專利名稱：芽孢桿菌l型誘導(dǎo)培養(yǎng)基的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種細(xì)菌L型的誘導(dǎo)培養(yǎng)基。
背景技術(shù)：
細(xì)菌L型是細(xì)菌因變異而產(chǎn)生的細(xì)胞壁缺陷型，細(xì)菌細(xì)胞壁的缺陷可自發(fā)形成， 也可人工誘導(dǎo)，誘導(dǎo)細(xì)菌變?yōu)長型的因素很多，如抗生素、中藥等。國內(nèi)對細(xì)菌L型的研究主要集中在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，由于抗生素的大量使用使得病原菌突變形成L型，L型病原菌可以具有致病性，但由于其缺乏細(xì)胞壁，青霉素等作用于細(xì)胞壁的抗生素對其沒有作用，故L型的產(chǎn)生對疾病的治療提出了新的挑戰(zhàn)，因此國內(nèi)關(guān)于L型的研究主要集中在病原菌L型的防治、檢測等方面。但在上世紀(jì)90年代，英國阿伯丁大學(xué)的研究[Artificially induced symbiotic associations ofL-form bacteria and plants[J]. Journal of Applied But Feriology, 1984,56(3) :465-477. The L-phaseof Erwinia carotovora var. atroseptica and its possible association with plant tissue [J] · Jappl. Bact. , 1973, 36 :729-737.)]表明 L型細(xì)菌在植物體內(nèi)能夠與植物形成內(nèi)共生關(guān)系，并成功誘導(dǎo)了這種關(guān)系可使植物在受到病原體脅迫時，抗病效果大大提高，這些研究為植物病害的防治和抗病植物的育種提供了新的思路。蠟樣芽孢桿菌是植物的一種益生菌，可以促進(jìn)植物生長，并可以通過拮抗作用、 競爭作用、誘導(dǎo)植物抗性等抵御植物病害。陳沖等人的研究(陳沖，王程亮，張潞生.蠟樣芽孢桿菌TS-02防治草莓白粉病研究.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué).2007，35 (11) =3298,3300)表明，蠟樣芽孢桿菌可抑制白粉病菌的定殖，從而達(dá)到防治草莓白粉病的效果。將蠟樣芽孢桿菌誘導(dǎo)為L型，將L型導(dǎo)入植物體形成內(nèi)共生，可以選育出對白粉病等植物病害具有抗性的新型植物品種。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種成功率高、快速的芽孢桿菌L型誘導(dǎo)培養(yǎng)基。一種芽孢桿菌L型誘導(dǎo)培養(yǎng)基，按照以下步驟制備每900mL蒸餾水中溶有葡萄糖8-12g，胰蛋白胨8-12g，酵母粉4-6g，牛肉膏4_6g，氯化鈉4_6g，瓊脂9_10g，蔗糖 160-180g, MgCl2 1. 7-2. lg，在121°C條件下滅菌10-60min，所得培養(yǎng)基冷卻后加入滅活馬血清IOOmL,再加入過濾除菌的溶菌酶使其終濃度為l_5mg/mL，所述滅活馬血清為使用前需在56°C滅活0. 5小時。本發(fā)明芽孢桿菌L型誘導(dǎo)培養(yǎng)基，按照以下步驟制備每900mL蒸餾水中溶有葡萄糖10g，胰蛋白胨10g，酵母粉5g，牛肉膏5g，氯化鈉5g，瓊脂10g，蔗糖170g, MgCl2L 9g，在 121 °C條件下滅菌10-60min，冷卻后加入滅活馬血清IOOmL,再加入過濾除菌的溶菌酶使其終濃度為l_5mg/mL，所述滅活馬血清為使用前需在56°C滅活0. 5小時。使用該芽孢桿菌L型的誘導(dǎo)培養(yǎng)基按以下步驟進(jìn)行誘導(dǎo)
1、將芽孢桿菌接種于營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，28-32°C振蕩培養(yǎng)至芽孢桿菌處于對數(shù)生長期；2、取所得芽孢桿菌培養(yǎng)液，離心收集菌體，用高滲液洗滌兩次后，將菌體懸浮于高滲液中使細(xì)菌濃度為(0. 9-1. 1) X 108CFU/mL，加入剛剛配置的溶菌酶使其終濃度與芽孢桿菌L型誘導(dǎo)培養(yǎng)基中的溶菌酶濃度相等，混勻，置于的恒溫條件下，當(dāng)活體染色顯示99%以上的菌體變?yōu)榍蛐螘r，終止溶菌酶的作用，1500-2500r/min離心10-20min收集沉淀，用高滲液洗滌兩次后，懸浮于懸浮液中使細(xì)菌濃度為(0.9-1. l)X108CFU/mL，即得去壁菌懸液；3、將滅菌后的芽孢桿菌L型誘導(dǎo)培養(yǎng)基冷卻后傾倒平板，將去壁菌懸液輕輕的滴加在未凝固的芽孢桿菌L型誘導(dǎo)培養(yǎng)基平板上待平板凝固后，將平板倒置放入燭缸中， 用CO2燭缸法培養(yǎng)，在觀-321的條件下，培養(yǎng)至菌懸液液滴內(nèi)及液滴的邊緣出現(xiàn)直徑 0. 4-0. 6mm的顆粒狀菌落，驗證菌落為L型菌落后，挑取同一菌落接種于新鮮的芽孢桿菌 L型誘導(dǎo)培養(yǎng)基平板上，每3天轉(zhuǎn)接一次，每次轉(zhuǎn)接前均要驗證所轉(zhuǎn)接的菌落為L型，經(jīng)過 5-10次轉(zhuǎn)接形成穩(wěn)定的芽孢桿菌L型；所述營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基的配方為每IOOOmL蒸餾水中溶有牛肉膏3g、胰蛋白胨10g、 氯化鈉5g，用常用酸或堿溶液調(diào)節(jié)pH至7. 0-7. 2，121°C滅菌20min。所述高滲液的配方為在0. 1-0. 5mol/L、pH6. 0-7. 0的磷酸緩沖液中加入0. 01-0. 03mol/L順丁烯二酸和0. 01-0. 03mol/L MgCl2,加入蔗糖使其終濃度為 0. 4-0. 6mol/L, 121°C 滅菌 15_60min。所述懸浮液的配方為每IOOOmL蒸餾水中溶有K2HPO4O. 3-0. 5g，MgSO4 · 7H20 0. 2-0. 4g，酪蛋白 5-10g,KH2PO4 0. 3-0. 5g,CaCl2 0. 1-0. 5g,MnSO4 0. 01-0. 05g,FeSO4 ·7Η20 0. 002-0. 006g, NaCl 30_60g，用常用酸或堿溶液調(diào)節(jié) pH6. 0-7. 0。所述驗證菌落為L型菌落的方法為挑取菌落經(jīng)活體染色觀察形態(tài)和/或滲透壓的敏感性試驗和/或濾過性試驗，其中所述活體染色觀察菌體形態(tài)為采用高滲美蘭活體染色法。由于芽孢桿菌為桿狀， 而細(xì)胞壁去掉之后菌體為球狀，所以通過菌體性質(zhì)即可判斷是否是L型。所述滲透壓的敏感性試驗為將細(xì)胞放入蒸餾水中，IOmin后觀察，細(xì)菌破裂，無完整細(xì)胞，說明此細(xì)胞對滲透壓敏感。原始菌體由于有細(xì)胞壁所以對滲透壓不敏感，L型沒有細(xì)胞壁，進(jìn)入低滲溶液會破裂死亡。所述濾過性試驗為用高滲液將L型誘導(dǎo)培養(yǎng)基上的菌落洗下，用0. 45 μ m的細(xì)菌濾膜過濾，取濾液接種于L型誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，32°C培養(yǎng)，接種3天后觀察是否有菌落生長。 由于有細(xì)胞壁的細(xì)菌不能通過細(xì)菌濾膜，而L型可以，所以用0. 45um的濾膜過濾后收集濾液，L型菌液的濾液接種于L型誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，會有細(xì)菌生長。所述穩(wěn)定的L型的鑒定方法在無溶菌酶的L型誘導(dǎo)培養(yǎng)基中傳代3次，采用高滲美蘭活體染色法觀察菌體形態(tài)，菌體為球狀，不恢復(fù)桿狀即認(rèn)定為穩(wěn)定的L型。本發(fā)明芽孢桿菌L型誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，單個芽孢桿菌L型誘導(dǎo)培養(yǎng)基平板誘導(dǎo)芽孢桿菌L型的成功率可以達(dá)到100%，芽孢桿菌L型在L型誘導(dǎo)培養(yǎng)基平板上，通過(X)2燭缸法培養(yǎng)生長較快，3天即可轉(zhuǎn)接一次，轉(zhuǎn)接5-10次即可得到穩(wěn)定的芽孢桿菌L型，誘導(dǎo)周期短。
具體實施例方式實施例11、將蠟樣芽孢桿菌ATCC 10702菌株接種于營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，，振蕩培養(yǎng)至蠟樣芽孢桿菌處于對數(shù)生長期。2、取所得蠟樣芽孢桿菌培養(yǎng)液，離心收集菌體，用高滲液洗滌兩次后，將菌體懸浮于高滲液中使細(xì)菌濃度約(0. 9-1. 1) X 108CFU/mL，加入剛剛配置的溶菌酶使其終濃度達(dá)到 1. Omg/mL，混勻，置于的恒溫水浴鍋中，當(dāng)高滲美蘭活體染色顯示99%以上的菌體變?yōu)榍蛐螘r，1500r/min離心20min收集沉淀，用高滲液洗滌兩次，懸浮于懸浮液中使細(xì)菌濃度為(0. 9-1. 1) X 108CFU/mL,即得去壁菌懸液。3、將溶菌酶濃度為1. Omg/mL的L型誘導(dǎo)培養(yǎng)基傾倒平板，將去壁菌懸液輕輕的滴加在未凝固的L型誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，凝固后將平板倒置放入燭缸中，用(X)2燭缸法培養(yǎng)二8°C 條件下培養(yǎng)3天左右出現(xiàn)直徑0. 4-0. 6mm的顆粒狀菌落，挑取菌落經(jīng)高滲美蘭活體染色觀察形態(tài)，驗證菌落為L型菌落后，挑取同一菌落接種于新鮮的L型誘導(dǎo)培養(yǎng)基平板上，此后3 天轉(zhuǎn)接一次，每次轉(zhuǎn)接前均要經(jīng)高滲美蘭活體染色觀察形態(tài)，驗證所轉(zhuǎn)接的菌落為L型，經(jīng)過10次轉(zhuǎn)接形成穩(wěn)定的L型，此后不加溶菌酶無返祖現(xiàn)象。所述營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基的配方為每IOOOmL蒸餾水中溶有牛肉膏3g、胰蛋白胨10g、 氯化鈉5g，用常用酸或堿溶液調(diào)節(jié)pH至7. 0-7. 2，121°C滅菌20min。所述高滲液的配方為在0. lmol/L、pH6. 0的磷酸緩沖液中加入0. Olmol/L順丁烯二酸和0. 01mol/L MgCl2，加入蔗糖使其終濃度為0. 4mol/L, 121°C滅菌15min。所述懸浮液的配方為每IOOOmL蒸餾水中溶有K2HPO4 0. 3g,MgSO4 ·7Η20 0. 2g，酪蛋白 5g，KH2PO4 0. 3g, CaCl2 0. lg，MnSO4 0. 01g，F(xiàn)eSO4 · 7H20 0. 002g, NaCl 30，用常用酸或堿溶液調(diào)節(jié)pH6. 0。所述L型誘導(dǎo)培養(yǎng)基的配方為900mL蒸餾水中溶有葡萄糖8g，胰蛋白胨8g，酵母粉4g，牛肉膏4g，氯化鈉4g，瓊脂9g，蔗糖160g,MgCl2 1. 7g，在121°C條件下滅菌IOmin,冷卻后加入滅活馬血清IOOmL,再加入過濾除菌的溶菌酶使其終濃度為1. Omg/mL。實施例2 1、將蠟樣芽孢桿菌ATCC 10702菌株接種于營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，32°C，振蕩培養(yǎng)至蠟樣芽孢桿菌處于對數(shù)生長期。2、取所得蠟樣芽孢桿菌培養(yǎng)液，離心收集菌體，用高滲液洗滌兩次后，將菌體懸浮于高滲液中使細(xì)菌濃度約(0. 9-1. 1) X 108CFU/mL，加入剛剛配置的溶菌酶使其終濃度達(dá)到 5. 0mg/mL，混勻，置于37°C的恒溫水浴鍋中，當(dāng)高滲美蘭活體染色顯示99%以上的菌體變?yōu)榍蛐螘r，2500r/min離心IOmin收集沉淀，用高滲液洗滌兩次，懸浮于懸浮液中使細(xì)菌濃度為(0. 9-1. 1) X 108CFU/mL,即得去壁菌懸液。3、將溶菌酶濃度為5mg/mL的L型誘導(dǎo)培養(yǎng)基傾倒平板，將去壁菌懸液輕輕的滴加在未凝固的L型誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，凝固后將平板倒置放入燭缸中，用CO2燭缸法培養(yǎng)，32°C條件下培養(yǎng)3天左右出現(xiàn)直徑0. 4-0. 6mm的顆粒狀菌落，用滲透壓的敏感性試驗驗證菌落為L 型菌落后，挑取同一菌落接種于新鮮的L型誘導(dǎo)培養(yǎng)基平板上，此后3天轉(zhuǎn)接一次，每次轉(zhuǎn)接前均要驗證所轉(zhuǎn)接的菌落為L型，經(jīng)過5次轉(zhuǎn)接形成穩(wěn)定的L型，此后不加溶菌酶無返祖現(xiàn)象。所述營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基的配方為每IOOOmL蒸餾水中溶有牛肉膏3g、胰蛋白胨10g、 氯化鈉5g，用常用酸或堿溶液調(diào)節(jié)pH至7. 0-7. 2，121°C滅菌20min。所述高滲液的配方為在0. 5mol/L、pH7. 0的磷酸緩沖液中加入0. 03mol/L順丁烯二酸和0. 03mol/L MgCl2，加入蔗糖使其終濃度為0. 6mol/L, 121°C滅菌60min。所述懸浮液的配方為每IOOOmL蒸餾水中溶有K2HPO4 0. 5g,MgSO4 ·7Η20 0. 4g，酪蛋白 10g，KH2PO4 0. 5g, CaCl2 0. 5g, MnSO4 0. 05g，F(xiàn)eSO4 · 7H20 0. 006g, NaCl 60g，用常用酸或堿溶液調(diào)節(jié)pH 7.0。所述L型誘導(dǎo)培養(yǎng)基的配方為900mL蒸餾水中溶有葡萄糖12g，胰蛋白胨12g，酵母粉6g，牛肉膏6g，氯化鈉6g，瓊脂10g，蔗糖180g，MgCl2 2. lg，在121°C條件下滅菌60min， 冷卻后加入滅活馬血清IOOmL,再加入過濾除菌的溶菌酶使其終濃度為5mg/mL。實施例3 1、將蠟樣芽孢桿菌ATCC 10702接種于營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，30°C振蕩培養(yǎng)至枯草芽孢桿菌處于對數(shù)生長期。2、取所得枯草芽孢桿菌培養(yǎng)液，離心收集菌體，用高滲液洗滌兩次后，將菌體懸浮于高滲液中使細(xì)菌濃度約(0. 9-1. 1) X 108CFU/mL，加入剛剛配置的溶菌酶使其終濃度達(dá)到 :3mg/mL，混勻，置于32°C的恒溫水浴鍋中，當(dāng)高滲美蘭活體染色顯示99%以上的菌體變?yōu)榍蛐螘r，2000r/min離心15min收集沉淀，用高滲液洗滌兩次，懸浮于懸浮液中使細(xì)菌濃度為(0. 9-1. 1) X 108CFU/mL,即得去壁菌懸液。3、將溶菌酶濃度為;3mg/mL的L型誘導(dǎo)培養(yǎng)基冷卻至40°C傾倒平板，將去壁菌懸液輕輕的滴加在未凝固的L型誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，凝固后將平板倒置放入燭缸中，用(X)2燭缸法培養(yǎng)，32°C條件下培養(yǎng)3天左右出現(xiàn)直徑0. 4-0. 6mm的顆粒狀菌落，用濾過性試驗驗證菌落為L型菌落后，挑取同一菌落接種于新鮮的L型誘導(dǎo)培養(yǎng)基平板上，此后3天轉(zhuǎn)接一次，每次轉(zhuǎn)接前均要驗證所轉(zhuǎn)接的菌落為L型，經(jīng)過6次轉(zhuǎn)接形成穩(wěn)定的L型，此后不加溶菌酶無返祖現(xiàn)象。所述營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基的配方為每IOOOmL蒸餾水中溶有牛肉膏3g、胰蛋白胨10g、 氯化鈉5g，用常用酸或堿溶液調(diào)節(jié)pH至7. 0-7. 2，121°C滅菌20min。所述高滲液的配方為在0. 5mol/L、pH7. 0的磷酸緩沖液中加入0. 03mol/L順丁烯二酸和0. 03mol/L MgCl2，加入蔗糖使其終濃度為0. 6mol/L, 121°C滅菌20min。所述懸浮液的配方為每IOOOmL蒸餾水中溶有K2HPO4 0. 5g,MgSO4 ·7Η20 0. 4g，酪蛋白 10g，KH2PO4 0. 5g, CaCl2 0. 5g, MnSO4 0. 05g，F(xiàn)eSO4 · 7H20 0. 006g, NaCl 60g，用常用酸或堿溶液調(diào)節(jié)pH 7.0。所述L型誘導(dǎo)培養(yǎng)基的配方為900mL蒸餾水中溶有葡萄糖10g，胰蛋白胨10g，酵母粉5g，牛肉膏5g，氯化鈉5g，瓊脂10g，蔗糖170g，MgCl2 1. 9g，在121°C條件下滅菌20min， 冷卻后加入滅活馬血清IOOmL,再加入過濾除菌的溶菌酶使其終濃度為;3mg/mL。實施例4 1、將枯草芽孢桿菌ACCC 11060接種于營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，30°C振蕩培養(yǎng)至枯草芽孢桿菌處于對數(shù)生長期。2、取所得枯草芽孢桿菌培養(yǎng)液，離心收集菌體，用高滲液洗滌兩次后，將菌體懸浮于高滲液中使細(xì)菌濃度約(0. 9-1. 1) X 108CFU/mL，加入剛剛配置的溶菌酶使其終濃度達(dá)到 :3mg/mL，混勻，置于32°C的恒溫水浴鍋中，當(dāng)高滲美蘭活體染色顯示99%以上的菌體變?yōu)榍蛐螘r，2000r/min離心15min收集沉淀，用高滲液洗滌兩次，懸浮于懸浮液中使細(xì)菌濃度為(0. 9-1. 1) X 108CFU/mL,即得去壁菌懸液。3、將溶菌酶濃度為;3mg/mL的L型誘導(dǎo)培養(yǎng)基冷卻至40°C傾倒平板，將去壁菌懸液輕輕的滴加在未凝固的L型誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，凝固后將平板倒置放入燭缸中，用(X)2燭缸法培養(yǎng)，32°C條件下培養(yǎng)3天左右出現(xiàn)直徑0. 4-0. 6mm的顆粒狀菌落，用濾過性試驗驗證菌落為L型菌落后，挑取同一菌落接種于新鮮的L型誘導(dǎo)培養(yǎng)基平板上，此后3天轉(zhuǎn)接一次，每次轉(zhuǎn)接前均要驗證所轉(zhuǎn)接的菌落為L型，經(jīng)過7次轉(zhuǎn)接形成穩(wěn)定的L型，此后不加溶菌酶無返祖現(xiàn)象。所述營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基的配方為每IOOOmL蒸餾水中溶有牛肉膏3g、胰蛋白胨10g、 氯化鈉5g，用常用酸或堿溶液調(diào)節(jié)pH至7. 0-7. 2，121°C滅菌20min。所述高滲液的配方為在0. 5mol/L、pH7. 0的磷酸緩沖液中加入0. 03mol/L順丁烯二酸和0. 03mol/L MgCl2，加入蔗糖使其終濃度為0. 6mol/L, 121°C滅菌20min。所述懸浮液的配方為每IOOOmL蒸餾水中溶有K2HPO4 0. 5g,MgSO4 ·7Η20 0. 4g，酪蛋白 10g，KH2PO4 0. 5g, CaCl2 0. 5g, MnSO4 0. 05g，F(xiàn)eSO4 · 7H20 0. 006g, NaCl 60g，用常用酸或堿溶液調(diào)節(jié)pH 7.0。所述L型誘導(dǎo)培養(yǎng)基的配方為900mL蒸餾水中溶有葡萄糖10g，胰蛋白胨10g，酵母粉5g，牛肉膏5g，氯化鈉5g，瓊脂10g，蔗糖170g，MgCl2 1. 9g，在121°C條件下滅菌20min， 冷卻后加入滅活馬血清IOOmL,再加入過濾除菌的溶菌酶使其終濃度為;3mg/mL。實施例5對比試驗將蠟樣芽孢桿菌ATCC 10702菌株按照實施例2中的方法誘導(dǎo)成L型，僅改變以下條件將芽孢桿菌L型誘導(dǎo)培養(yǎng)基的配方改為900mL蒸餾水中溶有葡萄糖5g，蛋白胨 5g，酵母粉5g，瓊脂7.5g，蔗糖200g，MgSO4 · 7H20 0. lg，用常用酸或堿溶液調(diào)節(jié)pH7. 0，在 121°C條件下滅菌60分鐘，冷卻后加入滅活馬血清IOOmL,加入過濾除菌的溶菌酶使其終濃度 5mg/mL。結(jié)果兩個實施例都能獲得穩(wěn)定的細(xì)菌L型。其區(qū)別如下表
權(quán)利要求
1.一種芽孢桿菌L型誘導(dǎo)培養(yǎng)基，其特征在于按照以下步驟制備每900mL蒸餾水中溶有葡萄糖8-12g，胰蛋白胨8-12g，酵母粉4-6g，牛肉膏4_6g，氯化鈉4_6g，瓊脂9_10g，蔗糖160-180g，MgCl2 1. 7-2. lg，在121°C條件下滅菌10-60min，所得培養(yǎng)基冷卻后加入滅活馬血清IOOmL,再加入過濾除菌的溶菌酶使其終濃度為l_5mg/mL，所述滅活馬血清為使用前需在56°C滅活0. 5小時。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述芽孢桿菌L型誘導(dǎo)培養(yǎng)基，其特征在于按照以下步驟制備每 900mL蒸餾水中溶有葡萄糖10g，胰蛋白胨10g，酵母粉5g，牛肉膏5g，氯化鈉5g，瓊脂10g， 蔗糖170g，MgCl2 1. 9g，在121°C條件下滅菌10_60min，冷卻后加入滅活馬血清IOOmL,再加入過濾除菌的溶菌酶使其終濃度為l_5mg/mL，所述滅活馬血清為使用前需在56°C滅活0. 5 小時。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種芽孢桿菌L型誘導(dǎo)培養(yǎng)基，其成功率高、誘導(dǎo)快速。本發(fā)明芽孢桿菌L型誘導(dǎo)培養(yǎng)基，按照以下步驟制備每900mL蒸餾水中溶有葡萄糖8-12g，胰蛋白胨8-12g，酵母粉4-6g，牛肉膏4-6g，氯化鈉4-6g，瓊脂9-10g，蔗糖160-180g，MgCl2 1.7-2.1g，在121℃條件下滅菌10-60min，所得培養(yǎng)基冷卻后加入滅活馬血清100mL，再加入過濾除菌的溶菌酶使其終濃度為1-5mg/mL，所述滅活馬血清為使用前需在56℃滅活0.5小時。
文檔編號C12N1/20GK102321557SQ201110279900
公開日2012年1月18日 申請日期2011年9月20日 優(yōu)先權(quán)日2011年9月20日
發(fā)明者叢慧芳, 孫治軍, 張梅, 王紅艷, 王鴻磊 申請人:山東省煙臺農(nóng)業(yè)學(xué)校