專利名稱：一種特異性識別副溶血性弧菌的寡核苷酸適配子的篩選及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及利用SELEX技術(shù)(指數(shù)富集的配體系統(tǒng)進化技術(shù))篩選獲得一種與副溶血性弧菌高親和力、高特異性識別的寡核苷酸適配子，以及該寡核苷酸適配子在鑒別副溶血性弧菌中的應(yīng)用，屬生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
副溶血性弧菌(Vibrio Parahemolyticus),系弧菌科弧菌屬,革蘭染色陰性,兼性厭氧菌，為多形態(tài)桿菌或稍彎曲弧菌。副溶血性弧菌是ー種在河、海、港口等環(huán)境中自然生長的革蘭氏陰性嗜鹽菌，它廣泛分布于海水及多種水產(chǎn)品中，可引起急性胃腸炎，少數(shù)情況還能引發(fā)敗血病，危及生命。副溶血性弧菌引起的食物中毒，在日本、東南亞、美國等國家及中國臺北地區(qū)較為多見，在世界范圍內(nèi)被公認是ー種重要的食源性病原菌。在我國，副溶血性弧菌所致食物中毒，在細菌性食物中毒占有重要地位。許多資料表明，副溶血性弧菌已經(jīng)成為我國一個嚴重的食源性公共衛(wèi)生問題之一。因此建立準確、靈敏、快速的副溶血性弧菌檢測技術(shù)對于食品安全具有重要意義。
·
傳統(tǒng)的微生物檢驗，往往既耗時又不靈敏；新發(fā)展起來的PCR技木，雖然能縮短檢驗時間，但靈敏度仍然不高；免疫學方法具有特異性強、靈敏度高、易于觀察等優(yōu)點，但制備抗體的時間比較長，成本高·，且不穩(wěn)定。近些年來，由于寡核苷酸適配子(aptamer)較之抗體有諸多優(yōu)點成本低，穩(wěn)定性好，易于修飾等等，因此被作為抗體分子的前景性替代分子，受到很多領(lǐng)域的關(guān)注。SELEX是ー種隨機生物文庫技術(shù)，它利用大容量的隨機寡核苷酸庫(由兩端的固定序列和中間20 40個堿基的隨機序列組成)與靶分子相互作用，從中篩選出與靶分子特異結(jié)合的寡核苷酸，并結(jié)合PCR體外擴增技木，使其得到指數(shù)級富集，如此循環(huán)數(shù)輪，最終進化成為高親和力、高特異性的寡核苷酸配體。適配子與靶物質(zhì)結(jié)合的特異性和親和カ可與抗體媲美，甚至優(yōu)于抗體，加上其技術(shù)上和穩(wěn)定性方面的優(yōu)勢，近10多年來，采用SELEX技術(shù)篩選核酸適配子不斷被應(yīng)用于生命科學各個領(lǐng)域的研究工作中，包括對疾病的診斷與治療。本發(fā)明以常見的副溶血性弧菌為目的靶細菌，利用SELEX技術(shù)獲得了一條能與副溶血性弧菌高親和力，高特異性結(jié)合的寡核苷酸適配子，能夠快速、靈敏、特異的檢測到副溶血性弧菌。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的在于提出特異識別副溶血性弧菌的一條寡核苷酸適配子的序列以及應(yīng)用。本發(fā)明優(yōu)點I)與蛋白類抗體相比，aptamer合成周期短,成本低；aptamer更穩(wěn)定；aptamer可直接體外合成、易于標記，使得操作更為簡單迅速。
2)該序列是從6條均能識別副溶血性弧菌的aptamers中，選出的親和カ最強,特異性最好的一條aptamer,能高親和カ高特異性識別副溶血性弧菌。


圖1VP1-VP6的ニ級結(jié)構(gòu)圖2VP1-VP6解離常數(shù)圖3VP1特異性分析圖
具體實施例方式下面是通過SELEX技術(shù)篩選特異性結(jié)合副溶血性弧菌的寡核苷酸適配子的方法以及快速檢出副溶血性弧菌的應(yīng)用。1、合成隨機單鏈DNA文庫和引物(IDT公司合成)隨機ssDNA文庫5，-ATAGGAGTCACGACGACCAGAA-N40-TATGTGCGTCTACCTCTTGACTAAT-3， 構(gòu)建了長度為87nt的隨機ssDNA文庫，兩端為固定引物序列，中間為40個堿基的隨機序列，庫容量在IO14以上；引物1:5’ -ATAGGAGTCACGACGACCAGAA-3’ ；引物I1:5’ -ATTAGTCAAGAGGTAGACGCACATA-3’，將隨機ssDNA文庫和引物用TE緩沖液配制成100 u mo I/L貯存液_20°C保存?zhèn)溆谩?、BHL液體培養(yǎng)基培養(yǎng)副溶血性弧菌，37 °C搖床培養(yǎng)至對數(shù)生長期(0D_ = 0. 3)，收集菌液1800g 4°C離心5min，棄上清，用IX結(jié)合緩沖液(IXBB) (50mM Tris-HCl (pH7. 4),5mMKCl,100mM NaCl,lmM MgCl2)清洗，去除多余的培養(yǎng)基成分。3、SELEX篩選獲得副溶血性弧菌特異的寡核苷酸適配子I)將ssDNA文庫進行PCR擴增，擴增體系為st印1:ssDNA5 ii L，引物1、II各 5 ii L，含 Mg2+的 dNTP 5 y L，Taq 酶 0. 5 y L，10XPCR buffer 5yL，用無菌超純水補足 50 ii し① 94 0C 5min,② 94 °C 45s,③ 50 °C 45s,④ 72 °C lmin,⑤ go to ②，2times,⑥72°C 5min⑦end。所得PCR產(chǎn)物作為step 2模板，Round 2 :模板I y L，引物1、II各 I U L，含 Mg2+的 dNTP liiL，Taq 酶 0.5 iiL，10XPCR buffer 5yL，用無菌超純水補足 50 ii し① 94 0C 5min,② 94 °C 45s,③ 50 °C 45s,④ 72 °C lmin,⑤ go to ②，30times,⑥72°C 5min⑦end。所得產(chǎn)物即作為第一輪篩選的文庫。在與菌種孵育之前，需將文庫于94°C熱變性8min，立即冰浴lOmin。第一輪篩選的投入量為2nM，第二輪至最后為lOOpmol。2)將 ssDNA 文庫，I X IO8 細菌，tRNA 和 BSA，共 600 y L 室溫孵育 45min，使 ssDNA文庫與細菌充分結(jié)合。3)5000g 4°C離心5min棄上清，用IXBB清洗3次，分離并去除未與細菌結(jié)合的ssDNAo4)將沉淀(即結(jié)合了 ssDNA的細菌)溶于100 y L I XPCR緩沖液中，94°C熱變性8min,立即冰浴IOmin,將結(jié)合上的ssDNA從細菌上解離下來。5)5000g 4°C離心5min取上清，此為第一輪與細菌結(jié)合的ssDNA，將其作為模板進行PCR擴增，擴增產(chǎn)物用作第二輪的篩選。擴增體系為RoundI ssDNA 2yL，引物 II 5 ii L，含 Mg2+的 dNTP I ii L，Taq 酶0. 5u L, 10XPCR buffer 5 y L，用無菌超純水補足 50 y し① 94 °C 5min，② 94 °C 45s，③ 55で 45s，④ 72で 45s，⑤ go to ②，2times，⑥ 72で lmin ⑦ 12で 2min ⑧ end。所得 PCR產(chǎn)物作為 Round2 模板，Round 2 :模板 I y L，引物1、II 各 I y L，含 Mg2+ 的 dNTP I u L，Taq酶 0. L，10XPCR buffer 5 y L，用無菌超純水補足 50 y し① 94°C 5min，② 94°C 45s，③ 55°C 45s，④ 72°C 45s，⑤ go to ②，30times，⑥ 72°C lmin ⑦ 12°C 2min ⑧ end。6)重復(fù)篩選重復(fù)上述篩選過程，共進行9輪篩選。7)富集寡核苷酸適配子文庫的測序結(jié)果與分析a.將最后的富集文庫擴增為雙鏈，連接pUC19-T載體，轉(zhuǎn)化E. coli DH5 a，從90個克隆中隨機挑取26個陽性克隆進行DNA序列測定(分別命名為VP1-VP26)。b.采用DNAMAN軟件對30條序列進行同源性分析，RNAstructure軟件對30條序列進行高級結(jié)構(gòu)分析。c.結(jié)合軟件分析結(jié)果，平均在每個家族選出1-2條結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，能級較低的序列為代表，共6條序列，進行親和力和特異性鑒定。4、利用流式細胞儀對6條序列進行親和カ鑒定I)將上述9條序列及原庫對照送至上海生物工程有限公司合成并在5’標記FAM。FAM-VPl 5，-ataggagtcacgacgaccagaaTAGAGATATGACAGCGGGGAAGGTTAAGAGGCGCTAGGAG tatgtgcgtctacctcttgactaat-3’FAM-VP2 5 ’ -ataggagtcacgacgaccagaaTATTCGTAAAAAACACTGGTACTTTCGCGTAAGTCGTGT°C tatgtgcgtctacctcttgactaat-3’FAM-VP3 5， -ataggagtcacgacgaccagaaCCCGAAGGGTACGGACGTTTGCGGAGTAGTGTACCACAAG tatgtgcgtctacctcttgactaat-3’FAM-VP4 5，-ataggagtcacgacgaccagaaGCGGGCAGCTCCACCGGTAGGCTCCGAGTCATCACGGTCG tatgtgcgtctacctcttgactaat-3’FAM-VP5 5，-ataggagtcacgacgaccagaaTTTTGACGAAGTCAGTGCGTCGAAGCGCAAGCATTACAGA tatgtgcgtctacctcttgactaat-3’FAM-VP6 5，-ataggagtcacgacgaccagaaGGGTAGTGTTGCTGCCCCCGTAGGCAAGGGGAATTGGGCA tatgtgcgtctacctcttgactaat-3’2)利用流式細胞儀進ー步篩選出副溶血性弧菌高親和力的aptamer。a.上述9條FAM標記的aptamer及文庫分別與I X IO8細菌室溫孵育45min,離心棄上清后，將細胞重溶于300 ii L 1XBB，上機檢測；b.用GraphPad Prism 5繪制非線性曲線,得出Kd。5、利用流式細胞儀進行特異性鑒定a.根據(jù)Kd值的結(jié)果，得出與副溶血性弧菌親和力最強的為VPl (Kd =15. 84±0. 61)。下面對這條序列做特異性分析。b. VPl (50nM)分別與大腸桿菌、阪崎桿菌、單增李斯特菌、金黃色葡萄球菌、鼠傷寒沙門氏菌和化膿鏈球菌室溫孵育45min，離心棄上清后，將細胞重懸于300 u L I XBB,上機檢測； 由圖3可得出結(jié)論VP1與4種菌種結(jié)合，流式細胞儀檢測的熒光強度曲線可以明顯將副溶血性弧菌與大腸桿菌、阪崎桿菌、單增李斯特菌、金黃色葡萄球菌、鼠傷寒沙門氏菌和化膿鏈球菌分開，且副溶血性弧菌的熒光強度峰值右移更加明顯，表明VPl可特異性識別副溶血性弧菌。
序列表
<110>江南大學
<120> 一種特異性識別副溶血性弧菌的寡核苷酸適配子的篩選及應(yīng)用 <160> 6
<210〉I <211> 87 <212> DNA <213>人工序列
<220>
<223>由SELEX篩選獲得的寡核苷酸適配子序列 <400> I
ataggagtca cgacgaccag aatagagata tgacagcggg gaaggttaag aggcgctagg 60 agtatgtgcg tctacctctt gactaat
<210>2 く 211>87 く212〉DNA <213>人工序列
<220>
<223>由SELEX篩選獲得的寡核苷酸適配子序列 <400> 2
ataggagtca cgacgaccag aatattcgta aaaaacactg gtactttcgc gtaagtcgtg 60tctatgtgcg tctacctctt gactaat
<210>3 く 211>87 <212〉DNA

<213>人工序列く220〉
<223>由SELEX篩選獲得的寡核苷酸適配子序列く400〉3
ataggagtca cgacgaccag aacccgaagg gtacggacgt ttgcggagta gtgtaccaca 60agtatgtgcg tctacctctt gactaat
<210>4<211>87<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>由SELEX篩選獲得的寡核苷酸適配子序列<400>4
ataggagtca cgacgaccag aagcgggcag ctccaccggt aggctccgag tcatcacggt 60cgtatgtgcg tctacctctt gactaat
<210>5<211>87<212〉DNA<213>人工序列
<220〉
<223>由SELEX篩選獲得的寡核苷酸適配子序列<400>5
aiaggagtca cgacgaccag aattttgacg aagtcagtgc gtcgaagcgc aagcattaca

gatatgtgcg tctacctctt gactaat
<210>6<211>87<212> DNA<213>人工序列
<220〉
<223>由SELEX篩選獲得的寡核苷酸適配子序列<400>6 ataggagtca cgacgaccag aagggtagtg ttgctgcccc cgtaggcaag gggaattggg 60catatgtgcg tctacctctt gactaat
權(quán)利要求
1.一種特異性識別副溶血性弧菌的寡核苷酸適配子及其篩選方法與應(yīng)用，其特征在于所述寡核苷酸適配子的序列如序列表中所示。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的特異識別副溶血性弧菌的寡核苷酸適配子的篩選方法，按照下列步驟進行1)隨機單鏈DNA(ssDNA)文庫的構(gòu)建和引物隨機 ssDNA 文庫5’ -ATAGGAGTCACGACGACCAGAA-N40-TATGTGCGTCTACCTCTTGACTAAT-3’引物1:5’ -ATAGGAGTCACGACGACCAGAA-3’ ；引物 I1:5’ -ATTAGTCAAGAGGTAGACGCACATA-3’，2)PCR擴增隨機ssDNA文庫；3)SELEX篩選副溶血性弧菌的寡核苷酸適配子；4)DNA克隆和測序；5)適配子序列同源性和高級結(jié)構(gòu)分析；6)適配子親和力和特異性鑒定。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的特異識別副溶血性弧菌的寡核苷酸適配子在檢測鼠傷寒沙門氏菌方面的應(yīng)用，其特征在于所述寡核苷酸適配子是體外化學合成的，或是通過PCR或其他分子生物學方法制備的。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及特異性識別副溶血性弧菌的寡核苷酸適配子的篩選和應(yīng)用。通過SELEX技術(shù)獲得了能夠特異性識別副溶血性弧菌的寡核苷酸適配子，接著利用流式細胞儀對適配子的親和力和特異性做了分析，得出親和力最強，特異性最好的識別副溶血性弧菌的寡核苷酸適配子。該適配子在準確、快速、靈敏檢測食品中副溶血性弧菌方面具有廣泛的應(yīng)用前景。
文檔編號C12N15/10GK103031306SQ20111029137
公開日2013年4月10日 申請日期2011年9月30日 優(yōu)先權(quán)日2011年9月30日
發(fā)明者王周平, 段諾, 吳世嘉 申請人:江南大學