專利名稱：用于同時檢測副溶血弧菌和溶藻弧菌的多重pcr引物及其設(shè)計方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及副溶血弧菌和溶藻弧菌檢測領(lǐng)域，具體涉及一種用于同時檢測副溶血弧菌和溶藻弧菌的多重PCR引物及其設(shè)計方法。
背景技術(shù)：
副溶血性弧菌和溶藻弧菌均屬弧菌科弧菌屬，是通過食物、水傳播的病原菌。溶藻弧菌和副溶血性弧菌具有相似的生物學(xué)特性和同樣的致病性，均可引起腹瀉和食物中毒。副溶血弧菌最早是由Fujino等于1953年從日本一個食物中毒患者初次分離得到的，又稱嗜鹽菌，該菌因在含食鹽較濃(3%-4%以上)的培養(yǎng)基中能生長，而在不含鹽的培養(yǎng)基內(nèi)不能繁殖而得名。副溶血弧菌分布于世界各地，通常存在于海灣和海岸線區(qū)域以及海產(chǎn)品中，人多因食用污染本菌又未經(jīng)良好加工的海產(chǎn)品如蟹類、牡蠣！蝦等而引起食物中毒。副溶血弧菌引起的食物中毒，在細(xì)菌性食物中毒中占的比例很高，其危害僅次于沙門氏菌、大腸桿菌、葡萄球菌和肉毒梭菌。我國沿海地區(qū)每年都有因副溶血性弧菌引起食物中毒的報道。人中毒后的基本癥狀包括腹泄(呈水樣便或血樣便)、腹部痙攣、惡心、嘔吐和頭疼，也曾有發(fā)燒和發(fā)冷的報道，但較少。溶藻弧菌屬專性嗜鹽性弧菌，其致病性主要是引起腸道外感染。近年來，國內(nèi)外報道溶藻弧菌引起急性腹瀉和食物中毒病例日益增多。溶藻弧菌廣泛分布于自然界，尤其以海產(chǎn)品攜帶率最高，是引起細(xì)菌性食物中毒的一種重要致病菌。目前細(xì)菌性食物中毒在食源性疾病發(fā)病率中仍占較高的比率。沿海一帶由于人們喜食海產(chǎn)品，因此溶藻弧菌食物中毒發(fā)病率較高。世界上各個國家食品衛(wèi)生法規(guī)中均把該菌列入法定檢測項目，一經(jīng)發(fā)現(xiàn)禁止進(jìn)口和出口。目前，美國和歐盟對進(jìn)口水產(chǎn)品都強(qiáng)制性要求進(jìn)行副溶血弧菌的檢測，檢驗結(jié)果為陰性方可通關(guān)，否則出口的水產(chǎn)品將被全部自動扣留或就地銷毀。這給我國水產(chǎn)品的出口設(shè)置了技術(shù)壁壘。因此，出口水產(chǎn)品加工廠認(rèn)真貫徹HACCP計劃，加強(qiáng)對副溶血弧菌的檢測，檢疫部門加強(qiáng)對工廠落實HACCP計劃情況的監(jiān)管和對出口水產(chǎn)品的檢驗就顯得尤其重要。目前，國內(nèi)對于副溶血性弧菌的檢測已經(jīng)有了相應(yīng)的國家標(biāo)準(zhǔn)和行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，方法大致分為以下幾個過程⑴前增菌；⑵選擇性增菌；⑶選擇性培養(yǎng)；⑷生化鑒定；(5) 神奈川現(xiàn)象和血清學(xué)實驗。檢驗過程需要5cT6d才能報告陽性結(jié)果。檢驗方法繁瑣，費(fèi)時費(fèi)力，不僅影響檢驗機(jī)構(gòu)的工作效率，而且使生產(chǎn)部門的產(chǎn)品運(yùn)輸和倉儲時間延長，生產(chǎn)成本加大。而對于溶藻弧菌的檢測還沒有建立相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)，只是參照副溶血性弧菌的檢測方法。因此，建立建立簡便、快速的檢測方法非常必要。聚合酶連是反應(yīng)(Polymerase Chain Reaction,簡稱PCR)是一種體外快速擴(kuò)增 DNA的方法，用于放大特定的DNA片段，數(shù)小時內(nèi)可使目的基因片段擴(kuò)增到數(shù)百萬個拷貝的分子生物學(xué)技術(shù)。一個反應(yīng)常有25-35個循環(huán)，一個循環(huán)包含3個步驟，首先使模板DNA雙鏈在94-95°C變性為單鏈，然后在較低溫度下，使引物與模板結(jié)合，接著在引物的引導(dǎo)及 Taq酶的作用下，于72°C合成模板DNA互補(bǔ)鏈?？煽醋魃矬w外的特殊DNA復(fù)制。一般PCR 僅應(yīng)用一對引物，通過PCR擴(kuò)增產(chǎn)生一個核酸片段。多重PCR，又稱多重引物PCR或復(fù)合 PCR，它是在同一 PCR反應(yīng)體系里加上二對以上引物，同時擴(kuò)增出多個核酸片段的PCR反應(yīng)， 其反應(yīng)原理，反應(yīng)試劑盒操作過程與一般PCR相同。多重PCR是在普通PCR的基礎(chǔ)上加以改造，于一個PCR反應(yīng)體系中加多對特異性引物，針對多個DNA模板或同一模板的不同區(qū)域擴(kuò)增多個目的片段的PCR技術(shù)。多重PCR在一次反應(yīng)中就能同時擴(kuò)增一個基因的多個靶序列。多重PCR最先是在1988年就被Chamberlain所提出，在這短短22個年頭之內(nèi)，它已經(jīng)在DNA檢測的多個領(lǐng)域得到成功的應(yīng)用。具體包括檢測基因突變、缺失等多態(tài)，定量PCR， 反轉(zhuǎn)錄PCR。Henegariu在1997年設(shè)計出了多重PCR步步優(yōu)化協(xié)議，指導(dǎo)怎樣多重PCR的反應(yīng)體系。但是多重PCR最大的問題還是存在于引物的設(shè)計上。和一般PCR相比較，多重 PCR在同一 PCR反應(yīng)管內(nèi)同時擴(kuò)增出多個病原的基因片段，一次完成多個模板的擴(kuò)增。多重PCR的系統(tǒng)性主要體現(xiàn)在它能夠根據(jù)需求一次性擴(kuò)增出所有的相關(guān)基因。在本發(fā)明中， 在統(tǒng)一反應(yīng)管內(nèi)同時檢出副溶血弧菌和溶藻弧菌，將大大節(jié)省時間，節(jié)省試劑，節(jié)約經(jīng)費(fèi)開支，為臨床提供更多更準(zhǔn)確的診斷信息。由于多重PCR的引物設(shè)計要求總體上跟一般PCR的引物是一致的。如引物本身不能有穩(wěn)定二級結(jié)構(gòu)(發(fā)夾和二聚體)，引物之間也不能有穩(wěn)定的二級結(jié)構(gòu)等。但是多重PCR要將兩對以上的引物放在一起，并且擴(kuò)增出所有的目的片段， 這對引物又提出了更高的要求，對引物之間的相互作用要求更加嚴(yán)格。因為經(jīng)常是擴(kuò)增目的各引物單獨擴(kuò)增的時候都能很好的工作，擴(kuò)增出條帶清晰的目的片段，但是混在一起的時候就出現(xiàn)條帶丟失現(xiàn)象。各引物之間還存在競爭關(guān)系，強(qiáng)勢引物可能掩蓋弱勢引物，導(dǎo)致片段丟失。更有甚者，引物相互作用產(chǎn)生嚴(yán)重的引物二聚體，根本擴(kuò)增不出一條目的片段。多重PCR檢測技術(shù)在一次反應(yīng)中就能同時擴(kuò)增一個模板的不同區(qū)域擴(kuò)增多個目的片段的PCR技術(shù)。以其快速、高效，特異性好、靈敏度高的特點，在食品病原微生物、非致病微生物及環(huán)境微生物檢測中具有重要作用；但多重PCR在提高食品微生物檢測靈敏度、 去除食品抑制因子的干擾，提高衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)及加強(qiáng)技術(shù)人員水平上仍有許多問題需要解決。 多重PCR改進(jìn)技術(shù)簡化了食品微生物檢測過程、縮短檢測時間、降低檢測成本同時提高了食品微生物檢測的靈敏度；但是多重PCR的改進(jìn)技術(shù)也存在一定問題。未來的研究主要集中在改進(jìn)樣品前處理技術(shù)、去除食品抑制因子干擾，其次是多重PCR與其它技術(shù)的整合應(yīng)用，如多重PCR與變性梯度凝膠電泳、基因芯片、熒光探針定量技術(shù)、免疫磁珠吸附等技術(shù)結(jié)合應(yīng)用，進(jìn)一步提高食品微生物檢測的靈敏度、可重復(fù)性，實現(xiàn)大批量食品檢測、復(fù)雜樣品基質(zhì)中的多種微生物的有效檢測、食品微生物檢測的標(biāo)準(zhǔn)化，必將在未來食品微生物檢測中有非常好的應(yīng)用前景。PCR是一種模擬體內(nèi)DNA復(fù)制過程的技術(shù)，由于具有快速、特異和敏感等特點，近年來在豬病診斷上得到廣泛應(yīng)用。多重PCR是一種特殊PCR形式，比單一 PCR反應(yīng)更快捷、 更節(jié)約，其最突出的特點，即一次PCR反應(yīng)，可同時檢測、鑒別出多種病原體，在臨床混合感染的鑒別診斷上具有其獨特優(yōu)勢和很高的使用價值。多重PCR技術(shù)的應(yīng)用，可大大減少檢測成本，可大大減少工作量，適應(yīng)于口岸快速檢測的需要，是一種準(zhǔn)確、可靠、科學(xué)的分子生物學(xué)方法。有鑒于此，盡快開發(fā)一種用于同時檢測副溶血弧菌和溶藻弧菌的多重PCR勢在必行。這對于加強(qiáng)進(jìn)出口水產(chǎn)品中弧菌的快速檢驗檢疫、水產(chǎn)養(yǎng)殖病害的調(diào)查和防治、無公害水產(chǎn)品檢測和生產(chǎn)以及水產(chǎn)品衛(wèi)生質(zhì)量監(jiān)督檢驗等方面都具有十分重要的意義。

發(fā)明內(nèi)容
為了解決快速檢測進(jìn)出口水生動物及其產(chǎn)品中的副溶血弧菌和溶藻弧菌，本發(fā)明提供一種用于同時檢測副溶血弧菌和溶藻弧菌的多重PCR引物及其設(shè)計方法，該P(yáng)CR引物在同時檢測副溶血弧菌和溶藻弧菌的應(yīng)用中具有簡單、靈敏、快速、特異的優(yōu)點。為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的解決方案如下
用于同時檢測副溶血弧菌和溶藻弧菌的多重PCR引物，副溶血弧菌引物對應(yīng)的PCR擴(kuò)增片段大小為208 bp，溶藻弧菌引物對應(yīng)的PCR擴(kuò)增片段大小為159 bp，具體引物序列如下
V.para. (ToxR)Fl :5，- CGAAAGCCGTATACTCCTGATG -3， V. para. (ToxR) Rl :5，- GAGTTGATAGCCTCGTTTTGGA -3， V.algi. (ToxR) Fl :5，- GATCGTTTTGACCTGCGAAA -3， V. algi. (ToxR) Rl :5，- GCATTGAGCGCTACGTGAA -3，。備注在本專利文本中，V. para.為副溶血弧菌的英文縮寫，V. algi.為溶藻弧菌的英文縮寫-X para. (ToxR) Fl和V. para. (ToxR) Rl為根據(jù)副溶血弧菌ToxR基因設(shè)計的上游引物Fl和下游引物Rl ;V. algi. (ToxR)Fl和V. algi. (ToxR) Rl為根據(jù)溶藻弧菌 ToxR基因設(shè)計的上游引物Fl和下游引物R1。用于同時檢測副溶血弧菌和溶藻弧菌的多重PCR引物設(shè)計方法，該方法包括以下步驟
步驟1，利用引物設(shè)計軟件設(shè)計同時檢測副溶血弧菌和溶藻弧菌的多重PCR引物組合， 所形成的引物組合所包含的引物堿基數(shù)為20- M個，引物的熔解溫度Tm值為56°C-63°C， 引物的GC%為40%-60% ；
步驟2，對引物組合中的引物進(jìn)行篩選，保留不能合成引物二聚體的引物； 步驟3，判斷所保留引物的競爭優(yōu)劣狀態(tài)，將上述所保留引物的堿基數(shù)進(jìn)行比較，當(dāng)引物的堿基數(shù)均相同且內(nèi)側(cè)引物的GC%小于外側(cè)引物的GC%，或者當(dāng)引物的堿基數(shù)不完全相同且內(nèi)側(cè)引物的堿基數(shù)比外側(cè)引物少一個堿基時，判斷為競爭狀態(tài)劣引物，進(jìn)行步驟4 ；否則判斷為競爭狀態(tài)優(yōu)引物，進(jìn)行步驟5 ；
步驟4，再次篩選競爭狀態(tài)劣的引物，具體步驟為重復(fù)步驟2，對所保留的引物按照步驟3進(jìn)行再次判斷；
步驟5，利用PCR方法對競爭狀態(tài)優(yōu)引物進(jìn)行擴(kuò)增； 步驟6，去除擴(kuò)增引物中的劣引物，獲得多重PCR引物。步驟1中，所述所用的引物設(shè)計軟件為Primer2. 0,Primer5. O或01igo6. O。所述多重PCR引物組合的熔解溫度Tm值為60°C。步驟1中，所述不能形成引物二聚體的引物的堿基數(shù)目為22或23。步驟2中，所述對引物組合中的引物進(jìn)行篩選，具體為對所用的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，篩選擴(kuò)增效果最好的引物組合。步驟5中，所述PCR方法的富集階段的退火溫度為60_65°C，標(biāo)記階段為94°C變性，72°C退火延伸的兩步PCR，擴(kuò)增階段的退火溫度為50-60°C。本發(fā)明的有益效果如下
采用本項目建立的多重PCR技術(shù)同時檢測副溶血弧菌和溶藻弧菌的方法，具有操作簡便、快速，特異性強(qiáng)，靈敏度高等優(yōu)點，只需一個PCR反應(yīng)就可同時檢測出副溶血弧菌和溶藻弧菌，通過應(yīng)用該方法對進(jìn)口冷凍帶魚、魷魚和墨魚，活甲魚、甲魚蛋、螃蟹和蝦等100份樣品的檢測，同時與常規(guī)方法檢測進(jìn)行比較。多重PCR方法檢測出3份樣品為副溶血弧菌陽性和5份溶藻弧菌陽性，與常規(guī)細(xì)菌分離鑒定結(jié)果完全吻合。該方法的成功研制，大大加快了副溶血弧菌和溶藻弧菌的檢測。采用本發(fā)明多重PCR技術(shù)同時檢測副溶血弧菌和溶藻弧菌的方法，具有簡單、靈敏、快速、特異等優(yōu)點，能大大方便口岸進(jìn)出口貨物的通關(guān)速度。這對于預(yù)防和控制我國水產(chǎn)品安全具有重要的現(xiàn)實意義。目前未見國內(nèi)外利用該技術(shù)檢測進(jìn)出口水生動物及其產(chǎn)品中副溶血性弧菌和溶藻弧菌的報道，該技術(shù)有望為出入境副溶血性弧菌的檢測提供一種快速靈敏、簡便可靠的方法，特別適合口岸檢疫部門實施快速驗放需要。


下面結(jié)合附圖和具體實施方式
對本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)描述，但附圖和具體實施方式
不應(yīng)理解為是對本發(fā)明進(jìn)行的限定。圖1是本發(fā)明實施例3中多重PCR技術(shù)同時檢測副溶血弧菌和溶藻弧菌方法檢測結(jié)果圖。
具體實施例方式a)利用primerf. 0引物設(shè)計軟件設(shè)計同時擴(kuò)增副溶血弧菌和溶藻弧菌的多重引物組合；
b)篩選多重引物組合中PCR檢測副溶血弧菌的引物；
c)篩選多重引物組合中PCR檢測溶藻弧菌的引物；
d)篩選多重PCR技術(shù)同時檢測副溶血弧菌和溶藻弧菌的引物組合。所述的步驟a)，其中涉及的引物為參照GenBank上發(fā)表(V. para. "ToxR為GenBank AB300869. 1，V. algi. ToxR為GenBank AF007288)的副溶血弧菌和溶藻弧菌的toxR基因序列，應(yīng)用I^rimerf. 0設(shè)計的同時檢測副溶血弧菌和溶藻弧菌的特異性引物組合。所述的步驟b)、c)和d)，經(jīng)過篩選，得出副溶血弧菌引物對應(yīng)的PCR擴(kuò)增片段大小為208 bp，溶藻弧菌引物對應(yīng)的PCR擴(kuò)增片段大小為159 bp。具體引物序列如下
V.para. (ToxR)Fl :5’ - CGAAAGCCGTATACTCCTGATG-3’ V. para. (ToxR) Rl :5’ - GAGTTGATAGCCTCGTTTTGGA-3’ V. algi. (ToxR)Fl :5，- GATCGTTTTGACCTGCGAAA-3， V.algi. (ToxR) Rl :5，- GCATTGAGCGCTACGTGAA-3，。所述的步驟d)，多重PCR技術(shù)同時檢測副溶血弧菌和溶藻弧菌方法最佳反應(yīng)條件的測定，分別利用2對引物進(jìn)行2種細(xì)菌多重PCR方法最佳退火溫度、引物濃度、dNTP濃度、 Mg2+濃度、模板濃度等的測定，然后根據(jù)實驗結(jié)果進(jìn)行多重PCR方法最佳循環(huán)次數(shù)的測定。所述的步驟d)，多重PCR技術(shù)同時檢測副溶血弧菌和溶藻弧菌方法的反應(yīng)體系為25uL，具體如下10XPCR Buffer 5μ L,25mmol/L MgCl2 2. 5 μ L, 10 mmol/L dNTP 2 μ L, 10 mmol/L兩種細(xì)菌的上下游引物各0.3 μ L，5u/μ L Taq酶0. 2 μ L，ddH20 13. lyL，兩種細(xì)菌的 DNA 模板各 0. 5 μ L。擴(kuò)增條件為 95°C 5 min ；95°C 45s, 53°C 45s,72°C Imin ；35 循環(huán)；72°C IOmin。實施例1
用于同時檢測副溶血弧菌和溶藻弧菌的多重PCR引物設(shè)計方法，該方法包括以下步
驟
步驟1，利用引物設(shè)計軟件01igo6.0設(shè)計同時檢測副溶血弧菌和溶藻弧菌的多重 PCR引物組合，所形成的引物組合所包含的引物堿基數(shù)為23個，引物的熔解溫度Tm值為 560C -630C (其中60°C最佳)，引物的GC%為40% ；
步驟2，對引物組合中的引物進(jìn)行篩選，保留不能合成引物二聚體的引物； 步驟3，判斷所保留引物的競爭優(yōu)劣狀態(tài)，將上述所保留引物的堿基數(shù)進(jìn)行比較，當(dāng)引物的堿基數(shù)均相同且內(nèi)側(cè)引物的GC%小于外側(cè)引物的GC%，或者當(dāng)引物的堿基數(shù)不完全相同且內(nèi)側(cè)引物的堿基數(shù)比外側(cè)引物少一個堿基時，判斷為競爭狀態(tài)劣引物，進(jìn)行步驟4;
步驟4，再次篩選競爭狀態(tài)劣的引物，具體步驟為重復(fù)步驟2，對所保留的引物按照步驟3進(jìn)行再次判斷；
步驟5，利用PCR方法對競爭狀態(tài)優(yōu)引物進(jìn)行擴(kuò)增；PCR方法的富集階段的退火溫度為 600C，標(biāo)記階段為94°C變性，72°C退火延伸的兩步PCR，擴(kuò)增階段的退火溫度為50°C。步驟6，去除擴(kuò)增引物中的劣引物，獲得多重PCR引物。具體引物序列如下
V.para. (ToxR) Fl :5’ - CGAAAGCCGTATACTCCTGATG-3’ V. para. (ToxR) Rl :5’ - GAGTTGATAGCCTCGTTTTGGA-3’ V. algi. (ToxR)Fl :5，- GATCGTTTTGACCTGCGAAA-3， V. algi. (ToxR) Rl :5，- GCATTGAGCGCTACGTGAA-3，。實施例2
用于同時檢測副溶血弧菌和溶藻弧菌的多重PCR引物設(shè)計方法，其特征在于該方法包括以下步驟
步驟1，利用引物設(shè)計軟件I^rimerS. O設(shè)計同時檢測副溶血弧菌和溶藻弧菌的多重 PCR引物組合，所形成的引物組合所包含的引物堿基數(shù)為22個，引物的熔解溫度Tm值為 56"C -630C (優(yōu)選 60°C )，引物的 GC% 為 60% ；
步驟2，對引物組合中的引物進(jìn)行篩選，保留不能合成引物二聚體的引物，對所用的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，篩選擴(kuò)增效果最好的引物組合；
步驟3，判斷所保留引物的競爭優(yōu)劣狀態(tài)，將上述所保留引物的堿基數(shù)進(jìn)行比較，當(dāng)引物的堿基數(shù)均相同且內(nèi)側(cè)引物的GC%小于外側(cè)引物的GC%，或者當(dāng)引物的堿基數(shù)不完全相同且內(nèi)側(cè)引物的堿基數(shù)比外側(cè)引物少一個堿基時，判斷為競爭狀態(tài)劣引物，進(jìn)行步驟4 ；否則判斷為競爭狀態(tài)優(yōu)引物，進(jìn)行步驟5 ；
步驟4，再次篩選競爭狀態(tài)劣的引物，具體步驟為重復(fù)步驟2，對所保留的引物按照步驟3進(jìn)行再次判斷；步驟5，利用PCR方法對競爭狀態(tài)優(yōu)引物進(jìn)行擴(kuò)增；PCR方法的富集階段的退火溫度為 65°C，標(biāo)記階段為94°C變性，72°C退火延伸的兩步PCR，擴(kuò)增階段的退火溫度為60°C。步驟6，去除擴(kuò)增引物中的劣引物，獲得多重PCR引物。具體引物序列如下
V.para. (ToxR) Fl :5’ - CGAAAGCCGTATACTCCTGATG-3’ V. para. (ToxR) Rl :5’ - GAGTTGATAGCCTCGTTTTGGA-3’ V. algi. (ToxR)Fl :5，- GATCGTTTTGACCTGCGAAA-3， V. algi. (ToxR) Rl :5，- GCATTGAGCGCTACGTGAA-3，。實施例3
1、設(shè)計合成副溶血弧菌和溶藻弧菌弓I物
參照GenBank上發(fā)表的副溶血弧菌和溶藻弧菌的toxR基因序列，應(yīng)用ft~imer2. O設(shè)計一對特異性引物，副溶血弧菌PCR擴(kuò)增片段大小為208 bp，溶藻弧菌PCR擴(kuò)增片段大小為 159 bp,由上海鼎安生物科技有限公司合成；
V.para. (ToxR)Fl :5’ - CGAAAGCCGTATACTCCTGATG-3‘ V. para. (ToxR) Rl :5’ - GAGTTGATAGCCTCGTTTTGGA-3’ V. algi. (ToxR)Fl :5，- GATCGTTTTGACCTGCGAAA-3， V. algi. (ToxR) Rl :5，- GCATTGAGCGCTACGTGAA-3，；
2、摸索細(xì)菌模板提取方法
參照《精編分子生物學(xué)實驗指南》采用傳統(tǒng)方法(酚-氯仿提取法)、直接菌體加入法、 反復(fù)凍融法、熱裂解法和試劑盒提取法5種方法分別對細(xì)菌DNA進(jìn)行提取，并將提取的DNA 模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，對結(jié)果進(jìn)行對照，選出最佳提取方法。其中試劑盒提取法、熱裂解法和傳統(tǒng)提取法提取效果相同，并且在這5種提取方法中，這3種提取方法效果較好。但是傳統(tǒng)方法操作較為煩瑣，熱裂解法提取的DNA純度太低，因此最終選擇試劑盒提取法為最佳提取方法；
3、多重PCR—步法技術(shù)同時檢測溶血弧菌和副溶血弧菌方法的建立
將副溶血弧菌和溶藻弧菌菌株分別接種到3. 5%堿性蛋白胨水中，過夜培養(yǎng)后，按試劑盒提取法制備菌體DNA模板溶液，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系為25uL，具體如下10XPCR Buffer 5μ L,25mmol/L MgCl2 2. 5 μ L, 10 mmol/L dNTP 2 μ L，10 mmol/L 兩種細(xì)菌的上下游引物各 0.3 μ L，5u/y L Taq 酶 0. 2 μ L，ddH20 13. 1 μ L，兩種細(xì)菌的 DNA 模板各 0. 5 μ L。 擴(kuò)增條件為 95°C 5 min ；95°C 45s, 53°C 45s,72°C Imin ；35 循環(huán)；72°C IOmin0 取 PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖(2%)電泳檢測擴(kuò)增結(jié)果；
4、多重PCR—步法最佳反應(yīng)條件的摸索
分別利用2對引物進(jìn)行2種細(xì)菌多重PCR方法最佳退火溫度、引物濃度、dNTP濃度、 Taq酶濃度、Mg2+濃度、模板濃度等的測定，然后根據(jù)實驗結(jié)果進(jìn)行多重PCR方法最佳循環(huán)次數(shù)的測定。結(jié)果測得多重PCR—步法，退火溫度為51°C -57°C均可，其中以53°C最佳；多重PCR —步法鎂離子濃度為在25 PL的反應(yīng)體系中，25 mmol/L MgCL2的劑量1、1. 5、2、2. 5、 3、3.5和4 PL均有清晰的條帶出現(xiàn)，但是除了 2.5 PL的條帶之外都有拖帶現(xiàn)象，所以最終選擇2. 5 PL為最佳添加量；2. 5 mmol/L dNTP的劑量1. 5、2、2. 5、3、3. 5和4 μ 均可，最終選擇2PL作為最佳添加量；25 PL反應(yīng)體系中所加的5U/^L Taq酶劑量的結(jié)果見說明書附圖1，從 1 到 6 依次為 0. 25、0. 20、0. 15、0. 10、0. 05 和 0. 01 μ ，M 為 IOObp λ DNA Marker ； 中208bp條帶為V. para. , 159bp條帶為V. algi.，從電泳圖(附圖1)可以清晰地看出，條帶 1、2比較清楚，從條帶3開始逐漸模糊，所以最終選擇25 PL反應(yīng)體系中所加的5U/^L Taq 0. 2μ 作為最佳添加量；多重PCR —步法循環(huán)數(shù)30個 35個均可。但基于實際情況，檢測時間越短越好，所以選擇循環(huán)數(shù)為30個；
5、多重PCR—步法靈敏度檢測
取37°C培養(yǎng)18h的副溶血弧菌和溶藻弧菌菌液做10倍梯度稀釋，稀釋至10_9，各稀釋度菌液平板計數(shù)參照國標(biāo)法(GB/ T 4789. 2-2003 )進(jìn)行細(xì)菌計數(shù)，選擇提取效果較好的方法提取各個不同稀釋度的菌體DNA模板，然后用優(yōu)化好的PCR體系進(jìn)行靈敏度的檢測。多重PCR靈敏度分別為algi 60cfu和para 50cfu ；
6、多重PCR—步法特異性測定
分別對副溶血弧菌、溶藻弧菌、霍亂弧菌、美人魚弧菌、麥?zhǔn)匣【⑸抽T氏菌、枸櫞酸桿菌等進(jìn)行DNA提取，利用所選擇的最佳條件分別進(jìn)行多重PCR擴(kuò)增，以檢測其特異性。結(jié)果7個菌株中只有副溶血弧菌和溶藻弧菌能擴(kuò)增出相應(yīng)的片段，大小分別為副溶血弧菌為 208bp (預(yù)期的為208bp)、溶藻弧菌為159 bp (預(yù)期的為159 bp)，而其它均未擴(kuò)增出相應(yīng)的片段。說明本研究建立的方法特異性好；
7、多重PCR—步法穩(wěn)定性測定
按照以上摸索的最優(yōu)條件將除模板以外的PCR反應(yīng)體系混合后分裝，放-20°C中凍存， 按照最佳反應(yīng)條件定期取出檢測。檢測期間將預(yù)先混合好的PCR混合物放置-20°C條件下保存1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12個月仍能擴(kuò)增出和現(xiàn)配的PCR混合物一樣清晰的條帶， 此試驗還在進(jìn)行中，最終時間還沒有最終確定。但通過一年的檢測可以看出該試劑的穩(wěn)定性較好，至少能保持一年以上；
8、多重PCR—步法臨床檢測
進(jìn)口冷凍帶魚、魷魚和墨魚，活甲魚、甲魚蛋、螃蟹和蝦等100份樣品，用多重PCR技術(shù)檢測，同時與常規(guī)方法檢測進(jìn)行比較。PCR檢測出3份樣品為副溶血弧菌陽性5份溶藻弧菌陽性，與常規(guī)細(xì)菌分離鑒定結(jié)果完全吻合。 可以理解，很多細(xì)節(jié)的變化是可能的，但這并不因此違背本發(fā)明的范圍和精神，任何所屬技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員對其所做的適當(dāng)變化，皆應(yīng)視為不脫離本發(fā)明專利的范
權(quán)利要求
1.用于同時檢測副溶血弧菌和溶藻弧菌的多重PCR引物，其特征在于副溶血弧菌引物對應(yīng)的PCR擴(kuò)增片段大小為208 bp，溶藻弧菌引物對應(yīng)的PCR擴(kuò)增片段大小為159 bp, 具體引物序列如下V.para. (ToxR)Fl :5，- CGAAAGCCGTATACTCCTGATG -3， V. para. (ToxR) Rl :5，- GAGTTGATAGCCTCGTTTTGGA -3， V. algi. (ToxR)Fl :5，- GATCGTTTTGACCTGCGAAA -3， V. algi. (ToxR) Rl :5，- GCATTGAGCGCTACGTGAA -3，。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于同時檢測副溶血弧菌和溶藻弧菌的多重PCR引物設(shè)計方法，其特征在于所述設(shè)計方法包括以下步驟步驟1，利用引物設(shè)計軟件設(shè)計同時檢測副溶血弧菌和溶藻弧菌的多重PCR引物組合， 所形成的引物組合所包含的引物堿基數(shù)為20- M個，引物的熔解溫度Tm值為56°C -63°C， 引物的GC%為40%-60% ；步驟2，對引物組合中的引物進(jìn)行篩選，保留不能合成引物二聚體的引物； 步驟3，判斷所保留引物的競爭優(yōu)劣狀態(tài)，將上述所保留引物的堿基數(shù)進(jìn)行比較，當(dāng)引物的堿基數(shù)均相同且內(nèi)側(cè)引物的GC%小于外側(cè)引物的GC%，或者當(dāng)引物的堿基數(shù)不完全相同且內(nèi)側(cè)引物的堿基數(shù)比外側(cè)引物少一個堿基時，判斷為競爭狀態(tài)劣引物，進(jìn)行步驟4 ；否則判斷為競爭狀態(tài)優(yōu)引物，進(jìn)行步驟5 ；步驟4，再次篩選競爭狀態(tài)劣的引物，具體步驟為重復(fù)步驟2，對所保留的引物按照步驟3進(jìn)行再次判斷；步驟5，利用PCR方法對競爭狀態(tài)優(yōu)引物進(jìn)行擴(kuò)增； 步驟6，去除擴(kuò)增引物中的劣引物，獲得多重PCR引物。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的擴(kuò)增副溶血弧菌和溶藻弧菌基因的多重PCR引物的設(shè)計方法，其特征在于步驟1中，所述引物設(shè)計軟件為Primer2. 0,Primer5. O或01igo6. O。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的擴(kuò)增副溶血弧菌和溶藻弧菌基因的多重PCR引物的設(shè)計方法，其特征在于步驟1中，所述多重PCR引物組合的熔解溫度Tm值為60°C。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的擴(kuò)增副溶血弧菌和溶藻弧菌基因的多重PCR引物的設(shè)計方法，其特征在于步驟1中，所述不能形成引物二聚體的引物的堿基數(shù)目為22或23。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的擴(kuò)增副溶血弧菌和溶藻弧菌基因的多重PCR引物的設(shè)計方法，其特征在于步驟2中，所述對引物組合中的引物進(jìn)行篩選，具體為對所用的引物進(jìn)行 PCR擴(kuò)增，篩選擴(kuò)增效果最好的引物組合。
7.根據(jù)權(quán)利要求2所述的擴(kuò)增副溶血弧菌和溶藻弧菌基因的多重PCR引物的設(shè)計方法，其特征在于步驟5中，所述PCR方法的富集階段的退火溫度為60-65°C，標(biāo)記階段為 94°C變性，72°C退火延伸的兩步PCR，擴(kuò)增階段的退火溫度為50_60°C。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種擴(kuò)增副溶血弧菌和溶藻弧菌的多重PCR引物及其設(shè)計方法，設(shè)計方法包括以下步驟步驟1，利用引物設(shè)計軟件設(shè)計一系列同時擴(kuò)增副溶血弧菌和溶藻弧菌的多重PCR引物組合；步驟2，對一系列引物對進(jìn)行篩選，選擇擴(kuò)增效果最佳的引物組合；步驟3，對選擇好的最佳引物組合進(jìn)行反應(yīng)條件摸索；步驟4，對建立的方法進(jìn)行特異性、重復(fù)性和穩(wěn)定性等摸索。本發(fā)明解決副溶血弧菌和溶藻弧菌檢測過程中常規(guī)細(xì)菌分離檢測周期長的問題，而且同時檢測兩種菌，具有快速、特異、敏感、節(jié)約費(fèi)用等優(yōu)點。
文檔編號C12Q1/68GK102312005SQ20111029855
公開日2012年1月11日 申請日期2011年9月28日 優(yōu)先權(quán)日2011年9月28日
發(fā)明者劉陽, 孔繁德, 徐淑菲, 楊俊萍, 郭樹林, 陳信忠, 龔艷清 申請人:廈門出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術(shù)中心