專(zhuān)利名稱(chēng)：抗白斑綜合征病毒的轉(zhuǎn)基因藻株及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體地說(shuō)涉及一種抗白斑綜合征病毒的轉(zhuǎn)基因藻株的制備方法，同時(shí)還涉及該轉(zhuǎn)基因藻株作為藥物和飼料(或飼料添加劑)在實(shí)際生產(chǎn)中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
白斑綜合征病毒(White Spot Syndrome Virus, WSSV)是當(dāng)前對(duì)蝦養(yǎng)殖業(yè)中毒力最強(qiáng)、傳播速度最快、致死率最高的病原體。近年的研究表明，VP28和VP19是WSSV兩種重要的囊膜蛋白，二者在病毒感染宿主時(shí)起著非常關(guān)鍵的作用。有研究表明WSSV
囊膜蛋白基因經(jīng)原核系統(tǒng)(如大腸桿菌)和真核系統(tǒng)(如酵母、家蠶等宿主)表達(dá)后，其表達(dá)產(chǎn)物具有和天然蛋白相似的生化性質(zhì)和免疫學(xué)活性，對(duì)蝦體具有很好的免疫刺激效果。如果把VP^和VP19蛋白直接作為疫苗對(duì)蝦體進(jìn)行口服免疫，能夠顯著提高宿主對(duì)WSSV的抵抗力，免疫效果較為明顯。有研究者進(jìn)行了 VP^+VP19 二者基因融合表達(dá)的研究，表達(dá)的融合蛋白比單獨(dú)蛋白免疫效果更加明顯，能夠達(dá)到約65%-100%的保護(hù)率。目前，能夠用于外源基因表達(dá)的載體系統(tǒng)非常多，如轉(zhuǎn)基因植物、轉(zhuǎn)基因動(dòng)物、動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)、修飾和改造的微生物系統(tǒng)等等。在這些系統(tǒng)中，由于轉(zhuǎn)基因動(dòng)物和動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)的成本昂貴、蛋白質(zhì)產(chǎn)物易受到污染、且純化困難和難以規(guī)模化等缺點(diǎn)，限制了二者系統(tǒng)的應(yīng)用。轉(zhuǎn)基因植物雖具有規(guī)?；a(chǎn)和功能性蛋白質(zhì)修飾的優(yōu)點(diǎn)，但其本身和表達(dá)產(chǎn)物易造成對(duì)環(huán)境的污染，造成該系統(tǒng)也存在一定的限制。當(dāng)前應(yīng)用較為廣泛的隸屬微生物表達(dá)系統(tǒng)，該表達(dá)系統(tǒng)能夠克服以上表達(dá)系統(tǒng)的不足，但在原核微生物系統(tǒng)(如細(xì)菌)不能進(jìn)行功能性蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)錄和翻譯后修飾，且表達(dá)產(chǎn)物易形成不溶性的包涵體，也使得原核表達(dá)系統(tǒng)的應(yīng)用得到了限制。動(dòng)、植物病毒載體系統(tǒng)由于存在向外界環(huán)境散毒的可能性，且成本高和目的蛋白純化難度大，也存在一定的局限性。為此，為了能避免以上載體系統(tǒng)存在的不足，并且能夠獲得大量的蛋白產(chǎn)物，新型鹽藻生物反應(yīng)器的建立為表達(dá)WSSV 囊膜蛋白提供了最為理想的結(jié)合點(diǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的在于提供一種抗白斑綜合征病毒的轉(zhuǎn)基因藻株。本發(fā)明另一目的在于提供一種轉(zhuǎn)基因藻株作為藥物在預(yù)防或治療白斑綜合征病毒中的應(yīng)用。本發(fā)明再一目的在于提供一種轉(zhuǎn)基因藻株作為飼料或飼料添加劑在甲殼類(lèi)動(dòng)物養(yǎng)殖中的應(yīng)用。為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明的技術(shù)方案在于提供一種抗白斑綜合征病毒的轉(zhuǎn)基因藻株，該轉(zhuǎn)基因藻株是由將抗白斑綜合征病毒的基因插入真核表達(dá)載體中構(gòu)成的重組質(zhì)粒再轉(zhuǎn)化至鹽藻細(xì)胞中得到。本發(fā)明的技術(shù)方案還在于提供一種表達(dá)抗WSSV的囊膜蛋白基因的鹽藻株的制備方法，步驟如下
DffSSV囊膜蛋白基因的制備取感染wssv的病料利用低溫超速離心法進(jìn)行病毒的提純，得到完整WSSV，采用病毒核酸提取試劑盒提取病毒核酸，根據(jù)VP^與vpl9的序列分別設(shè)計(jì)引物，以DNA作為模板，采用PCR發(fā)分別擴(kuò)增得到VP^、VP19及VP^+VP19融合基因的基因片段；
2)含WSSV囊膜基因真核表達(dá)載體的構(gòu)建將克隆得到的囊膜蛋白基因VP^、VP19和 VP^+VP19等基因分別與克隆載體連接，通過(guò)酶切鑒定和測(cè)序鑒定后獲得正確的基因片段， 然后連接到真核表達(dá)載體上，經(jīng)酶切和測(cè)序鑒定正確后，成功構(gòu)建重組表達(dá)載體；
3)將構(gòu)建好的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化鹽藻細(xì)胞將構(gòu)建好的重組質(zhì)粒通過(guò)玻璃珠轉(zhuǎn)化法、基因槍法、電擊法、脂質(zhì)體介導(dǎo)法和超聲波導(dǎo)入法轉(zhuǎn)化鹽藻細(xì)胞，轉(zhuǎn)化后進(jìn)行選擇培養(yǎng)獲得陽(yáng)性轉(zhuǎn)化株；
4)穩(wěn)定表達(dá)抗白斑綜合征病毒基因的轉(zhuǎn)基因鹽藻株的篩選與鑒定提取轉(zhuǎn)基因鹽藻的基因組DNA和RNA，對(duì)目的基因進(jìn)行PCR和RT-PCR擴(kuò)增，以鑒定目的基因整合與表達(dá)狀態(tài)。 并利用western blot技術(shù)對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行活性和產(chǎn)量的分析。本發(fā)明利用鹽藻作為反應(yīng)器，使其優(yōu)點(diǎn)進(jìn)而得以利用。鹽藻是生活在咸水中的一種單細(xì)胞真核藻類(lèi)，其自身具有許多其它反應(yīng)器無(wú)法比擬的優(yōu)點(diǎn)，如1)鹽藻本身營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)豐富富含β-胡蘿卜素、維生素和蛋白質(zhì)等成份，具有極高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和醫(yī)用價(jià)值；2) 鹽藻本身無(wú)毒無(wú)害經(jīng)過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床驗(yàn)證表明，鹽藻本身無(wú)毒無(wú)害，可直接作為天然保健品得以應(yīng)用，用以提高機(jī)體免疫力和抵抗力；3)鹽藻培養(yǎng)經(jīng)濟(jì)廉價(jià)鹽藻屬于光能自養(yǎng)型生物，其培養(yǎng)不需要昂貴的培養(yǎng)基和儀器設(shè)備，可直接采用開(kāi)放式培養(yǎng)，且無(wú)季節(jié)性生長(zhǎng)限制，生產(chǎn)成本低；4)鹽藻遺傳操作簡(jiǎn)單鹽藻沒(méi)有細(xì)胞壁，是一種天然的原生質(zhì)體，利于外源基因的遺傳轉(zhuǎn)化操作；5)鹽藻具有轉(zhuǎn)錄和翻譯后對(duì)蛋白的加工能力鹽藻屬于真核生物，具有轉(zhuǎn)錄和翻譯后對(duì)蛋白的加工能力，能產(chǎn)生近天然的高活性蛋白，且不需要對(duì)下游產(chǎn)物進(jìn)行多余的加工和分離純化，這是大腸桿菌及其它原核生物表達(dá)系統(tǒng)所無(wú)法比擬的；6) 鹽藻培養(yǎng)安全可靠鹽藻是生活在高鹽條件下的一種天自然生物，不會(huì)對(duì)環(huán)境造成污染； 同時(shí)在高鹽條件下培養(yǎng)，避免了其它微生物的污染，適合進(jìn)行大規(guī)模工業(yè)化開(kāi)放性生產(chǎn)，為此，可以利用鹽藻此種新型生物反應(yīng)器進(jìn)行外源性蛋白的表達(dá)或生產(chǎn)。本發(fā)明利用鹽藻與對(duì)蝦、WSSV三者之間存在著巧妙的天然聯(lián)系wssv感染對(duì)蝦宿主，對(duì)蝦又可直接以鹽藻作為餌料，而鹽藻又是一個(gè)理想的綠色表達(dá)系統(tǒng)，能夠表達(dá)WSSV 的囊膜蛋白基因。與此同時(shí)，鹽藻和對(duì)蝦同屬相同的水體環(huán)境，表達(dá)產(chǎn)物無(wú)需提純便可直接投喂，節(jié)省了很多后續(xù)工作，避免了注射和藥物浸泡的不利影響，使免疫效果發(fā)揮更佳。本發(fā)明的技術(shù)方案還在于提供一種轉(zhuǎn)基因藻株作為藥物在預(yù)防或治療白斑綜合征病毒中的應(yīng)用。制備的轉(zhuǎn)基因藻株不需要加工提純，直接作為活體疫苗投喂蝦體，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示陽(yáng)性對(duì)照組累計(jì)死亡率達(dá)到100%，而樣品實(shí)驗(yàn)組累計(jì)死亡率約為30%，說(shuō)明轉(zhuǎn)基因藻株作為疫苗的有效保護(hù)效率達(dá)到70%之高，明顯提高了對(duì)抗WSSV的感染力。本發(fā)明的技術(shù)方案還在于提供一種轉(zhuǎn)基因鹽藻株作為飼料或飼料添加劑在甲殼類(lèi)動(dòng)物養(yǎng)殖中的應(yīng)用，為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的，采用以下技術(shù)方案將該轉(zhuǎn)基因藻株直接作為飼(餌)料及飼料添加劑(飼料組份)添加到任何一種養(yǎng)殖飼料中去；也可以對(duì)鹽藻體經(jīng)過(guò)干燥、濃縮、粉碎、制粒和與其它營(yíng)養(yǎng)成分混合等加工后，添加到甲殼類(lèi)動(dòng)物養(yǎng)殖用飼料中。添加量為0. 5-5%，添加形態(tài)可以為固體(粉劑、顆粒劑等)、半固體(糊劑、丸劑)和液體(流體) 等形式。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)基因鹽藻株其能夠明顯提高機(jī)體的免疫力和抵抗力，抗病力增強(qiáng)，體色明顯鮮亮、自然光澤，肉質(zhì)細(xì)嫩，口感好。本發(fā)明的優(yōu)勢(shì)和有益效果
1、本發(fā)明巧妙的利用了鹽藻與對(duì)蝦、WSSV三者之間存在的天然內(nèi)在聯(lián)系wssv感染對(duì)蝦，對(duì)蝦以鹽藻作為餌料，而餌料鹽藻又是一個(gè)理想的綠色表達(dá)系統(tǒng)，且三者同屬相同的水體環(huán)境。為此，利用鹽藻細(xì)胞作為表達(dá)系統(tǒng)能夠穩(wěn)定表達(dá)外源基因外，其自身的優(yōu)點(diǎn)同時(shí)得以利用，制備得到的轉(zhuǎn)基因藻株可以起到“一株多用”的效果。2、本發(fā)明所制備的口服活體疫苗是利用WSSV VP28和VP19囊膜蛋白基因作為基礎(chǔ)，二者編碼的蛋白起到亞單位疫苗的作用，可以封閉病毒在細(xì)胞表面的受體，起到抗病毒感染的作用；同時(shí)，利用WSSV VP^+VP19融合基因表達(dá)形式，對(duì)蝦體的免疫保護(hù)作用大大提高，免疫效果更強(qiáng)；
3、本發(fā)明利用新型鹽藻生物反應(yīng)器作為表達(dá)載體，制備得到的轉(zhuǎn)基因藻株不需要加工提純，可直接作為活體疫苗投喂蝦體，避免了注射和藥物浸泡等給藥方式的不利影響，使得該種口服疫苗較其它單一疫苗的免疫效果更佳，抗病毒保護(hù)作用更強(qiáng)；
4、本發(fā)明所制備的活體疫苗能夠采用天然開(kāi)放式工廠養(yǎng)殖，規(guī)模大，產(chǎn)量高，并且不受外界微生物污染的影響，其成本低廉、不會(huì)對(duì)環(huán)境造成散毒等污染、安全性好等優(yōu)點(diǎn)；
5、本發(fā)明制備的轉(zhuǎn)基因藻株既可以作為疫苗得以應(yīng)用，又可作為一種能夠改善水產(chǎn)動(dòng)物養(yǎng)殖的一種天然綠色飼(餌)料及飼(餌)料添加劑，在甲殼類(lèi)動(dòng)物養(yǎng)殖業(yè)和相關(guān)飼料加工業(yè)等領(lǐng)域也得以應(yīng)用，該添加劑無(wú)任何毒副殘留、無(wú)抗藥性、環(huán)保、營(yíng)養(yǎng)豐富、來(lái)源穩(wěn)定、產(chǎn)量高，可提高動(dòng)物的抵抗力和肉質(zhì)品質(zhì)等諸多優(yōu)點(diǎn)。


圖1 WSSV VP28基因PCR結(jié)果，左側(cè)為兩個(gè)重復(fù)的PCR產(chǎn)物樣品，最右側(cè)為分子量 2000 Marker ；
圖2為WSSV VP28基因轉(zhuǎn)化鹽藻細(xì)胞真核表達(dá)載體結(jié)構(gòu)示意圖； 圖3為采用固體篩選培養(yǎng)基對(duì)轉(zhuǎn)化細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，采用固體篩選培養(yǎng)基對(duì)轉(zhuǎn)化細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，直至陽(yáng)性單藻落出現(xiàn)，左側(cè)培養(yǎng)皿為陰性對(duì)照生長(zhǎng)情況，即將未轉(zhuǎn)化的野生型鹽藻細(xì)胞涂布于固體篩選培養(yǎng)基上，無(wú)單藻落出現(xiàn)；右為陽(yáng)性藻落的生長(zhǎng)情況，即轉(zhuǎn)化后的細(xì)胞涂布于固體篩選培養(yǎng)基上，可見(jiàn)有多個(gè)單藻落的出現(xiàn)；
圖4為對(duì)陽(yáng)性轉(zhuǎn)化株進(jìn)行目的片段VP^的PCR擴(kuò)增鑒定，最左側(cè)泳道為分子量 10000 Marker ；次左側(cè)泳道為陰性對(duì)照，沒(méi)有可見(jiàn)條帶的出現(xiàn)；最右側(cè)泳道為分子量2000 Marker ；剩余泳道為陽(yáng)性轉(zhuǎn)化株的PCR擴(kuò)增結(jié)果，均有符合目的基因的條帶出現(xiàn)； 圖5采用口服活體疫苗方式投喂蝦體后蝦體的累計(jì)死亡率； 圖6轉(zhuǎn)基因鹽藻株經(jīng)加工后投喂蝦體后蝦體的累計(jì)死亡率。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1 WSSV囊膜蛋白基因的制備 DWSSV的基因組的制備取WSSV感染病蝦組織，采用30-65%蔗糖濃度，進(jìn)行常規(guī)低溫梯度離心法提純WSSV，提純后進(jìn)行電鏡觀察鑒定病毒純度和完整性。取純化病毒加入適量TE緩沖液，用蛋白酶K在 65°C消化IOmin后，再加入1/10體積NaAc，用等體積酚和氯仿分別抽提一次后，用冷無(wú)水乙醇沉淀，然后加入少許TE溶解，即得到純凈的WSSV的DNA。
2) WSSV囊膜基因Vp^基因的擴(kuò)增
根據(jù)GenBank中已發(fā)表的vp^與vpl9的序列設(shè)計(jì)引物，其中vp^的上游引物pi :5’ TCTAGAATGGATCTTTCTTTCACTCTTTC 3，，下游引物 p2 5，GGATCCAATTGCTCGGTCTCAGTGCCAG
3，，上下游引物分別引入XbCl 1 .和Bamli 1，下劃線所指。以上述提取的WSSV的DNA
為模板PCR擴(kuò)增vp^，PCR的擴(kuò)增體系及反應(yīng)條件如下 IOXTaq buffer
MgCl2 (25mM) dNTP (25mM) pi (25μΜ) p2 (25 μ 1M) DNA模板
Taq 酶(5U/y 1) 加無(wú)菌水至終體積 PCR反應(yīng)程序
權(quán)利要求
1.一種抗白斑綜合征病毒的轉(zhuǎn)基因藻株，其特征在于將白斑綜合征病毒囊膜基因插入到真核表達(dá)載體中，構(gòu)建的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至鹽藻細(xì)胞中得到轉(zhuǎn)基因藻株。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗白斑綜合征病毒的轉(zhuǎn)基因藻株，其特征在于所述的白斑綜合征病毒的囊膜基因?yàn)閂P^基因、VP19基因或由VP^基因與VP19基因構(gòu)成的融合基因。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗白斑綜合征病毒的轉(zhuǎn)基因藻株，其特征在于所述的真核表達(dá)載體為能夠轉(zhuǎn)化至鹽藻細(xì)胞中的載體，并在鹽藻細(xì)胞中得以表達(dá)。
4.一種如權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)所述抗白斑綜合征病毒的轉(zhuǎn)基因藻株的制備方法，其特征在于所述的制備方法如下DWSSV囊膜蛋白基因的制備取感染W(wǎng)SSV的病料利用低溫超速離心法進(jìn)行病毒的提純，得到完整WSSV，采用病毒核酸提取試劑盒提純病毒核酸，根據(jù)VP^與vpl9的序列分別設(shè)計(jì)特異性引物，以病毒核酸作為模板，采用PCR方法分別擴(kuò)增出VP^、VP19和VP^+VP19 融合基因基因片段；2)含有WSSV囊膜基因的真核表達(dá)載體的構(gòu)建將克隆得到的囊膜蛋白基因VP^、VP19 和VP^+VP19基因片段分別與克隆載體連接，通過(guò)酶切鑒定和測(cè)序鑒定后獲得正確的基因序列，然后將該序列連接到真核表達(dá)載體PBI-上，經(jīng)酶切鑒定正確后，成功構(gòu)建轉(zhuǎn)化鹽藻細(xì)胞的真核表達(dá)載體；3)將構(gòu)建好的重組載體轉(zhuǎn)化鹽藻細(xì)胞將構(gòu)建好的重組質(zhì)粒通過(guò)玻璃珠轉(zhuǎn)化法、基因槍法、電擊法、脂質(zhì)體介導(dǎo)法或超聲波導(dǎo)入法轉(zhuǎn)化鹽藻細(xì)胞，轉(zhuǎn)化后經(jīng)選擇培養(yǎng)基篩選培養(yǎng)，獲得陽(yáng)性轉(zhuǎn)化株；4)穩(wěn)定表達(dá)WSSV囊膜基因轉(zhuǎn)化藻株的篩選與鑒定提取轉(zhuǎn)基因藻株的基因組DNA 和RNA，對(duì)目的基因進(jìn)行PCR和RT-PCR擴(kuò)增，以期鑒定目的基因整合與表達(dá)狀態(tài)，并利用 western blot技術(shù)對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行活性和產(chǎn)量的分析。
5.一種如權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)所述抗白斑綜合征病毒的轉(zhuǎn)基因藻株作為藥物在預(yù)防或治療白斑綜合征病毒中的應(yīng)用。
6.一種如權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)所述抗白斑綜合征病毒的轉(zhuǎn)基因藻株作為飼料及飼料添加劑在甲殼類(lèi)動(dòng)物養(yǎng)殖中的應(yīng)用。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于所述的甲殼類(lèi)動(dòng)物為甲殼類(lèi)物種，包括通常稱(chēng)為“蝦”、“螃蟹”、“龍蝦”、“蜊蛄”和其它甲殼類(lèi)動(dòng)物。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種抗白斑綜合征病毒的轉(zhuǎn)基因藻株及其制備方法和應(yīng)用。本發(fā)明巧妙的利用了蝦、WSSV和鹽藻細(xì)胞三者之間存在的天然聯(lián)系WSSV感染蝦、蝦以鹽藻為餌料、鹽藻細(xì)胞又是一個(gè)綠色的表達(dá)系統(tǒng)，能夠表達(dá)生產(chǎn)外源蛋白。通過(guò)基因工程手段克隆得到WSSV囊膜蛋白基因，即VP19、VP28，分別構(gòu)建重組質(zhì)粒pBI-VP28、pBI-VP19及pBI-VP28+VP19，將構(gòu)建好的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至鹽藻細(xì)胞中，篩選培養(yǎng)出穩(wěn)定表達(dá)病毒囊膜蛋白的轉(zhuǎn)化藻株，以該轉(zhuǎn)基因藻株作為活體餌料直接投喂蝦體，提高對(duì)蝦體的免疫保護(hù)作用。本發(fā)明制備得到的轉(zhuǎn)基因藻株，能穩(wěn)定表達(dá)活性蛋白，蛋白不需要提取，直接作為活體疫苗投喂蝦體，操作方便，成本低，安全無(wú)毒，免疫效果強(qiáng)。
文檔編號(hào)C12N1/13GK102443543SQ20111029873
公開(kāi)日2012年5月9日 申請(qǐng)日期2011年10月8日 優(yōu)先權(quán)日2011年10月8日
發(fā)明者馮書(shū)營(yíng), 馮文坡, 宋霄薇, 景愛(ài)華, 李三強(qiáng), 李?lèi)?ài)芳, 薛樂(lè)勛, 薛云, 麻開(kāi)旺, 黃倢 申請(qǐng)人:河南科技大學(xué)