專利名稱：真核表達(dá)并純化人源化抗血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子單克隆重組抗體(Anti-VEGF)的簡(jiǎn)便化工業(yè)技術(shù)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及真核表達(dá)并純化人源化抗血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子單克隆重組抗體 (Anti-VEGF)的簡(jiǎn)便化方法。
背景技術(shù)：
血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)是以二硫鍵連接的二聚體糖蛋白，分子量為35 40kDa。VEGF是一個(gè)細(xì)胞因子家族，包括VEGF-A、-B、-C、-D、-E和胎盤生長(zhǎng)因子等多個(gè)成員。 VEGF-A基因的選擇性剪切可以產(chǎn)生至少5種蛋白形式，包括分泌型可溶性蛋白VEGF121、 VEGF145、VEGF165。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子通過(guò)特異性與3個(gè)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體結(jié)合，啟動(dòng)下游細(xì)胞信號(hào)級(jí)聯(lián)，刺激內(nèi)皮細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞遷移，并抑制細(xì)胞凋亡。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子主要表達(dá)于血管內(nèi)皮細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞、某些炎癥細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子的表達(dá)水平和腫瘤內(nèi)的血管生成情況和腫瘤的轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)。因此，抑制血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)可以抑制多種腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。如今，隨著基因工程技術(shù)的發(fā)展，抗VEGF抗體已經(jīng)可以由多種方式獲得。目前市面上多為多克隆抗體或單克隆抗體，鮮見(jiàn)重組抗體。傳統(tǒng)的抗VEGF抗體制劑生產(chǎn)的純化步驟繁瑣，純度也較低，使得其經(jīng)濟(jì)意義大為降低。本發(fā)明通過(guò)基因工程技術(shù)，獲得了人源化抗血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子單克隆重組抗體。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于實(shí)現(xiàn)人源化抗血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子單克隆重組抗體在真核細(xì)胞中的大量表達(dá)，并通過(guò)簡(jiǎn)化的純化步驟，獲得純度較高抗體。在工業(yè)生產(chǎn)中滿足生產(chǎn)周期短，生產(chǎn)成本低，產(chǎn)量高的總體要求。本發(fā)明通過(guò)體外人工合成雙鏈DNA分子的技術(shù)，分別合成人源化抗血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子單克隆抗體重鏈和輕鏈的編碼基因，通過(guò)EcoRI和XhoI限制性酶切位點(diǎn)與表達(dá)載體 ρ⑶NA3. 1連接。隨后將質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞系獲得高效表達(dá)。


圖1是轉(zhuǎn)染后人源化抗血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子單克隆抗體表達(dá)SDS-PAGE電泳分析結(jié)果圖(M為marker ;1.轉(zhuǎn)染空載體的陰性對(duì)照；2.轉(zhuǎn)染48小時(shí)后2ml培養(yǎng)基抗體表達(dá)情況 (還原條件下)；3.轉(zhuǎn)染96小時(shí)后2ml培養(yǎng)基抗體表達(dá)情況(還原條件下))。圖2是Anti-VEGF SDS-PAGE分析純化純度結(jié)果圖。(A非還原條件，B還原條件)。
具體實(shí)施例方式1、人源化抗血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子單克隆重組抗體的真核表達(dá)編碼人源化抗血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子單克隆重組抗體重鏈和輕鏈的編碼基因通過(guò)EcoRI和XhoI限制性酶切位點(diǎn)與表達(dá)載體ρ⑶NA3. 1連接。隨后將質(zhì)粒轉(zhuǎn)染CHO-Kl細(xì)胞系。轉(zhuǎn)染前48小時(shí)，將IOml活力大于95%、細(xì)胞密度為1. 5*105/ml的CHO-Kl細(xì)胞用含DMEM完全培養(yǎng)基(無(wú)抗，含10%胎牛血清)平鋪于IOcm細(xì)胞培養(yǎng)皿，在37°C，5% C02 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞匯合度達(dá)到70-80%時(shí)，開(kāi)始轉(zhuǎn)染。將含抗血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子單克隆抗體重鏈和輕鏈基因的表達(dá)載體各1 μ g，加入到200μ 1 37°C預(yù)熱的PBS中，混勻后加入 4yllmg/ml PEI (聚乙烯亞胺)，立即震蕩混勻，在室溫下放置15分鐘。將質(zhì)粒-PEI混合液加入到細(xì)胞培養(yǎng)液中，輕輕混勻后在37°C，5% C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。6小時(shí)后，吸棄細(xì)胞培養(yǎng)液，并用37°C預(yù)熱的PBS洗細(xì)胞3次去除殘留的血清之后；加入IOml無(wú)血清培養(yǎng)基，同時(shí)加入終濃度分為2mM和ImM的谷氨酰胺(L-Glutamine)和丙酮酸鈉繼續(xù)培養(yǎng)。分別于48 小時(shí)和96小時(shí)收集細(xì)胞上清。人源化抗血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子單克隆抗體表達(dá)SDS-PAGE電泳分析結(jié)果見(jiàn)附圖1。2、Protein A親和層析純化抗體將共計(jì)10個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)皿收集所得上清200ml ； lOOOOrpm，4°C離心IOmin去除細(xì)胞等沉淀物，并用等體積PBS稀釋1倍。將0. 5ml ProteinA純化樹(shù)脂用5ml PBS平衡后，將細(xì)胞培養(yǎng)上清以流速0. 5ml/min上柱。5ml PBS洗滌去除非特異結(jié)合蛋白后，用IOOmM pH3. 0 甘氨酸溶液洗脫蛋白。用IM Tris-HCl pH9. 0將蛋白洗脫液pH調(diào)至中性，之后在PBS透析至少4小時(shí)。用PEG20000濃縮至濃度為lmg/ml，經(jīng)液氮冷激后于-80°C冰箱保存。最終獲得蛋白的量為0. Smg0SDS-PAGE驗(yàn)證獲得的是高純度的蛋白，蛋白純度> 95%見(jiàn)附圖2。
權(quán)利要求
1.一種采用真核表達(dá)并純化人源化抗血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子單克隆重組抗體 (Anti-VEGF)的簡(jiǎn)便化方法，其特征在于該方法通過(guò)如下步驟用真核表達(dá)并純化人源化抗血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子單克隆重組抗體(Anti-VEGF)人源化抗血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子單克隆重組抗體的真核表達(dá)，Protein A親和層析純化抗體。
2.如權(quán)利要求1所述的采用真核表達(dá)并純化人源化抗血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子單克隆重組抗體(Anti-VEGF)，特征在于所述的Anti-VEGF是通過(guò)真核表達(dá)并純化的。
3.如權(quán)利要求1所述的采用真核表達(dá)并純化人源化抗血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子單克隆重組抗體(Anti-VEGF)，特征在于所述的Anti-VEGF的表達(dá)為分泌性的可溶性蛋白。
4.如權(quán)利要求1所述的采用真核表達(dá)并純化人源化抗血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子單克隆重組抗體(Anti-VEGF)，特征在于所述的Anti-VEGF作為生物制劑應(yīng)用于研究和臨床診斷。
全文摘要
本發(fā)明涉及真核表達(dá)并純化人源化抗血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子單克隆重組抗體(Anti-VEGF)的簡(jiǎn)便化方法。本發(fā)明的目的在于實(shí)現(xiàn)人源化抗血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子單克隆重組抗體在真核細(xì)胞中的大量表達(dá)，并通過(guò)簡(jiǎn)化的純化步驟，獲得純度較高抗體。在工業(yè)生產(chǎn)中滿足生產(chǎn)周期短，生產(chǎn)成本低，產(chǎn)量高的總體要求。
文檔編號(hào)C12N15/13GK102344926SQ201110274419
公開(kāi)日2012年2月8日 申請(qǐng)日期2011年9月16日 優(yōu)先權(quán)日2011年9月16日
發(fā)明者朱月珍, 楊宣武, 柴笑梅, 江永海 申請(qǐng)人:江蘇普羅賽生物技術(shù)有限公司