專利名稱：胚胎干細(xì)胞體外分化中藥活性物質(zhì)藥效篩選模型的建立及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，涉及一種藥效篩選模型的建立及應(yīng)用，主要是關(guān)于藥物誘導(dǎo)胚胎干細(xì)胞體外分化中藥活性成分藥效篩選模型的建立及應(yīng)用，可高效率地對(duì)中藥藥效進(jìn)行快速篩選與評(píng)估。
背景技術(shù)：
經(jīng)典的藥效篩選模型包括(I)整體動(dòng)物水平的藥效篩選模型其優(yōu)點(diǎn)是可以從整體水平，直觀反映藥物的治療作用；缺點(diǎn)是需要大量動(dòng)物，實(shí)驗(yàn)周期長，需要大量供試品，不適用于藥效的初步大規(guī)模篩選；(2)組織器官(如離體心臟)水平的藥效篩選模型主要缺點(diǎn)是不能反映神經(jīng)和體液對(duì)器官藥理效應(yīng)的調(diào)節(jié)作用，且其篩選規(guī)模小、效率低、樣品需求量較大。(3)細(xì)胞水平的藥效篩選模型有較好的代表性，供試品用量少，可實(shí)現(xiàn)大規(guī)模篩選。其局限性在于不能反映藥物對(duì)某一類型細(xì)胞在持續(xù)發(fā)育過程中的作用信息，可供藥效評(píng)價(jià)的指標(biāo)較少。(4)基因水平的藥效篩選模型，可以大規(guī)模、高通量、快速篩選藥物活性成分，評(píng)價(jià)藥效。但此模型尚不能體現(xiàn)藥物對(duì)生命體活動(dòng)的影響過程及藥物與大分子作用時(shí)重要生命過程變化的性質(zhì)(如基因調(diào)控、蛋白質(zhì)翻譯后修飾，信號(hào)傳導(dǎo)級(jí)聯(lián)等)。研究胚胎干細(xì)胞(ES細(xì)胞)體外定向分化成單一類型細(xì)胞(心肌細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞等)起始于90年代，主要用于(I)轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究；(2)再生醫(yī)學(xué)研究；(3)發(fā)育生物學(xué)研究。ES細(xì)胞具有體外不分化的永久增殖能力，當(dāng)處于合適的培養(yǎng)條件下，可定向分化形成某些單一類型細(xì)胞。國外在本世紀(jì)初即開始研究ES細(xì)胞的體外定向分化，已有ES細(xì)胞定向分化成心肌細(xì)胞、神 經(jīng)細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞等的報(bào)道，但ES細(xì)胞的分化成功率遠(yuǎn)低于藥物誘導(dǎo)的分化成功率。干細(xì)胞用于藥物篩選的工作在國外剛剛開始，國內(nèi)尚在起步階段。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是利用ES細(xì)胞在特定條件下，可分化成單一類型細(xì)胞的性質(zhì)，在藥物誘導(dǎo)下，使ES細(xì)胞在體外分化成特定細(xì)胞，構(gòu)建高效率藥效篩選模型，并利用該模型進(jìn)行藥物藥效初步篩選與評(píng)價(jià)。本發(fā)明主要分以下幾個(gè)步驟1.利用已有的ES細(xì)胞的支持培養(yǎng)；2.藥物誘導(dǎo)ES細(xì)胞定向分化為單一類型細(xì)胞的培養(yǎng)；3.利用該模型進(jìn)行藥效篩選與評(píng)估。本發(fā)明利用已有的ES細(xì)胞的支持培養(yǎng)，其特征是選用小鼠胚胎干細(xì)胞D3細(xì)胞株(ES-D3細(xì)胞株)，接種于滋養(yǎng)層細(xì)胞上，按常規(guī)方法進(jìn)行傳代培養(yǎng)。本發(fā)明進(jìn)行的藥物誘導(dǎo)ES細(xì)胞定向分化為單一類型細(xì)胞的培養(yǎng)，其特征是當(dāng)誘導(dǎo)定向分化為單一類型細(xì)胞時(shí)，這類細(xì)胞包含心肌細(xì)胞，用培養(yǎng)基將ES-D3細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液，再懸滴培養(yǎng)成擬胚體，擬胚體進(jìn)行貼壁培養(yǎng)，加入供試藥物共同培養(yǎng)，當(dāng)擬胚體細(xì)胞團(tuán)出現(xiàn)特定標(biāo)志，則以此作為定向分化成功的指標(biāo)。對(duì)誘導(dǎo)ES細(xì)胞定向分化為心肌細(xì)胞時(shí)，擬胚體細(xì)胞團(tuán)出現(xiàn)的特定標(biāo)志是有節(jié)律地搏動(dòng)。根據(jù)藥物誘導(dǎo)擬胚體細(xì)胞團(tuán)出現(xiàn)的特定指標(biāo)，及藥物誘導(dǎo)分化的時(shí)效關(guān)系和量效關(guān)系進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，以此作為藥效評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)。測(cè)試藥物可以是黃芪、淫羊藿苷、葛根素、銀杏黃酮、丹參等中藥活性物質(zhì)。本發(fā)明所用的培養(yǎng)基是DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清。用本發(fā)明方法可構(gòu)建心肌細(xì)胞定向分化模型、神經(jīng)元定向分化模型、血管發(fā)生定向分化模型等多種單一類型細(xì)胞模型，用于相關(guān)藥物的藥效初步篩選與評(píng)價(jià)。利用本發(fā)明方法誘導(dǎo)ES細(xì)胞定向分化為心肌細(xì)胞，還可進(jìn)行心肌發(fā)育依賴性特殊基因表達(dá)的研究、心肌結(jié)構(gòu)蛋白表達(dá)研究和離子通道形成研究。本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)1.應(yīng)用面非常廣ES細(xì)胞具有體外不分化的無限增殖能力，構(gòu)建藥物誘導(dǎo)ES細(xì)胞體外定向分化形成單一類型細(xì)胞(如心肌細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞等)的藥效篩選模型，可初步評(píng)價(jià)以心臟、神經(jīng)、血管等為作用靶點(diǎn)的多種新型藥物的藥效。藥物在誘導(dǎo)過程中，可能通過干預(yù)多個(gè)環(huán)節(jié)使ES細(xì)胞定向分化為某種單一類型細(xì)胞，因此在該模型的應(yīng)用中，只要藥物具有干預(yù)其中某個(gè)或幾個(gè)關(guān)鍵環(huán)節(jié)的作用，就可初步評(píng)價(jià)藥物的藥效。2.生物信息量大、特異性強(qiáng)ES細(xì)胞體外定向分化體系由于能夠基本模擬乃至重現(xiàn)體內(nèi)復(fù)雜的發(fā)育及組織器官生成過程，具備能人工控制、干預(yù)的特點(diǎn)；并且可專一性地通過ES細(xì)胞在定向分化過程中，在細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、基因表達(dá)調(diào)控等方面高度模擬藥物在整體動(dòng)物中的作用，重現(xiàn)藥物對(duì)生物大分子調(diào)控的生命現(xiàn)象本質(zhì)，為新藥研制提供了簡單有效的體外藥效評(píng)價(jià)模型。3.對(duì)有誘導(dǎo)ES細(xì)胞定 向分化為某種單一類型細(xì)胞的創(chuàng)新藥物，該篩選模型由于可呈現(xiàn)分化的全過程，亦可提供藥物作用特異性靶點(diǎn)研究，并有可能發(fā)現(xiàn)一些有治療功能的基因。4.觀察與評(píng)價(jià)指標(biāo)直觀、明了，能直觀地反映藥物的時(shí)效關(guān)系和量效關(guān)系，用于客觀評(píng)價(jià)藥效。如ES細(xì)胞與具有治療心臟疾病藥效的創(chuàng)新藥物共培養(yǎng)后，以ES細(xì)胞形成的擬胚體是否具有自發(fā)的節(jié)律性搏動(dòng)為評(píng)價(jià)終點(diǎn)，如獲得的時(shí)效關(guān)系及量效關(guān)系資料與對(duì)照組有顯著性差異，即可明確其對(duì)ES細(xì)胞定向分化有誘導(dǎo)作用。5.該藥效篩選模型仍保持常規(guī)的細(xì)胞層面篩選藥物活性的一般特點(diǎn)，如所需供試品用量少、節(jié)時(shí)省錢、效率高等，但由于在定向分化過程中富含發(fā)育依賴性生物信息，能提供更多的靶點(diǎn)供藥效評(píng)價(jià)用，因此是一個(gè)高效率、高仿真兼顧，藥效與機(jī)制研究并存的藥效篩選模型，在新型藥物研制、中藥活性物質(zhì)藥效評(píng)價(jià)領(lǐng)域應(yīng)用前景十分廣闊。


圖1為中藥單體銀杏黃酮誘導(dǎo)ES-D3細(xì)胞定向分化為心肌細(xì)胞的時(shí)效關(guān)系曲線和量效關(guān)系曲線圖。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例一中藥單體銀杏黃酮誘導(dǎo)ES細(xì)胞定向分化為心肌細(xì)胞的研究1. ES細(xì)胞的支持培養(yǎng)ES-D3細(xì)胞在條件培養(yǎng)基(含DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清)中，按2xl07 5xl07個(gè)/ml的密度接種于滋養(yǎng)層細(xì)胞(小鼠成纖維細(xì)胞或STO細(xì)胞株)上，按常規(guī)方法進(jìn)行傳代培養(yǎng)。2.藥物誘導(dǎo)ES細(xì)胞定向分化為心肌細(xì)胞的培養(yǎng)①ES-D3細(xì)胞用胰酶消化制成單細(xì)胞懸液，按20 30uL接種于培養(yǎng)皿的蓋子內(nèi)表面上，培養(yǎng)皿內(nèi)加入IOmL ES-Hanks溶液，將蓋子翻轉(zhuǎn)形成懸滴，置培養(yǎng)箱中懸滴培養(yǎng)2天。此后將懸滴轉(zhuǎn)入盛有IOmL ES細(xì)胞分化培養(yǎng)基(DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清)的培養(yǎng)皿中，進(jìn)行ES細(xì)胞集落懸浮培養(yǎng)3天，形成ES細(xì)胞擬胚體。②附著ES細(xì)胞的分化培養(yǎng)在顯微鏡下用吸管將擬胚體轉(zhuǎn)移到24孔板內(nèi)，孵育4 5小時(shí)，使其吸附后，每孔中緩慢加入ImlES分化培養(yǎng)基，加入中藥單體銀杏黃酮與ES細(xì)胞擬胚體共孵育。此時(shí)開始用倒置顯微鏡每天觀察細(xì)胞，以捕捉心肌細(xì)胞開始跳動(dòng)的最初時(shí)間。2.用該模型進(jìn)行藥效評(píng)價(jià)若擬胚體細(xì)胞團(tuán)能有節(jié)律性地搏動(dòng)，則以此作為定向分化成心肌細(xì)胞的指標(biāo)，作出藥物銀杏黃酮對(duì)ES-D3細(xì)胞誘導(dǎo)分化的時(shí)效關(guān)系曲線和量效關(guān)系曲線，結(jié)果見附圖1，以此作為藥效評(píng)價(jià)的指標(biāo)。附圖1中，銀杏黃酮終濃度分別為系列1:0，系列2 :10_8mol/L，系列3 :10_7mol/L，每個(gè)濃度η = 400擬胚體，相同實(shí)驗(yàn)重復(fù)做了 6次。分別對(duì)5種心臟疾病療效明確的藥物(如銀杏黃酮、丹參、黃芪、淫羊藿苷、葛根素等)進(jìn)行誘導(dǎo)分化試驗(yàn)。結(jié)果其中有3種藥物分別在與ES-D3細(xì)胞共培養(yǎng)5 7天時(shí)，就有90%以上的細(xì)胞克隆出現(xiàn)節(jié)律性搏動(dòng)，并有心臟胚芽纖維蛋白表達(dá)上調(diào)。另有2種藥物與ES-D3細(xì)胞共培養(yǎng)9 11天時(shí)，均有80%以上的細(xì)胞克隆出現(xiàn)節(jié)律性搏動(dòng)，同時(shí)可見心肌發(fā)育依賴性基因上調(diào)。其中以中藥單體銀杏黃酮的誘導(dǎo)作用最明顯，且具有很好的量效關(guān)系。
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實(shí)施例二 心肌發(fā)育依賴性特殊基因表達(dá)的研究若藥物能誘導(dǎo)ES細(xì)胞定向分化為心肌細(xì)胞，則分別在藥物共培養(yǎng)前，藥物共培養(yǎng)后擬胚體形成時(shí)及擬胚體搏動(dòng)時(shí)，進(jìn)行如下研究(I)DNA文庫克隆一培養(yǎng)后提取噬菌體DNA作模板，PCR反應(yīng)擴(kuò)增一擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序;(2)半定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)鑒定一對(duì)一些基因進(jìn)行功能推測(cè)研究；(3)對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行RT — PCR半定量鑒定一對(duì)某些基因進(jìn)行功能推測(cè)研究。實(shí)施例二 心肌結(jié)構(gòu)蛋白表達(dá)研究(I)電鏡顯示心肌結(jié)構(gòu)蛋白特征性圖譜，并以出現(xiàn)與否及其成熟程度來顯示藥物作用。(2)蛋白電泳，western blot,評(píng)價(jià)是否有表達(dá)差異,及表達(dá)后修飾等。必要時(shí)進(jìn)行搏動(dòng)擬胚體電信號(hào)采集與分析。用本發(fā)明的藥效篩選模型能高效快速地初步評(píng)價(jià)具有改善心肌功能、抗心律失常、改善心肌供血、抗老年性癡呆、抗帕金森病、抗腫瘤及腫瘤轉(zhuǎn)移，治療心腦血管疾病、治療糖尿病、抗肝病等藥效的創(chuàng)新藥物。
權(quán)利要求
1.一種胚胎干細(xì)胞體外定向分化藥物篩選模型的構(gòu)建及應(yīng)用，其特征是在藥物誘導(dǎo)下，使胚胎干細(xì)胞(ES)定向分化成單一類型細(xì)胞，構(gòu)建高效率藥效篩選模型，并利用該模型進(jìn)行中藥活性成分藥效篩選和評(píng)估，本發(fā)明主要分以下幾個(gè)步驟 (1)利用已有的ES細(xì)胞的支持培養(yǎng)； (2)藥物誘導(dǎo)ES細(xì)胞定向分化為單一類型細(xì)胞的培養(yǎng)； (3)利用該模型進(jìn)行藥效篩選與評(píng)估。
2.如權(quán)利要求1所述的利用已有的ES細(xì)胞的支持培養(yǎng)，其特征是選用小鼠胚胎干細(xì)胞D3細(xì)胞株(ES-D3細(xì)胞株)，接種于滋養(yǎng)層細(xì)胞上，按常規(guī)方法進(jìn)行傳代培養(yǎng)。
3.如權(quán)利要求1所述的藥物誘導(dǎo)ES細(xì)胞定向分化為單一類型細(xì)胞的培養(yǎng)，其特征是當(dāng)誘導(dǎo)定向分化為單一類型細(xì)胞時(shí)，這類細(xì)胞包含心肌細(xì)胞，用培養(yǎng)基將ES-D3細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液，再懸滴培養(yǎng)成擬胚體，擬胚體進(jìn)行貼壁培養(yǎng)，加入供試藥物共同培養(yǎng)，以擬胚體細(xì)胞團(tuán)出現(xiàn)特定標(biāo)志，作為定向分化成功的指標(biāo)。
4.如權(quán)利要求3所述的藥物誘導(dǎo)ES細(xì)胞定向分化為單一類型細(xì)胞的培養(yǎng)，其特征是當(dāng)誘導(dǎo)定向分化為心肌細(xì)胞時(shí)，擬胚體細(xì)胞團(tuán)出現(xiàn)的特定標(biāo)志是有節(jié)律地搏動(dòng)。
5.如權(quán)利要求3所述的藥物誘導(dǎo)ES細(xì)胞定向分化為單一類型細(xì)胞的培養(yǎng)，其特征是 測(cè)試藥物可以是銀杏黃酮、黃芪、淫羊藿苷、葛根素、丹參等中藥活性物質(zhì)。
6.如權(quán)利要求1所述的胚胎干細(xì)胞體外定向分化藥物篩選模型的構(gòu)建及應(yīng)用，其特征是利用該方法，可構(gòu)建心肌細(xì)胞定向分化模型、神經(jīng)元定向分化模型、血管發(fā)生定向分化模型及其他多種單一類型細(xì)胞模型，用于藥效初步篩選與評(píng)估。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種使用胚胎干細(xì)胞構(gòu)建的藥物篩選模型，進(jìn)行藥物藥效初步篩選與評(píng)價(jià)。胚胎干細(xì)胞在藥物誘導(dǎo)下定向分化成特定類型細(xì)胞，構(gòu)建高效率藥物篩選模型，利用該模型進(jìn)行藥物藥效初步篩選和評(píng)估。只要藥物可在分化的某一個(gè)或某幾個(gè)階段起作用，就可對(duì)藥物的藥效進(jìn)行初步評(píng)估。本模型具有高效藥物篩選的特性，評(píng)估指標(biāo)直接、明確，可對(duì)許多天然藥物的藥理作用進(jìn)行快速評(píng)估。另外，本藥效篩選模型所需試劑、時(shí)間和經(jīng)費(fèi)相對(duì)較少，富含細(xì)胞分化信息，具備高效率與高仿真以及兼顧藥效與機(jī)制研究的優(yōu)勢(shì)。
文檔編號(hào)C12N5/077GK103045536SQ20111031049
公開日2013年4月17日 申請(qǐng)日期2011年10月14日 優(yōu)先權(quán)日2011年10月14日
發(fā)明者田杰 申請(qǐng)人:北京清美聯(lián)創(chuàng)干細(xì)胞科技有限公司