的目的是提供一種蘋果酸酶(NADP-ME)基因，在本發(fā)明的另一方面，還涉及一種能夠提高小麥光合作用的蘋果酸酶(NADP-ME)基因。為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，擬采用如下技術(shù)方案:
[0010]本發(fā)明一方面涉及一種蘋果酸酶(NADP-ME)基因，其特征在于所述的基因的核苷酸序列為SEQ ID N0.1，或者與SEQ ID N0.1具有95%以上同源性的基因序列。
[0011]本發(fā)明另一方面還涉及一種蘋果酸酶(NADP-ME)，所述的蘋果酸酶(NADP-ME)的氨基酸序列為SEQ ID N0.1核苷酸序列所對應(yīng)的氨基酸序列。
[0012]本發(fā)明另一方面還涉及一種載體，所述的載體含有上述蘋果酸酶(NADP-ME)基因核苷酸序列。
[0013]在本發(fā)明的另一方面，本發(fā)明還涉及上述蘋果酸酶(NADP-ME)基因、蘋果酸酶(NADP-ME)或者載體在提高小麥光合作用中的應(yīng)用。
[0014]在本發(fā)明的一個優(yōu)選實(shí)施方式中，所述的載體通過基因槍介導(dǎo)法、農(nóng)桿菌介導(dǎo)法或花粉管通道法導(dǎo)入小麥中。[0015]本發(fā)明提供的新型nadp-me基因可在小麥中穩(wěn)定表達(dá)與遺傳,光合效率較受體材料明顯提高，為利用C4型高光效基因改良C3作物的光合效能，選育產(chǎn)量水平大幅度提高的高光效轉(zhuǎn)基因小麥品種提供了重要的基因來源和親本材料支撐。
【專利附圖】

【附圖說明】 [0016]圖1a-1d:轉(zhuǎn)基因小麥與對照在不同生育時期的凈光合速率日變化。
【具體實(shí)施方式】
[0017]實(shí)施例1
[0018]1、高光效nadp-me基因表達(dá)載體的構(gòu)建
[0019]本發(fā)明所涉及的玉米自交系材料由河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院糧食作物研究所提供或者采用河南當(dāng)?shù)仄毡椴捎玫挠衩鬃越幌挡牧?。?shí)驗(yàn)用RNA提取試劑盒、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒均購自天為時代公司，MLV反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自Promega公司，LA-TaqDNA聚合酶、PMD-19T克隆載體、大腸桿菌(Escherichia coli)菌株DH5 α感受態(tài)細(xì)胞制備試劑盒均為TaKaRa公司產(chǎn)品，植物表達(dá)載體pC0MBIA3301為本實(shí)驗(yàn)室保存，限制性內(nèi)切酶為MBI公司產(chǎn)品，氨芐青霉素為Amersco公司產(chǎn)品，其余試劑為進(jìn)口或國產(chǎn)分析純。
[0020]根據(jù)已報道的玉米nadp-me基因cDNA序列(GenBank登錄號:ΝΜ_001111843.I),運(yùn)用Primer5.0軟件設(shè)計(jì)一對特異性引物:
[0021 ] PMl: 5’ -GTCCATGGTCCGAAGAGGGAGGAGGACGAC-3，，含有 NcoI 酶切位點(diǎn)，PM2:5’ -AAC
酶切位點(diǎn)；引物由上海Sangon公司合成。
[0022]玉米總RNA提取及cDNA合成參照Promega公司RNA提取試劑盒和MLV反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行。以玉米總cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體系:10_50ng / ul基因組模板；10μΜ 的 Pl 和 P2 各 0.5μ I ;2.5μ IlOXReaction Buffer ；4μ I dNTP mix(2.5mM)；0.5μ I LA-Taq酶，加水至25 μ I。 反應(yīng)程序:94°C預(yù)變性3min ;94°C變性45s，68。。復(fù)性30s，72°C延伸2.5min，30個循環(huán)；然后72°C延伸lOmin。PCR產(chǎn)物用0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測，用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒回收2kbp目的片段，通過T / A克隆法連接到pMD19-T載體上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α，涂平板過夜培養(yǎng)，挑取陽性克隆委托北京博尚生物公司測序，驗(yàn)證為正確的克隆命名為pMD19-me。將pMD19_me和雙元表達(dá)載體pC0MBIA3301分別用NcoI和Pml I雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳檢測，切膠回收2kb目的條帶和表達(dá)載體片段，16°C連接過夜，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α，經(jīng)PCR和雙酶切鑒定為正確的克隆命名為p3301-me。
[0023]以小麥品種周麥23的幼胚為受體材料。取開花后12 — 14d的穗中部、大小一致的未成熟種子，用70%的酒精表面消毒lmin，無菌水沖洗3次后用0.1 %的HgCl2消毒IOmin,無菌水沖洗3—4次。無菌條件下剝出幼胚(Imm左右)，于MS誘導(dǎo)培養(yǎng)基(MS+2mg /L2，4-D+0.4%瓊脂+3%蔗糖，pH6.2)上暗培養(yǎng)4_5d后，置于高滲培養(yǎng)基(MS+2mg /L2, 4-D+0.7%瓊脂+甘露醇+3%蔗糖，pH5.8)上滲透處理4_6h，利用含有p3301-me載體的基因槍金粉微粒轟擊后在高滲培養(yǎng)基上繼續(xù)處理16h，轉(zhuǎn)至愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基。培養(yǎng)2周后轉(zhuǎn)至草丁膦抗性篩選再生培養(yǎng)基(I / 2MS+0.5mg / L NAA+2.0mg / L ΚΤ+0.4%瓊脂+3%蔗糖+4% ΡΡΤ, pH6.2)，連續(xù)篩選2代，每代2周，經(jīng)過篩選的抗性苗轉(zhuǎn)至生根培養(yǎng)基(I /2MS+0.2mg / L ΝΑΑ+0.4%瓊脂+3%蔗糖，pH6.5)中，至再生苗根系較健壯時，即可進(jìn)行煉苗1-2天。生根、壯苗后移入花盆中，最后洗去根系攜帶的培養(yǎng)基殘?jiān)憧梢圃匀肱枥?，獲得再生植株125株。
[0024]提取所有再生植株的基因組DNA,根據(jù)已克隆的nadp-me基因序列利用 Primer5.0 軟件設(shè)計(jì)了一對特異性引物 P3 (ATGGTCTTGTTGCCCTCGCTCTT)和P4 (GATTGTCGTTTCCCGCCTTCAGT)，利用該引物對再生植株進(jìn)行PCR檢測，以鑒定陽性植株。PCR 程序:10-50ng / ul 基因組模板；10μΜ 的 Ρ3 和 Ρ4 各 0.5 μ l ；2.5 μ llOXReactionBuffer ；4μl dNTP mix (2.5mM) ；0.5μ I Taq 酶，加水至 25 μ l。PCR 反應(yīng)條件為:94°C 預(yù)變性3分鐘；94°C 45秒，57°C 45秒，72°C 50秒，35個循環(huán)；72°C延伸10分鐘，PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。有78株可以擴(kuò)增出521bp的目的條帶，鑒定為陽性植株。
[0025]對來自于TO代陽性植株的Tl代所有植株進(jìn)行PCR檢測，利用英國HANSATECH公司生產(chǎn)的CIRAS-1型便攜式光合儀，在晴朗少云的天氣測定小麥抽穗期(4月23日)、開花期(5月4日)、花后第7天(5月12日)和花后第15天(5月19日)的氣體交換參數(shù)的日變化。光合日變化測定時間為 6:00,7:00,8:00,9:00U0:00U1:00,12:00、13:00、14:00、15:00,16:00,17:00、18:00每個時間持續(xù)40_45min，重復(fù)測定3次，往返測量，減少因太陽輻射的變化產(chǎn)生的影響。測定結(jié)果(參見附圖1a-1d)表明，轉(zhuǎn)nadp-me基因植株凈光合速率明顯高于對照周麥23，說明nadp-me基因在轉(zhuǎn)基因小麥中能夠正常表達(dá)和行使功能，對于小麥光合特性具有明顯的提升作用。本發(fā)明獲得了凈光合速率明顯提高的轉(zhuǎn)基因植株，為高光效轉(zhuǎn)基因小麥育種研究提供了材料支撐。
[0026]以上所述是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例，應(yīng)當(dāng)指出，對于本【技術(shù)領(lǐng)域】的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明所述原理的前提下，還可以作出若干改進(jìn)和潤飾，這些改進(jìn)和潤飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。
【權(quán)利要求】
1.一種蘋果酸酶(NADP-ME)基因，其特征在于所述的基因的核苷酸序列為SEQ IDN0.1，或者與SEQ ID N0.1具有95%以上同源性的基因序列。
2.一種蘋果酸酶(NADP-ME)，所述的蘋果酸酶(NADP-ME)的氨基酸序列為SEQ ID N0.1核苷酸序列所對應(yīng)的氨基酸序列。
3.一種載體，所述的載體含有權(quán)利要求1所述的蘋果酸酶(NADP-ME)基因核苷酸序列。
4.上述蘋果酸酶(NADP-ME)基因、蘋果酸酶(NADP-ME)或者載體在提高小麥光合作用中的應(yīng)用。
5.所述 的載體通過基因槍介導(dǎo)法、農(nóng)桿菌介導(dǎo)法或花粉管通道法導(dǎo)入小麥中。
【文檔編號】C12N9/04GK103614396SQ201310573920
【公開日】2014年3月5日 申請日期:2013年11月18日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月18日
【發(fā)明者】許為鋼, 王玉民, 張磊, 王會偉, 李艷, 胡琳, 齊學(xué)禮, 董海濱 申請人:河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院小麥研究所