專利名稱：pCDH1-MCS1-EF1-copGFP-HCN4質(zhì)粒的構(gòu)建方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物起搏技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種P⑶Hl-MCSl-EFl-copGFP-HCN4質(zhì)粒及其構(gòu)建方法。
背景技術(shù)：
哺乳動物基因組編碼四種HCN基因，分別命名為HCNl HCN4。這四種異構(gòu)體在心臟中均已發(fā)現(xiàn)，但不同種屬、不同心臟組織和發(fā)育不同階段這些異構(gòu)體的表達(dá)存在差異不同種屬成年動物竇房結(jié)均優(yōu)勢表達(dá)HCN4，約占竇房結(jié)總體HCN的80%。在四種異構(gòu)體中HCN1，2，4是心臟中的主要部分，HCN3只在胚胎起搏細(xì)胞中有低水平表達(dá)。起搏活性小的區(qū)域(如心室肌)，HCN2的表達(dá)占優(yōu)勢；而起搏活性高的區(qū)域HCN4的表達(dá)占優(yōu)勢。目前對于生物起搏的研究集中于HCN2和HCN4，也就是把起搏基因HCN1-4轉(zhuǎn)到干細(xì)胞中，增加起搏細(xì)胞的起搏電流(If)來治療慢性心律失常。而構(gòu)建起搏通道基因亞型 pCDHl-MCSl-EFl-copGFP-HCN4質(zhì)粒是研究HCN4基因、起搏電流的特性以及研究生物起搏的前提和基礎(chǔ)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的在于提供一種ρ⑶Hl-MCSl-EFl-copGFP-HCN4質(zhì)粒的構(gòu)建方法，使 pCDHl-MCSl-EFl-copGFP-HCN4質(zhì)粒中帶有HCN4基因，可以作為生物起搏研究的基礎(chǔ)，也可以作為慢性心律失常的細(xì)胞治療和基因治療的基礎(chǔ)。為了解決現(xiàn)有技術(shù)中的這些問題，本發(fā)明提供的技術(shù)方案是一種ρ⑶Hl-MCSl-EFl-copGFP-HCN4質(zhì)粒的構(gòu)建方法，其特征在于所述方法包括以下步驟(1)從心肌組織中提取總RNA，將提取的總RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈，以反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板，使用含有核苷酸序列為SEQ No :2和為SEQ No :3的基因特異性引物通過PCR擴(kuò)增得到HCN4起搏基因；(2)抽提pCDHl-MCSl-EFl-copGFP質(zhì)粒，分別對空質(zhì)粒載體 pCDHl-MCSl-EFl-copGFP和步驟(I)PCR擴(kuò)增得到的HCN4起搏基因用EcoR I和BamH I進(jìn)行雙酶切(3)將雙酶切后的空質(zhì)粒載體ρ⑶Hl-MCSl-EFl-copGFP和雙酶切后的HCN4起搏基因進(jìn)行連接反應(yīng)，將HCN4起搏基因連接入ρ⑶Hl-MCSl-EFl-copGFP質(zhì)粒中，構(gòu)建形成 pCDHl-MCSl-EFl-copGFP-HCN4 質(zhì)粒。優(yōu)選的，所述方法步驟(1)中從心肌組織中提取總RNA采用的提取試劑為Trizol 試齊LU優(yōu)選的，所述方法步驟(1)中提取的總RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈時先進(jìn)行退火使RNA變性，然后在具有反轉(zhuǎn)錄酶的條件進(jìn)行合成cDNA第一鏈。優(yōu)選的，所述方法步驟⑴中進(jìn)行PCR擴(kuò)增的PCR反應(yīng)體系包括PCR緩沖液、dNTPs、熒光染料、MgCl2, TaqDNA聚合酶、模板DNA的，所述PCR反應(yīng)體系終濃度組成為PCR緩沖液終濃度1 IOX ；dNTPs0.01 1.5mM;基因特異性引物 終濃度為0. 01 2 ii M ；模板 cDNA0. 01 IOng/ U L ；KOD plus 酶0. 01 1. OU/ii L ；MgSO4終濃度為 0.5 5mM。優(yōu)選的，所述方法步驟⑴中進(jìn)行PCR擴(kuò)增的條件為92 97°C預(yù)變性4 15min ； 92 97°C變性10 30s，56 60°C退火10 30s，65 75°C延伸10 30s，共30 40 個循環(huán)。優(yōu)選的，所述方法步驟O)中采用堿裂解法小量抽提p⑶Hl-MCSl-EFl-copGFP質(zhì)粒。優(yōu)選的，所述方法步驟O)中進(jìn)行酶切的條件是溫度控制在32 38°C，酶切1 3小時。優(yōu)選的，所述方法步驟(3)中進(jìn)行連接反應(yīng)的條件是溫度控制在20 25°C，連接 反應(yīng)進(jìn)行1 3小吋。本發(fā)明通過p⑶Hl-MCSl-EFl-copGFP基礎(chǔ)質(zhì)粒作為表達(dá)載體與克隆 HCN4基因(HCN4基因的序列SEQ No 1)的cDNA結(jié)合構(gòu)建成起搏通道基因亞型 pCDHl-MCSl-EFl-copGFP-HCN4 質(zhì)粒。該質(zhì)?？梢宰鳛榇┧筚|(zhì)粒與慢病毒系統(tǒng)重組后的慢病毒載體包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染 HEK293細(xì)胞，獲得病毒液；對病毒液進(jìn)行病毒滴度測定，并進(jìn)行濃縮和純化得到高質(zhì)量的 病毒液?？梢酝ㄟ^感染宿主細(xì)胞對病毒液中的HCN4重組慢病毒載體進(jìn)行了鑒定。這種慢病毒既可以感染分裂細(xì)胞又可以感染非分裂細(xì)胞；其病毒基因組可以整合 于宿主基因組中，長時間、穩(wěn)定表達(dá)外源基因并具有較低的免疫原性。把帶有起搏基因HCN4 的片段重組到慢病毒中，進(jìn)而再轉(zhuǎn)到干細(xì)胞中，以增加起搏細(xì)胞的起搏電流(If)來治療慢 性心律失常。因此，構(gòu)建起搏通道基因亞型HCN重組慢病毒載體是研究HCN基因、起搏電流 的特性以及生物起搏等的前提和基礎(chǔ)。關(guān)于p⑶Hl-MCSl-EFl-copGFP-HCM質(zhì)粒轉(zhuǎn)染慢病 毒形成起搏通道基因亞型HCN重組慢病毒載體可以參考申請人的另ー專利申請文件——申 請?zhí)枮?00710190402. 2的名稱為起搏通道基因亞型HCN4重組慢病毒載體的構(gòu)建方法的中 國專利申請，該文獻(xiàn)中pCDHl-GFP-HCM即為本發(fā)明pCDHl-MCSl-EFl-copGFP-HCN4質(zhì)粒。在本發(fā)明中，術(shù)語“引物”是指ー種寡核苷酸，可以是天然的也可以是合成，它可以 作為在一定條件下誘發(fā)DNA合成的起始點，在上述條件下可以誘發(fā)合成與核酸鏈相互補(bǔ)的 引物擴(kuò)增產(chǎn)物，即在四種不同的三磷酸脫氧核糖核酸及ー種聚合試劑(即DNA聚合酶或逆 轉(zhuǎn)錄酶)存在下，在一種合適的緩沖液并在合適的溫度下進(jìn)行上述合成。優(yōu)選的引物是單 股寡脫氧核糖核苷酸。引物的合適長度取決于該引物的設(shè)計用途，但在一般在15 25個核 苷酸之間，較短的引物分子通常需要較低的溫度，從而與模板形成充分穩(wěn)定的雜交復(fù)合物。 引物不必反應(yīng)模板的準(zhǔn)確序列，但必須充分互補(bǔ)，已與模板雜交并引發(fā)DNA合成。引物設(shè)計遵循原則①引物應(yīng)用核酸系列保守區(qū)內(nèi)設(shè)計并具有特異性。②產(chǎn)物不 能形成ニ級結(jié)構(gòu)。③引物長度一般在15 30堿基之間。④G+C含量在40% 60%之間。⑤堿基要隨機(jī)分布。⑥引物自身不能有連續(xù)4個堿基的互補(bǔ)。⑦引物之間不能有連續(xù)4個堿基的互補(bǔ)。⑧引物5'端可以修飾。⑨引物3'端不可修飾。⑩引物3'端要避開密碼子的第3位。進(jìn)行引物設(shè)計的軟件有I^rimer 5，Beacon Designer 7。引物合成采用的方法為亞磷酰胺三酯法，將DNA固定在固相載體上完成DNA鏈的合成的，合成的方向是由待合成引物的3'端向5'端合成的，相鄰的核苷酸通過3' -5' 磷酸二酯鍵連接。具體步驟包括1、將預(yù)先連接在固相載體CPG上的活性基團(tuán)被保護(hù)的核苷酸與三氯乙酸反應(yīng)，脫去其5'-羥基的保護(hù)基團(tuán)DMT，獲得游離的5'-羥基。2、合成DNA的原料，亞磷酰胺保護(hù)核苷酸單體，與活化劑四氮唑混合，得到核苷亞磷酸活化中間體，它的3 ‘ 端被活化，5'-羥基仍然被DMT保護(hù)，與溶液中游離的5'-羥基發(fā)生縮合反應(yīng)。3、帶帽 (capping)反應(yīng)，縮合反應(yīng)中可能有極少數(shù)5'-羥基沒有參加反應(yīng)(少于2% )，用乙酸酐和1-甲基咪唑終止其后繼續(xù)發(fā)生反應(yīng)，這種短片段可以在純化時分離掉。4、在氧化劑碘的作用下，亞磷酰形式轉(zhuǎn)變?yōu)楦€(wěn)定的磷酸三酯。經(jīng)過以上四個步驟，一個脫氧核苷酸被連接到固相載體的核苷酸上。再以三氯乙酸脫去它的5'-羥基上的保護(hù)基團(tuán)DMT，重復(fù)以上步驟，直到所有要求合成的堿基被接上去。最后通過氨水高溫處理，連接在CPG上的引物被切下來，通過OPC，PAGE等手段純化引物。


下面結(jié)合附圖及實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步描述圖1為表達(dá)載體pCDHl-MCSl-EFl-copGFP的結(jié)構(gòu)圖；圖2為心肌細(xì)胞總RNA的電泳圖；圖3為RT-PCR產(chǎn)物電泳圖，其中A泳道為DL2000 Marker ；B_G泳道分別為目的基因條帶；圖 4 為 pCDHl-MCSl-EFl-copGFP 質(zhì)粒電泳圖；1 泳道:lkb marker ；2 3 泳道均為 pCDHl-MCSl-EFl-copGFP 質(zhì)粒；圖5為克隆產(chǎn)物電泳圖，其中A泳道為DL2000 Marker ；B-I泳道分別為挑取的八個克隆的PCR產(chǎn)物；圖6為雙酶切產(chǎn)物電泳圖，其中A泳道為11Λ marker ；B、D泳道分別為2號、8號質(zhì)粒酶切產(chǎn)物；C、E泳道分別為2號、8號質(zhì)粒；圖7為pCDHl-MCSl-EFl-copGFP-HCN4構(gòu)建后對攜帶的HCN4基因的測序結(jié)果。
具體實施例方式以下結(jié)合具體實施例對上述方案做進(jìn)一步說明。應(yīng)理解，這些實施例是用于說明本發(fā)明而不限于限制本發(fā)明的范圍。實施例中采用的實施條件可以根據(jù)具體廠家的條件做進(jìn)一步調(diào)整，未注明的實施條件通常為常規(guī)實驗中的條件。實施例pCDHl-MCSl-EFl-copGFP-HCN4 的構(gòu)建1、實驗試劑和耗材(1)試驗試劑載體pCDHl-MCSl-EFl-copGFP(7M4bp)(購自上海康成生物公司)、TRIZOL 試劑Invitrogen life technologies、反轉(zhuǎn)錄試劑盒Promega、KOD-plus 酶東洋坊、T4連接酶TAKARA、限制性內(nèi)切酶TAKARA、制備感受態(tài)試劑盒BIOSCIENCES、 小量抽提試劑盒生工、Qiagen、凝膠回收試劑盒生工；DL2000 DNA marker、Ikb marker TAKARA。(2)試驗設(shè)備電熱恒溫培養(yǎng)箱上海森信實驗儀器有限公司；恒溫?fù)u床華美生化儀器；電熱恒溫水浴鍋上海森信實驗儀器有限公司；電泳儀君意東方電泳設(shè)備；數(shù)碼凝膠處理系統(tǒng)天能科學(xué)儀器；其他試劑氯仿、異丙醇等均購于上海化學(xué)試劑有限公司；小鼠，由蘇州大學(xué)動物中心提供。2、實驗步驟和方法本實施例選用帶GFP熒光標(biāo)記的表達(dá)載體ρ⑶Hl-MCSl-EFl-copGFP用于構(gòu)建cDNA 表達(dá)載體，載體圖譜如圖1所示。目的cDNA插入到多克隆位點(MCS)中，其下游擁有獨立的GFP表達(dá)系統(tǒng)。HCN4起搏基因在GENBANK所公布的編號為NM 005477，共5065個堿基，插入的 HCN4目的基因的mRNA片段序列為其編碼區(qū)堿基，序列為第四45_4566，共1621個堿基。實驗中測序區(qū)域為序列第3591 4281堿基。(1)引物設(shè)計和合成根據(jù)HCN4基因的序列信息，設(shè)計兩條帶酶切位點的引物，上游引物帶有EcoR I酶切位點，下游引物帶有BamH I酶切位點，設(shè)計原則及序列如下正向引物(forward primer)中帶有酶切位點保護(hù)堿基(CG)、酶切位點(EcoR I)、 Kozak序列(GCCACC，可增強(qiáng)基因表達(dá))，設(shè)計的核苷酸序列為5’ -CGGAATTCGCCACCATGAG CGACGTGGCTATT-3’ ；反向引物(reverse primer)中帶有酶切位點保護(hù)堿基(CG)、酶切位點 (BamH I)，設(shè)計的核苷酸序列為5，-CGGGATCCCAGCGCAGTCCACCGCCGCCT-3，；然后將設(shè)計好的引物進(jìn)行化學(xué)合成。(2) PCR擴(kuò)增目的基因片段先按照如下步驟進(jìn)行小鼠心肌細(xì)胞總RNA的抽提i)取材取小鼠心肌組織，切除后迅速放入液氮中保存。ii)總 RNA 提取取凍存小鼠心肌組織lOOmg，置于2mL玻璃勻漿器中，立即加入ImLTrizol變性液，冰浴中充分勻漿，將勻漿液轉(zhuǎn)入1. 5mL EP管中，加入200 μ L氯仿，混勻、12000rpm離心 lOmin，取上清加入600 μ L氯仿，混勻后12000rpm離心lOmin，取上清加入500 μ L異戊醇混勻，冰上放置20min，15000rpm離心20sec后，冰浴15min，轉(zhuǎn)移至EP管中，于4°C、IOOOOrpm 離心20min，轉(zhuǎn)移水相至新EP管中，加入等體積異丙醇混勻，_20°C過夜沉淀。次日，于4°C、 IOOOOrpm離心20min，加入0. 3mL變性液重新懸浮，加等體積異丙醇于_20°C沉淀lh。4°C、 IOOOOrpm離心20min，沉淀以75%乙醇重新懸浮，4°C、IOOOOrpm離心20min沉淀，于室溫干燥后加入50 μ L DEPC處理過的水溶解。2%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA完整性，并用紫外分光分析儀測RNA濃度和純度。-70°C保存RNA備用。然后將提取后的總RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈，按照如下步驟進(jìn)行a)配制退火混合液
權(quán)利要求
1.一種P⑶Hl-MCSl-EFl-COpGFP-HCN4質(zhì)粒的構(gòu)建方法，其特征在于所述方法包括以下步驟(1)從心肌組織中提取總RNA，將提取的總RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈，以反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板，使用含有核苷酸序列為SEQ No :2和為SEQ No :3的基因特異性引物通過 PCR擴(kuò)增得到HCN4起搏基因；(2)抽提pCDHl-MCSl-EFl-copGFP 質(zhì)粒，分別對空質(zhì)粒載體 pCDHl-MCSl-EFl-copGFP 和步驟(1) PCR擴(kuò)增得到的HCN4起搏基因用EcoR I和BamH I進(jìn)行雙酶切(3)將雙酶切后的空質(zhì)粒載體ρ⑶Hl-MCSl-EFl-copGFP和雙酶切后的HCN4起搏基因進(jìn)行連接反應(yīng)，將HCN4起搏基因連接入ρ⑶Hl-MCSl-EFl-copGFP質(zhì)粒中，構(gòu)建形成 pCDHl-MCSl-EFl-copGFP-HCN4 質(zhì)粒。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的構(gòu)建方法，其特征在于所述方法步驟(1)中從心肌細(xì)胞或心肌組織中提取總RNA采用的提取試劑為Trizol試劑。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的構(gòu)建方法，其特征在于所述方法步驟(1)中提取的總RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈時先進(jìn)行退火使RNA變性，然后在具有反轉(zhuǎn)錄酶的條件進(jìn)行合成cDNA 第一鏈。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的構(gòu)建方法，其特征在于所述方法步驟(1)中進(jìn)行PCR擴(kuò)增的 PCR反應(yīng)體系還包括PCR緩沖液、dNTPs、MgSO4 、KOD plus酶、模板cDNA的，所述PCR反應(yīng)體系終濃度組成為PCR緩沖液終濃度1 10 X ；dNTPs 0. 01 1. 5mM ；基因特異性引物終濃度為 0. 01 2 μ M ；模板 cDNA 0. 01 IOng/ μ L ；KOD plus 酶 0. 01 1. OU/ μ L ；MgSO4 終濃度為 0. 5 5mM。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的構(gòu)建方法，其特征在于所述方法步驟(1)中進(jìn)行PCR擴(kuò)增的條件為92 97°C預(yù)變性4 15min ；92 97°C變性10 30s，56 60°C退火10 30s， 65 75°C延伸10 30s，共30 40個循環(huán)。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的構(gòu)建方法，其特征在于所述方法步驟(2)中采用堿裂解法小量抽提 pCDHl-MCSl-EFl-copGFP 質(zhì)粒。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的構(gòu)建方法，其特征在于所述方法步驟(2)中進(jìn)行酶切的條件是溫度控制在32 38°C，酶切1 3小時。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的構(gòu)建方法，其特征在于所述方法步驟(3)中進(jìn)行連接反應(yīng)的條件是溫度控制在20 25°C，連接反應(yīng)進(jìn)行1 3小時。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種pCDH1-MCS1-EF1-copGFP-HCN4質(zhì)粒的構(gòu)建方法，其特征在于所述方法包括以下步驟(1)從心肌組織中提取總RNA，將提取的總RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈，以反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板，使用含有核苷酸序列為SEQNo2和為SEQNo3的基因特異性引物通過PCR擴(kuò)增得到HCN4起搏基因；(2)抽提pCDH1-MCS1-EF1-copGFP質(zhì)粒，分別對空質(zhì)粒載體pCDH1-MCS1-EF1-copGFP和步驟(1)PCR擴(kuò)增得到的HCN4起搏基因用EcoRⅠ和BamHⅠ進(jìn)行雙酶切；(3)將雙酶切后的空質(zhì)粒載體pCDH1-MCS1-EF1-copGFP和雙酶切后的HCN4起搏基因進(jìn)行連接反應(yīng)，將HCN4起搏基因連接入pCDH1-MCS1-EF1-copGFP質(zhì)粒中，構(gòu)建形成pCDH1-MCS1-EF1-copGFP-HCN4質(zhì)粒。該質(zhì)?？梢宰鳛樯锲鸩难芯炕A(chǔ)。
文檔編號C12N15/85GK102399818SQ201110283350
公開日2012年4月4日 申請日期2011年9月22日 優(yōu)先權(quán)日2011年9月22日
發(fā)明者周亞峰, 李紅霞, 楊向軍, 蔣文平, 韓蓮花 申請人:蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院