專利名稱：空腸彎曲桿菌pcr檢測試劑盒及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域中細(xì)菌的分子生物學(xué)檢測試劑盒，特別是涉及空腸彎曲桿菌PCR檢測試劑盒及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
空腸彎曲桿菌(Campylobacter jejuni)是彎曲桿菌屬的一種，是近十幾年來受到國內(nèi)外廣泛重視的人畜共患病原菌，主要可引起人體急性腸炎和食物中毒，并伴發(fā)反應(yīng)性關(guān)節(jié)炎、肝炎、瑞特氏病和格林-巴利綜合癥等免疫性損傷性疾病。在獸醫(yī)學(xué)上，可引起家畜流產(chǎn)不孕、乳房炎及幼畜禽腹瀉和家禽肝炎。該菌通過動物帶菌者或患病者的糞便進(jìn)入環(huán)境中，在水環(huán)境中可以進(jìn)入一種稱為“活的非可培養(yǎng)”(viable but nonculturerable， VBNC)狀態(tài)的休眠期，處于VBNC狀態(tài)的細(xì)菌在特定條件下可以復(fù)蘇且具有致病性 (Vanniasinkam等，1999)。接觸畜禽類，或食入受到污染的禽制品、水源和牛奶是該菌感染人體的主要途徑。流行病學(xué)調(diào)查表明，該菌作為腸炎的病因僅次于沙門氏菌和志賀氏菌，在很多地區(qū)甚至有超過沙門氏菌而居首位的趨勢(Sahin等，2003)。建立空腸彎曲桿菌快速、 特異性的分離和檢測方法，是有效控制和預(yù)防該類食源性傳染病的關(guān)鍵所在?？漳c彎曲桿菌為微需氧菌，培養(yǎng)條件苛刻，在25°C不生長，42°C生長良好，容易進(jìn)入VBNC狀態(tài)。這些特點(diǎn)使得常規(guī)的分離培養(yǎng)和生化鑒定空腸彎曲桿菌耗時費(fèi)力、靈敏度不高，無法充分滿足臨床檢驗(yàn)的要求，當(dāng)出現(xiàn)爆發(fā)疫情時，更無法滿足快速診斷的需要。而已有的空腸彎曲桿菌分子生物學(xué)檢測方法多使用環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增技術(shù)或?qū)崟r熒光定量PCR技術(shù)(CN1598544A、 CN101886120A、CN101886133A等)，或多或少也存在設(shè)備復(fù)雜、操作步驟多的問題。因此提供一種快速、簡單、可靠的能定性檢測空腸彎曲桿菌試劑盒仍然十分必要。

發(fā)明內(nèi)容
針對背景技術(shù)中列舉的問題，本發(fā)明一方面提供了一種檢測空腸彎曲桿菌的試劑盒，其包括一對針對空腸彎曲桿菌馬尿酸酶(HipO)基因的保守區(qū)域設(shè)計的特異性引物上游引物 Hl 5，-ctgaacttgccgattcggata-3，(SEQ ID NO :1)下游引物 H2 5，-aggcaattcccgactggaca-3，(SEQ ID NO :2)進(jìn)一步的，本發(fā)明的試劑盒還包括10XPCR緩沖液、2. 5mmol/L的dNTP、2. 5U/μ L 的Taq酶、25mmol/L的Mg2+等PCR反應(yīng)中常用的試劑。另一方面，本發(fā)明還提供了本發(fā)明的試劑盒在檢測臨床樣本里存在的空腸彎曲桿菌中的應(yīng)用。本發(fā)明試劑盒的使用步驟為跟據(jù)需要直接檢測樣品或?qū)悠肥褂肂olton培養(yǎng)基增菌，然后使用DNA提取試劑盒提取待測樣品DNA，制備樣品DNA模板。使用本發(fā)明提供的試劑盒構(gòu)建PCR擴(kuò)增體系，PCR擴(kuò)增體系(25 μ L)為10XPCR 緩沖液 2. 5μ L、2. 5mmol/L 的 dNTPl. 0μ L、2. 5υ/μ L 的 Taq 酶 0. 4μ L、25mmol/L 的Mg2+2. 0 μ L、l. 5 μ M的引物對1. 0 μ L、樣品DNA模板溶液2 μ L、無菌水16. 1 μ L。PCR循環(huán)參數(shù)為94°C預(yù)變性5分鐘；隨后35個循環(huán)，每個循環(huán)程序?yàn)?4°C變性 30秒、65°C退火30秒、72°C延伸30秒；循環(huán)結(jié)束后72°C延伸10分鐘，最后降溫至12°C，結(jié)束PCR程序。進(jìn)行電泳并使用凝膠成像儀觀察結(jié)果，如果能擴(kuò)增出276bp左右的片段，則表明樣品中含有空腸彎曲桿菌。


附圖顯示了使用本發(fā)明公開的方法和試劑盒檢測空腸彎曲桿菌ATCC33560(泳道 1)、空腸彎曲桿菌ATCC29428 (泳道2)、埃希氏大腸桿菌ATCC8739 (泳道3)、結(jié)腸彎曲桿菌 ATCC43478 (泳道4)、福氏志賀菌ATCC12022 (泳道5)、無菌超純水(泳道6)的結(jié)果。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1檢測空腸彎曲桿菌的引物設(shè)計參照GeneBank收錄的空腸彎曲桿菌基因組序列，將其和與之基因組結(jié)構(gòu)相似結(jié)腸彎曲桿菌序列比對，選擇馬尿酸酶(HipO)基因的保守區(qū)域，使用軟件Primer Premier設(shè)計一對引物，序列如下上游引物 Hl 5，-ctgaacttgccgattcggata-3，(SEQ ID NO :1)下游引物 H2 5，-aggcaattcccgactggaca-3，(SEQ ID NO :2)。實(shí)施例2空腸彎曲桿菌PCR檢測方法的建立使用本領(lǐng)域常規(guī)方法合成實(shí)施例1中設(shè)計的探針H1、H2。根據(jù)需要直接檢測樣品或?qū)悠肥褂肂olton培養(yǎng)基增菌，然后使用DNA提取試劑盒提取待測樣品DNA，制備樣品DNA模板。PCR 擴(kuò)增體系(25 μ L)為10 X PCR 緩沖液 2. 5 μ L、2. 5mmol/L 的 dNTPl. 0 μ L、 2. 5U/ μ L 的 Taq 酶 0. 4 μ L、25mmol/L 的 Mg2+2. 0 μ L、1· 5 μ M 的引物對 1. 0 μ L、樣品 DNA 模板溶液2 μ L、無菌水16. 1 μ L0PCR循環(huán)參數(shù)為94°C預(yù)變性5分鐘；隨后35個循環(huán)，每個循環(huán)程序?yàn)?4°C變性 30秒、65°C退火30秒、72°C延伸30秒；循環(huán)結(jié)束后72°C延伸10分鐘，最后降溫至12°C，結(jié)束PCR程序。電泳并使用凝膠成像儀觀察結(jié)果，如果能擴(kuò)增出276bp左右的片段，則表明樣品中含有空腸彎曲桿菌。實(shí)施例3空腸彎曲桿菌PCR檢測試劑盒的特異性提取空腸彎曲桿菌ATCC33560、空腸彎曲桿菌ATCC29428、埃希氏大腸桿菌 ATCC8739、結(jié)腸彎曲桿菌ATCC43478、福氏志賀菌ATCC12022 (上述菌種均購買自美國標(biāo)準(zhǔn)菌種收藏所ATCC)的DNA作為模板，按照實(shí)施例2中的PCR檢測方法檢測，以驗(yàn)證該檢測方法的特異性。檢測結(jié)果如說明書附圖所示，僅空腸彎曲桿菌ATCC33560(泳道1)、空腸彎曲桿菌ATCC29428(泳道2)擴(kuò)增出預(yù)期大小的片段(276bp)，幾種近似的菌株埃希氏大腸桿菌ATCC8739、結(jié)腸彎曲桿菌ATCC43478、福氏志賀菌ATCC12022和無菌超純水(泳道6)均未擴(kuò)增出任何片段，說明本發(fā)明提供的檢測方法具備良好的特異性。
實(shí)施例4空腸彎曲桿菌PCR檢測方法的靈敏度將空腸彎曲桿菌ATCC33560加入Bolton培養(yǎng)基中增菌48小時。使用增菌液制備濃度為 18. 7ng、1. 87ng、187pg、18. 7pg、1. 87pg、187fg、18. 7fg、1. 87fg 的 DNA 模板，按照實(shí)施例2的檢測方法分別對這些模板進(jìn)行檢測。結(jié)果18. 7ng、l. 87ng、187pg、18. 7pg、l. 87pg、 187fg的模板均能擴(kuò)增出276bp的清晰條帶，而18. 7fg、l. 87fg的模板則未能擴(kuò)增出可以清楚辨別的條帶(靈敏度試驗(yàn)的電泳圖未顯示)。試驗(yàn)證明本發(fā)明的試劑盒檢測靈敏度可達(dá) 187fg/DNA模板以上，基本可以滿足臨床檢測的需要。從上述實(shí)施例可以看出，相比現(xiàn)有的分子生物學(xué)檢測方法，本發(fā)明提供的空腸彎曲桿菌PCR檢測試劑盒成分簡單、檢測操作方便(僅需一次簡單的PCR擴(kuò)增即可進(jìn)行電泳判斷)；而且具備良好的特異性，能夠有效區(qū)分空腸彎曲桿菌和常見的類似菌種；還具備 187fg/DNA模板以上的檢測靈敏度。
權(quán)利要求
1.一種檢測空腸彎曲桿菌的試劑盒，包括一對空腸彎曲桿菌特異性引物 Hl 5' -ctgaacttgccgattcggata-3‘ (SEQ ID NO 1),H2 5' -aggcaattcccgactggaca-3‘ (SEQ ID NO :2)。
2.權(quán)利要求1所述試劑盒，進(jìn)一步包括10XPCR緩沖液、2.5mmol/L的dNTP、2. 5U/μ L 的 Taq 酶、25mmol/L 的 Mg2+。
3.權(quán)利要求2所述的試劑盒在檢測臨床樣本里存在的空腸彎曲桿菌中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種空腸彎曲桿菌PCR檢測試劑盒，其包括一對針對空腸彎曲桿菌馬尿酸酶(Hip0)基因的保守區(qū)域設(shè)計的特異性引物上游引物H1 5’-ctgaacttgccgattcggata-3’(SEQID NO1)、下游引物H2 5’-aggcaattcccgactggaca-3’(SEQ ID NO2)；還提供了本發(fā)明的試劑盒在檢測臨床樣本里存在的空腸彎曲桿菌中的應(yīng)用。本發(fā)明的空腸彎曲桿菌PCR檢測試劑盒成分簡單、檢測操作方便；具備良好的特異性，能夠有效區(qū)分空腸彎曲桿菌和常見的類似菌種；還具備較高的檢測靈敏度。
文檔編號C12Q1/68GK102329865SQ20111027655
公開日2012年1月25日 申請日期2011年9月9日 優(yōu)先權(quán)日2011年9月9日
發(fā)明者呂愛杰, 朱麗萍, 顏世敢 申請人:山東輕工業(yè)學(xué)院