專利名稱：提高豬的瘦肉率、肌間脂肪含量和生殖能力的轉(zhuǎn)基因載體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種提高豬的瘦肉率、肌間脂肪含量和生殖能力的轉(zhuǎn)基因載體。
背景技術(shù)：
豬肉作為中國人民的主要肉類食品，保證全國人民有充足的、優(yōu)質(zhì)的豬肉供應(yīng)是關(guān)系到人民日常生活的重要事件。而隨著人口的增長和人民生活水平的提高，除了對(duì)豬肉的需求量增加以外，對(duì)豬肉的質(zhì)量和口感的要求也提高了。上海浦東國際機(jī)場就曾發(fā)現(xiàn)從日本走私運(yùn)入價(jià)值一百萬余元、八百多公斤的頂級(jí)和牛肉(又稱雪花牛肉)，由此可見中國對(duì)高檔肉類產(chǎn)品的消費(fèi)需求。因此，有必要建立和改良中國自己的豬的品種，改善豬肉口感和質(zhì)量，以滿足人民群眾的生活需求。

前面提到的頂級(jí)和牛肉的特點(diǎn)是肉色艷麗，脂肪有如大理石花紋般分布在肌肉內(nèi)，可比秋季降霜時(shí)的美麗，而且由于肌肉中富含脂肪，入口柔融欲化，風(fēng)味鮮美。因此，可通過降低豬全身的脂肪含量來提高瘦肉率，同時(shí)，增加肌肉中的脂肪含量來改善豬肉的口感和品質(zhì)。在肌肉中過表達(dá)PEPCK-C的(PEPCK-Cmus)轉(zhuǎn)基因小鼠有著令人吃驚和興奮的表型。首先，PEPCK-Cmus轉(zhuǎn)基因小鼠的運(yùn)動(dòng)能力遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于對(duì)照小鼠，可以以20米/分鐘的速度跑上5公里(對(duì)照小鼠在同樣的速度下只能跑0.2公里)。其次，PEPCK-Cmus轉(zhuǎn)基因小鼠的壽命遠(yuǎn)遠(yuǎn)長于對(duì)照小鼠，而且在30-35月時(shí)還能夠產(chǎn)下正常的小鼠后代(大多數(shù)小鼠在12-18月時(shí)就失去生殖能力了)。PEPCK-Cmus轉(zhuǎn)基因小鼠的高運(yùn)動(dòng)能力可能與骨骼肌里的甘油三酯的增加有關(guān)。盡管PEPCK-Cmus轉(zhuǎn)基因小鼠全身的脂肪含量下降，不到對(duì)照小鼠脂肪含量的一半，但是PEPCK-Cmus轉(zhuǎn)基因小鼠比對(duì)照小鼠卻有更多的脂肪分布于骨骼肌中(Hakimi, P.et al.“Overexpression of the cytosolic form of phosphoenolpyruvatecarboxykinase(GTP) in skeletal muscle repatterns energy metabolism in themouse.”J Biol Chem，2007.282 (45):32844-32855)。PEPCK-Cnius 轉(zhuǎn)基因小鼠中低脂肪含量和高肌間脂肪含量的特點(diǎn)和頂級(jí)和牛肉的特性是類似的?；赑EPCK-Cmus轉(zhuǎn)基因小鼠的神奇表型，我們預(yù)期在豬的骨骼肌中過表達(dá)PEPCK-C可降低豬的脂肪含量，并在肉質(zhì)和口感上得到大幅度的提高，這樣的豬肉有著巨大的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。大規(guī)模的生產(chǎn)PEPCK-Cnus轉(zhuǎn)基因豬有望填補(bǔ)國內(nèi)在高品質(zhì)豬肉的空白，豐富人民群眾的菜籃子，對(duì)提高人民群眾的生活質(zhì)量有重要的意義。而且PEPCK-C轉(zhuǎn)基因可提高小鼠的生殖能力，因此，PEPCK-Cmus轉(zhuǎn)基因豬很可能在繁殖能力上有所提高，在優(yōu)良品種的繁殖上有著廣泛的應(yīng)用前景。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題在于提供一種能提高豬的瘦肉率、肌間脂肪含量和生殖能力的轉(zhuǎn)基因載體。為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下:
轉(zhuǎn)基因載體含有小鼠的肌酸激酶(muscle creatine kinase,MCK)增強(qiáng)子、2kb豬的α-骨骼肌肌動(dòng)蛋白(a-skeletal actin)基因的啟動(dòng)子、豬的PEPCK-C的cDNA和牛生長激素基因(bGH)的3’端不翻譯區(qū)域，且?guī)в胁溉閯?dòng)物細(xì)胞中篩選用的抗性基因一嘌呤霉素(PuiOmycin)基因和原核細(xì)胞中篩選用的抗性基因-博萊霉素(Zeocin)基因(見圖2)。2kb的α-骨骼肌肌動(dòng)蛋白(a-skeletal actin)的啟動(dòng)子可保證下游的基因在骨骼肌中特異表達(dá)，而且MCK增強(qiáng)子也具有肌肉組織特異性的增強(qiáng)子活性，可特異地促進(jìn)下游基因的高表達(dá)。在此轉(zhuǎn)基因載體中表達(dá)的是豬自身的PEPCK-C基因，所以從食品安全的角度講，對(duì)消費(fèi)者的健康沒有任何影響。此外，本發(fā)明在嘌呤霉素和博萊霉素抗性基因的兩端還加入LoxP序列，這樣，在PEPCK-C基因整合到基因組DNA后，如有需要，本發(fā)明可通過表達(dá)Cre蛋白，誘導(dǎo)LoxP序列的重組，以除去抗性基因，進(jìn)一步保障轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的食品安全性。本發(fā)明構(gòu)建的在肌肉組織特異表達(dá)豬PEPCK-C的轉(zhuǎn)基因載體PZT52的全序列如SEQ ID No:1所示，其中，第29-1897堿基為豬PEPCK-C編碼區(qū)，第2278-2491堿基為bGH3’端不翻譯區(qū)，第2267-2300堿基為LoxP，第3056-3727堿基為嘌呤霉素抗性基因，第3785-4156堿基為博萊霉素(Zeocin)抗性基因，第4166-4199堿基為LoxP，第5673-6023堿基為MCK增強(qiáng)子，第6119-8052堿基為豬α -骨骼肌肌動(dòng)蛋白基因的啟動(dòng)子。本發(fā)明的轉(zhuǎn)基 因載體可應(yīng)用于體細(xì)胞克隆，以構(gòu)建高瘦肉率、高肌間脂肪含量和高生殖能力的PEPCK-Cmus轉(zhuǎn)基因豬。


圖1是本發(fā)明的技術(shù)流程圖。圖2是本發(fā)明構(gòu)建的ΡΖΤ52轉(zhuǎn)基因載體的示意圖。
具體實(shí)施例方式根據(jù)下述實(shí)施例，可以更好地理解本發(fā)明。然而，本領(lǐng)域的技術(shù)人員容易理解，實(shí)施例所描述的內(nèi)容僅用于說明本發(fā)明，而不應(yīng)當(dāng)也不會(huì)限制權(quán)利要求書中所詳細(xì)描述的本發(fā)明。實(shí)施例1:插入 LoxP-Puro-Zeo-LoxP 片段,構(gòu)建 pZTl。將pO)NA3.I (myc-His) a 載體(Invitrogen)用 PvuII 酶切，酶切體系為 2 μ g 質(zhì)粒DNA, 3 μ I 10 Xbuffer, 2 μ I PvuII 酶，加入 ddH20 補(bǔ)足體積至 30 μ 1，37°C溫浴 3 小時(shí)。然后將酶切體系在I %的瓊脂糖凝膠中通過電泳分離，切出3.3kb大小的DNA條帶，用膠回收純化試劑盒純化DNA。具體步驟為，將紫外光下切下目的DNA條帶裝入1.5ml離心管中，稱重后加入3倍體積的溶膠液，55°C保溫10分鐘，使瓊脂糖凝膠完全融化；融化的凝膠待溫度降至室溫后，將混合液轉(zhuǎn)入附柱中，10，OOOg離心I分鐘，倒掉流出液；加入650 μ I漂洗緩沖液，10，OOOg離心I分鐘，倒掉流出液；吸附柱再次離心，10，OOOg離心，I分鐘，倒掉流出液；將吸附柱轉(zhuǎn)移到一個(gè)新的1.5ml離心管中，加入50 μ I ddH20，放置I分鐘，10，OOOg離心I分鐘收集純化產(chǎn)物。從pSNAP載體用EcoRV酶切出LoxP-Puro-Zeo-LoxP片段，酶切體系為3 μ g質(zhì)粒DNA, 3 μ I 10 Xbuffer, 2 μ I EcoRV 酶，加入 ddH20 補(bǔ)足體積至 30 μ 1，37°C溫浴 3 小時(shí)。然后將酶切體系在I %的瓊脂糖凝膠中通過電泳分離，切出1.7kb大小的DNA條帶，用膠回收純化試劑盒純化DNA。具體步驟同上。將PCDNA3.1 (myc-His) a (PvuII)和 LoxP-Puro-Zeo-LoxP (EcoRV)連接，連接反應(yīng)中加入2μ I載體，6μ I插入片段，1μ I 10Xbuffer，I μ I T4DNA連接酶，16°C溫浴16小時(shí)。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到E.coli的感受態(tài)細(xì)胞中。取一管50 μ I的Trans5 α感受態(tài)細(xì)胞置于冰上，待其融化后，向其中加入4μ I上述連接產(chǎn)物，輕彈混勻，后于冰上孵育30分鐘；42°C熱擊30秒，后冰上靜置10分鐘；加入500 μ I無抗性的LB液體培養(yǎng)基，37°C震蕩培養(yǎng)I小時(shí)；4，OOOrpm離心5分鐘，吸走，保留100 μ I左右的培養(yǎng)基，用移液器將細(xì)菌沉淀吹打均勻后涂布在含氨節(jié)和博萊雙抗性的LB培養(yǎng)基平板上。然后將平板置于37°C溫箱培養(yǎng)16小時(shí)?？寺∩L出來后，挑單克隆菌落至3ml含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)液中，37°C震蕩培養(yǎng)12小時(shí)，提取質(zhì)粒DNA，用EcoRI酶切鑒定，陽性克隆中可得到2.9kb和2.0kb的兩條DNA條帶。再通過測序進(jìn)一步確定陽性克隆的正確性，得到的克隆即為PZT1。實(shí)施例2:插入豬α-骨骼肌肌動(dòng)蛋白基因的啟動(dòng)子DNA片段，構(gòu)建pZT20。將pZTl用PvuI和NdeI雙酶切，酶切體系為2yg質(zhì)粒DNA，3y I 10Xbuffer,1.5μ I PvuI酶，1.5μ I NdeI酶，加入ddH20補(bǔ)足體積至30μ 1，37°C溫浴3小時(shí)。然后將酶切體系在I %的瓊脂糖凝膠中通過電泳分離，切出4.0kb大小的DNA條帶，用膠回收純化試劑盒純化DNA。具體步驟同上。通過全基因合成(InvitiOgen)得到2kb長度的豬α -骨骼肌肌動(dòng)蛋白基因的啟動(dòng)子DNA片段，用PvuI和NdeI雙酶切，酶切體系為3μ g質(zhì)粒DNA，3y I 10 X buffer,1.5 μ IPvuI酶，1.5μ I NdeI酶，加入ddH20補(bǔ)足體積至30μ 1，37°C溫浴3小時(shí)。然后將酶切體系在I %的瓊脂糖凝膠中通過電泳分離，切出2kb大小的DNA條帶，用膠回收純化試劑盒純化DNA。具體步驟同上。將pZTl (PvuI/NdeI)和豬α -骨骼肌肌動(dòng)蛋白基因的啟動(dòng)子DNA(PvuI/NdeI)連接，連接反應(yīng)同上。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到Ε.coli的感受態(tài)細(xì)胞中。具體步驟同上，除了只用博萊霉素進(jìn)行抗性篩選?？寺∩L出來后，挑單克隆菌落至3ml含博萊霉素的LB培養(yǎng)液中，37°C震蕩培養(yǎng)12小時(shí)，提取質(zhì)粒DNA，用EcoRI酶切鑒定，陽性克隆中可得到3.8kb和2.0kb的兩條DNA條帶。再通過測序進(jìn)一步確定陽性克隆的正確性，得到的克隆即為PZT20。實(shí)施例3:插入豬PEPCK-C編碼區(qū)域DNA片段，構(gòu)建pZT43。將ρΖΤ20 用 NdeI 和 KpnI 雙酶切，酶切體系為 2μ g質(zhì)粒 DNA，3y I 10Xbuffer,1.5μ I KpnI酶，1.5μ I NdeI酶，加入ddH20補(bǔ)足體積至30 μ 1，37°C溫浴3小時(shí)。然后將酶切體系在I %的瓊脂糖凝膠中通過電 泳分離，切出5.5kb大小的DNA條帶，用膠回收純化試劑盒純化DNA。具體步驟同上。通過全基因合成(Invitrogen)得到豬PEPCK-C編碼區(qū)域DNA片段，用NdeI和KpnI雙酶切，酶切體系為 3μ g 質(zhì)粒 DNA，3y I 10 X buffer,1.5 μ I PvuI 酶，L 5μ I NdeI 酶，力口入ddH20補(bǔ)足體積至30 μ 1，37°C溫浴3小時(shí)。然后將酶切體系在I %的瓊脂糖凝膠中通過電泳分離，切出2.1kb大小的DNA條帶，用膠回收純化試劑盒純化DNA。具體步驟同上。將pZT20 (KpnI/NdeI)和豬 PEPCK-C 編碼區(qū)域 DNA 片段(KpnI/Ndel)連接，連接反應(yīng)同上。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到E.coli的感受態(tài)細(xì)胞中。具體步驟同上，除了只用博萊霉素進(jìn)行抗性篩選?？寺∩L出來后，挑單克隆菌落至3ml含博萊霉素的LB培養(yǎng)液中，37°C震蕩培養(yǎng)12小時(shí)，提取質(zhì)粒DNA，用EcoRI酶切鑒定，陽性克隆中可得到3.3kb、2.1kb和2.0kb的三條DNA條帶。再通過測序進(jìn)一步確定陽性克隆的正確性，得到的克隆即為PZT43。實(shí)施例4:插入MCK增強(qiáng)子DNA片段，構(gòu)建pZT52。將ρΖΤ43 用 PvuI 酶切，酶切體系為 2 μ g 質(zhì)粒 DNA，3 μ I 10 X buffer,1.5 μ IKpnI酶，1.5μ I NdeI酶，加入ddH20補(bǔ)足體積至30μ 1，37°C溫浴3小時(shí)。然后將酶切體系在1%的瓊脂糖凝膠中通過電泳分離，切出7.5kb大小的DNA條帶，用膠回收純化試劑盒純化DNA。具體步驟同上。pZT43 載體的去磷酸化，35 μ I pZT43 (PvuI), 4 μ I IOXbuffer, I μ I 牛小腸堿性去磷酸化酶(CIP)，37°C溫浴I小時(shí)。然后將反應(yīng)體系在I %的瓊脂糖凝膠中通過電泳分離，切出7.5kb大小的DNA條帶，用膠回收純化試劑盒純化DNA。具體步驟同上。通過PCR擴(kuò)增得到MCK增強(qiáng)子DNA片段，PCR條件如下:I μ I (約IOng)模板DNAPST181，引物 I (gataCGATCGACGGGCCAGATATACGCGTTAGAA)和引物 2 (ccggCGATCGGGCGGGCCATTTACCGTAAGTTAT)的終濃度均為 0.5 μ M, dNTPs 的終濃度為 0.2mM, 5 μ I 10 X buffer, I μ IHiFi Taq酶，加入ddH20補(bǔ)足體積至50 μ I。PCR循環(huán)為，95°C，2分鐘；接著是95°C，30秒，550C，30秒，72 0C，30秒，35個(gè)循環(huán)；72°C，5分鐘；4°C，保溫。然后將PCR產(chǎn)物在I %的瓊脂糖凝膠中通過電泳分離，切出500bp大小的DNA條帶，用膠回收純化試劑盒純化DNA。具體步驟同上。用PvuI 酶切 MCK 增強(qiáng)子 DNA 片段，酶切體系為 3μ g DNA，4 μ I 10 X buffer, 3 μ IPvuI酶，加入ddH20補(bǔ)足體積至40μ 1，37°C溫浴3小時(shí)。然后將酶切體系在I %的瓊脂糖凝膠中通過電泳分離，切出500bp大小的DNA條帶,用膠回收純化試劑盒純化DNA。具體步驟同上。將pZT43(PvuI/CIP)和MCK增強(qiáng)子DNA片段(PvuI)連接，連接反應(yīng)同上。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到E.coli的感受態(tài)細(xì)胞中。具體步驟同上，除了只用博萊霉素進(jìn)行抗性篩選。克隆生長出來后，挑單克隆菌落至3ml含博萊霉素的LB培養(yǎng)液中，37°C震蕩培養(yǎng)12小時(shí)，提取質(zhì)粒DNA，用PvuI酶切鑒定，陽性克隆中可得到7.5kb和0.5kb的兩條DNA條帶。再通過測序進(jìn)一步確定陽性克隆的正確性，得到的克隆即為PZT52。
權(quán)利要求
1.一種提高豬的瘦肉率、肌間脂肪含量和生殖能力的轉(zhuǎn)基因載體，其特征在于，該轉(zhuǎn)基因載體含有小鼠的肌酸激酶增強(qiáng)子、2kb豬的α-骨骼肌肌動(dòng)蛋白基因的啟動(dòng)子、豬的PEPCK-C的cDNA和牛生長激素基因的3’端不翻譯區(qū)域，且?guī)в胁溉閯?dòng)物細(xì)胞中篩選用的抗性基因一嘌呤霉素基因和原·核細(xì)胞中篩選用的抗性基因-博萊霉素基因。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種提高豬的瘦肉率、肌間脂肪含量和生殖能力的轉(zhuǎn)基因載體，該轉(zhuǎn)基因載體含有小鼠的肌酸激酶(muscle creatine kinase，MCK)增強(qiáng)子、2kb豬的α-骨骼肌肌動(dòng)蛋白基因的啟動(dòng)子、豬的PEPCK-C的cDNA和牛生長激素基因的3’端不翻譯區(qū)域，且?guī)в胁溉閯?dòng)物細(xì)胞中篩選用的抗性基因--嘌呤霉素基因和原核細(xì)胞中篩選用的抗性基因-博萊霉素基因。本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因載體可應(yīng)用于體細(xì)胞克隆，以構(gòu)建高瘦肉率、高肌間脂肪含量和高生殖能力的PEPCK-Cmus轉(zhuǎn)基因豬。
文檔編號(hào)C12N15/85GK103074372SQ201110329199
公開日2013年5月1日 申請(qǐng)日期2011年10月26日 優(yōu)先權(quán)日2011年10月26日
發(fā)明者戴一凡, 陳凌懿 申請(qǐng)人:南開大學(xué)