專利名稱：一種鴨新致病型呼腸孤病毒及其弱毒疫苗的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種病毒的致弱及弱毒疫苗株，尤其涉及一種鴨新致病型呼腸孤病毒及其弱毒疫苗的研制，屬于獸醫(yī)生物制品技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
自2005年冬季以來，福建、浙江等省4-25日齡雛番鴨、雛半番鴨、麻鴨發(fā)生一種以肝臟不規(guī)則壞死、出血和心肌、腔上囊出血為主要特征的新疫病，俗稱“鴨新肝病”、“鴨壞死性肝炎”等，發(fā)病率5 %-32. 5 %，病死率差異較大，為4 %-20 %，但鴨日齡愈小，發(fā)病率、病死率愈高。我們通過病原學(xué)研究，經(jīng)病毒分離與鑒定，確定其病原為不同于國內(nèi)外報道的鴨新致病型呼腸孤病毒(Novel-pathotype Duck Reovirus, NDRV)(黃瑜等.新致病型鴨呼腸孤病毒的分離鑒定.中國獸醫(yī)雜志，2009，45 (12) :29-31. )0

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種鴨新致病型呼腸孤病毒及其弱毒疫苗，該弱毒疫苗遺傳穩(wěn)定、安全性好，對鴨新致病型呼腸孤病毒具有良好的免疫保護作用。本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是通過以下技術(shù)途徑來實現(xiàn)
本發(fā)明提供的病毒為鴨新致病型呼腸孤病毒(Novel-pathotype Duck Reovirus, NDRV)，毒株為LH13，于2011年9月6日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，其簡稱CGMCC，地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，保藏號CGMCC NO. 5198。將上述病毒在雞胚成纖維細胞系上連續(xù)傳代觀-30次獲得致弱毒株，病毒滴度為1X106_6 25 TCID50/0. 1ml，加入凍干保護劑凍干后制成弱毒疫苗，病毒效價應(yīng)在5X105 5 TCID50/0. Iml 以上。所述的弱毒疫苗在防制雛番鴨新致病型呼腸孤病毒病中的應(yīng)用。鴨新致病型呼腸孤病毒弱毒疫苗的制備方法具體如下
(1)鴨新致病型呼腸孤病毒的致弱分離病毒經(jīng)雞胚成纖維細胞系進行連續(xù)傳代致弱。 觀察病毒對細胞的致病性，并取不同代次的傳代毒測定其TCID5tlt5將病毒滴度為1 X 106—6 25 TCID5tlA). Iml的弱毒株作為疫苗用種毒。(2)鴨新致病型呼腸孤病毒疫苗的制備將疫苗用種毒接種雞胚成纖維細胞進行大量繁殖，測定毒價后將明膠等凍干保護劑與病毒培養(yǎng)物混勻并分裝，制備成疫苗。毒力測定試驗結(jié)果表明本發(fā)明弱毒疫苗對雛番鴨安全、無致病力。本發(fā)明的顯著優(yōu)點
本發(fā)明所涉及的新致病型呼腸孤病毒弱毒株，是有強毒型的新致病型呼腸孤病毒 (Novel-pathotype Duck Reovirus, NDRV)通過雞胚成纖維細胞連續(xù)傳代后獲得的弱毒株， 該弱毒株特有的重要生物活性是已喪失對其原宿主動物雛番鴨的致病性，以該致弱的病毒株研制的弱毒疫苗免疫雛番鴨后能有效抵抗當(dāng)前流行的鴨新致病型呼腸孤病毒強毒的攻擊，且遺傳穩(wěn)定性良好。
具體實施例方式為了進一步闡述本發(fā)明，下面給出一系列應(yīng)用實施例。這些實施例完全是例證性的，它們僅用來對本發(fā)明進行具體描述，不應(yīng)當(dāng)理解為對本發(fā)明的限制。1、病毒的分離培養(yǎng)與致弱
無菌采集送檢的臨床病死11日齡雛番鴨的肝臟，用含雙抗(其中青、鏈霉素各IOOu/ ml)的無菌PBS，按肝臟與無菌PBS=I :3-5的比例(W/V)進行勻漿后，離心取0. 5ml上清液接種已培養(yǎng)成單層的非洲綠猴腎細胞(Vero細胞，ATCC :CCL_81)，37°C吸附60min后，用含雙抗的無菌PBS清洗3次，加入含10%胎血清(Gibco公司)的高糖DMEM培養(yǎng)液(Gibco公司)， 置37°C、5% CO2溫箱培養(yǎng)觀察48-7 。初代培養(yǎng)未引起明顯細胞病變，7 后將細胞反復(fù)凍融3次，回收含毒細胞液，按照上述方法繼續(xù)接種Vero細胞并連續(xù)傳代培養(yǎng)4代后，病毒培養(yǎng)物可引起明顯細胞病變，細胞可見堆集、融合，并出現(xiàn)明顯拉網(wǎng)、脫落，收集培養(yǎng)48-7 的病毒液得到鴨新致病型呼腸孤病毒LH13株，保藏號為CGMCC NO. 5198。取分離獲得的鴨新致病型呼腸孤病毒LH13株，按5%的接種量接種75ml2單層雞胚成纖維細胞，感作45min，用無菌PBS清洗2次后，加入15ml含m胎牛血清及1%雙抗的高糖DMEM培養(yǎng)基于5%C02，37°C溫箱培養(yǎng)觀察。待75%的細胞出現(xiàn)病變時，將細胞反復(fù)凍融3 次，回收含毒細胞液，將一部分傳代毒凍存，另一部分作為下一代的種毒，如此反復(fù)傳代。取第15、20、對、觀和30代的傳代毒接種雞胚成纖維細胞，觀察不同代次的傳代毒的病毒滴度及產(chǎn)生細胞病變的時間。測定結(jié)果表明，第15代的傳代毒的病毒效價為10_4 75， 隨后的傳代毒病毒滴度逐步增加，第觀-30代傳代毒的病毒效價基本穩(wěn)定在lxlO_6 M TCID50 左右；不同代次的傳代毒引起細胞病變的時間也隨著傳代次數(shù)的增加而縮短，第15代時接種病毒后120h左右出現(xiàn)圓縮、脫落或拉絲等細胞病變，到觀代時，接種病毒后7 左右即可見明顯的細胞病變，不同代次的傳代毒在雞胚成纖維細胞上的病毒滴度及致細胞病變時間見表1。取第30代的傳代毒作種毒，接種雞胚成纖維細胞批量培養(yǎng)病毒，收獲的病毒經(jīng)無菌檢驗及外源病毒檢測后，按1. 5%的比例加入明膠混勻分裝無菌凍干瓶，每瓶 2.5 ml, -20°C凍存過夜后用真空凍干機凍干22h，制成弱毒疫苗，病毒效價應(yīng)在5X IO5 5 TCID50/0. Iml 以上。表1不同代次傳代毒對DFl細胞的致病性
權(quán)利要求
1.一種鴨新致病型呼腸孤病毒(Novel-pathotype Duck Reovirus)，毒株為LH13 ；保藏號為CGMCC NO. 5198，于2011年9月6日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心。
2.一種鴨新致病型呼腸孤病毒的弱毒疫苗，其特征在于將權(quán)利要求1所述病毒在雞胚成纖維細胞系上連續(xù)傳代觀-30次獲得致弱毒株，病毒滴度為1X106_6 25 TCID50/0. lml, 加入凍干保護劑凍干后制成弱毒疫苗。
3.—種如權(quán)利要求3所述的弱毒疫苗在防制雛番鴨新致病型呼腸孤病毒病中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了鴨新致病型呼腸孤病毒(Novel-pathotypeDuckReovirus,NDRV)，其微生物保藏號CGMCCNO.5198。將該病毒致弱后制備的弱毒疫苗株遺傳性穩(wěn)定、安全性好，對雛番鴨安全、無致病力。以本發(fā)明弱毒疫苗免疫的雛番鴨能有效抵抗鴨新致病型呼腸孤病毒強毒株的攻擊。
文檔編號C12R1/93GK102352346SQ20111032555
公開日2012年2月15日 申請日期2011年10月24日 優(yōu)先權(quán)日2011年10月24日
發(fā)明者萬春和, 傅光華, 施少華, 林建生, 林芳, 程龍飛, 陳紅梅, 黃瑜 申請人:福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所