與豬脂肪沉積性狀相關(guān)的snp遺傳標記及應用
【技術(shù)領域】
[0001] 本發(fā)明屬于豬的遺傳標記制備技術(shù)領域，具體設及一種豬脂肪沉積性狀相關(guān)的 SNP遺傳標記及應用，該遺傳標記是從豬ACADL基因中克隆獲得。
【背景技術(shù)】
[0002] 在豬育種工作中，育種者一直將提高瘦肉率和降低背腰厚作為主要育種目標。雖 然運種選育方式已取得了顯著的成效，但是它的遺傳選擇最終導致肌內(nèi)脂肪含量的下降， 進而導致豬肉品質(zhì)的下降。隨著消費者對肉質(zhì)要求的不斷提高，改善豬肉品質(zhì)的遺傳研究 已成為畜牧業(yè)的研究熱點。
[0003] 脂肪沉積性狀是豬生產(chǎn)和育種中最為重要的經(jīng)濟性狀指標之一。豬皮下脂肪的含 量，如背腰厚度，主要決定禍體品質(zhì)；而肌內(nèi)脂肪含量（IM巧主要影響豬肉的嫩度、多汁性 及加工后的風味等肉質(zhì)特征。豬脂肪沉積受到品種（遺傳）和環(huán)境兩大因素的影響?？?體而言，中國地方豬品種往往具有較強的脂肪沉積能力，表現(xiàn)在豬禍體脂肪含量高、肌內(nèi)脂 肪含量多，但生長速度緩慢、飼料轉(zhuǎn)化效率低；而國外引進品種由于受到長時間的選育，已 經(jīng)成功降低了背腰厚度，提高了禍體瘦肉率，但豬肉品質(zhì)有所下降，比如肌內(nèi)脂肪含量偏低 (<1.5% )，且易產(chǎn)生劣質(zhì)的PSE肉（肉色蒼白、松軟、滲水）。因此，不論國外引進品種還 是中國地方品種，其脂肪沉積性狀仍亟需改良。背腰厚（皮下組織脂肪含量）和肌內(nèi)脂肪 含量是兩個具有中等W上強度相關(guān)的脂肪沉積性狀，單純從表型上難W將兩者分別進行選 擇。如果能夠鑒別運些基因位點，并辨別出它們影響相關(guān)表型程度之間的差異性，則可開發(fā) 出用于某一表型特異性選擇的分子標記及相應檢測技術(shù)，準確改良該表型。
[0004] SNP標記指由基因組單核巧酸變異引起的DNA序列多態(tài)性，包括堿基轉(zhuǎn)換、顛換、 單堿基插入或缺失等。它是基因組中分布最廣泛而穩(wěn)定的點突變，在動植物的基因組中，存 在著大量的SNPs，對于大規(guī)模的研究而言，它比微衛(wèi)星標記和其他的重復序列更可靠，隨著 對SNP檢測和分析技術(shù)進一步發(fā)展，尤其是與DNA忍片等技術(shù)的結(jié)合，它已成繼第一代限制 性片段長度多態(tài)性標記和第二代微衛(wèi)星多態(tài)性標記之后的第=代新型分子標記。目前，各 國學者在遺傳育種方面已展開對SNPs的研究，作為新一代的遺傳標記技術(shù)，SNPs將在生物 的遺傳多樣性分析、基因標記、連鎖圖譜的構(gòu)建、基因組結(jié)構(gòu)與功能研究、遺傳改良和醫(yī)學 研究等領域發(fā)揮巨大作用。其檢測方法包括PCR-SSCP、PCR-RFLP、SNP忍片及測序等。
[0005]長鏈酷基輔酶A脫氨酶（a巧；L-CoAdehy化ogenase，longchainACADL)，是長鏈 脂肪酸P-氧化起始步驟的催化酶，在長鏈脂肪酸P-氧化中起著重要作用，其調(diào)控機制主 要包括調(diào)控表達W及調(diào)節(jié)其活性。輔酶A參與激活脂肪酸的代謝，脂肪酸的有效代謝可使 機體避免高甘油=醋和高膽固醇造成的健康危害，它具有傳遞乙酷基的功能，是機體內(nèi)乙 酷化酶的輔酶，在糖類、蛋白和脂質(zhì)的代謝中發(fā)揮著重要作用。ACADL不足或缺失造成的線 粒體功能素亂會引起肝臟脂肪變性或肝臟膜島素抗性化ongJi,MarkI.Re化cedCapacity forFattyAcidOxidationinRatswithInheritedSusceptibilitytoDiet-Induced 0besity[J].NIHPublicAccessAuthorManuscript, 2007, 56(8): 1124 - 1130)。蛋白質(zhì) 相互作用關(guān)系的網(wǎng)絡分析表明，參與脂肪代謝的ACADL蛋白是肉雞肝臟代謝反應的關(guān)鍵蛋 白（岳穎.不同基因型肉仔雞肝臟蛋白組學研究巧]:[碩±學位論文].北京：中國農(nóng)業(yè) 科學院，2013)。瘦蛋白（L巧能刺激脂肪組織分解，它能通過促進ACADL基因的轉(zhuǎn)錄和翻 譯，對脂肪酸在肝臟中的氧化代謝起到促進作用（張晶.豬脂肪沉積關(guān)鍵基因的初步篩選 扣]:[碩±學位論文].鄭州：河南農(nóng)業(yè)大學，2012)。目前，ACADL基因的研究主要集中在 人、小鼠、大鼠和牛等物種，對豬ACADL基因的研究報道較少，申請人對該基因在豬中進行 了多態(tài)性研究和關(guān)聯(lián)分析，為豬的遺傳改良提供了重要的技術(shù)基礎。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的在于獲得與脂肪沉積性狀相關(guān)的SNP分子標記及應用。從豬ACADL 基因克隆得到一個特異的DM片段，通過尋找SNP位點，并建立相應的SNP檢測方法，分析 該DNA片段與豬脂肪沉積性狀的關(guān)系，為豬的標記輔助選擇提供一種新的遺傳標記。
[0007] 本發(fā)明通W下列技術(shù)方案實現(xiàn)：
[0008] 申請人通過對豬ACADL基因的分離克隆，發(fā)現(xiàn)了一種與豬脂肪沉積性狀相關(guān)的 SNP分子標記，該標記的核巧酸序列如下所示：
[0010] 上述序列中的第498bp處的W是A或T，508bp處的R是A或G，由于沒有引起酶切 位點的改變，所W我們采用直接測序的方法進行檢測。 W11] 申請人設計了擴增上述豬ACADL基因片段的引物對（該引物對也是檢測本發(fā)明的 分子標記的引物對），其DNA序列如下所示： 陽01引 正向引物：5'GTGGAAAATGGAATGAAAG3'，與沈QIDNO: 2所示的序列對應。
[0013] 反向引物：5'CCAATAACCTGATGAGACT3'。與沈QIDN0:3所述的序列對應。
[0014] 本發(fā)明建立了一種篩選與豬脂肪沉積性狀相關(guān)的分子標記的方法，具體步驟如 下：
[0015] 提取豬基因組DNA，根據(jù)NCBI中公布的豬ACADL基因序列信息，設計PCR擴增引物 對（該引物的序列如序列表SEQIDN0:2和SEQIDN0:3所示），W大白豬、長白豬和梅山 豬基因組DNA為模板進行PCR擴增，PCR產(chǎn)物純化、克隆測序，獲得如圖3所示的核巧酸序 列（在圖3的序列中的W和R顯示堿基突變位置，498bp處的W是A或T，508bp處的R是A 或G)，并在大白X梅山F2代群體中進行基因型與豬脂肪沉積性狀之間的關(guān)聯(lián)分析檢測。
[0016] 本發(fā)明為豬脂肪沉積性狀的分子標記輔助育種提供了一個新的遺傳標記。
[0017] 更詳細的技術(shù)方案如《【具體實施方式】》所述。
【附圖說明】
[0018] 序列表SEQIDNO: 1是克隆的中國地方豬品種"大白豬"的核巧酸序列。序列長 度為69化P，其中在該序列的第498bp處存在一個A/T替換，第508bp出存在一個G/A替換。 (在圖5和圖6中顯示的序列中是已經(jīng)替換的堿基，突變位點分別是498bp和第508bp)。
[0019] 序列表SEQIDNO: 2和SEQIDNO: 3是本發(fā)明設計的引物對的DNA序列。
[0020] 序列表SEQIDN0:4是克隆的中國地方豬豬種"梅山豬"的核巧酸序列。序列長度 為69化P，其中在該序列的第498bp處存在一個T/A替換，第508bp出存在一個A/G替換。。
[0021] 圖1 :是本發(fā)明的總體技術(shù)路線圖。
[0022] 圖2 :是豬ACADL基因第6內(nèi)含子的擴增結(jié)果。
[0023] 瓊脂糖濃度為1. 5%;圖中標記說明：泳道M:DL2000Marker;泳道1-3分別為大白 豬、長白豬和梅山豬中的擴增片段，片段大小為69化P。
[0024] 圖3 :是豬ACADL基因片段核巧酸序列。圖中加粗帶框字母W和R代表堿基突變 位置，帶下劃線序列代表引物位置。 陽0巧]圖4 :本發(fā)明中檢測ACADL基因第6內(nèi)含子序列突變位點的測序圖譜。 陽0%] 圖5 :是本發(fā)明制備的遺傳標記的核巧酸序列（大白豬），序列長度為69化P，其中 在第498bp處存在一個A堿基突變，508bp出存在一個G堿基突變。
[0027] 圖6 :是本發(fā)明制備的遺傳標記的核巧酸序列（梅山豬），序列長度為69化P，其中 在第498bp處存在一個T堿基突變，508bp出存在一個A堿基突變。
【具體實施方式】
[0028] 實施例1豬ACADL基因片段的獲得及多態(tài)性檢測方法的建立 W29] 1、豬基因組DNA的提取
[0030] 本發(fā)明的試驗豬品種為大白豬、長白豬（為國外血緣豬品種）、梅山豬（為中國地 方豬血緣品種），樣品均由湖北省農(nóng)業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所動物胚胎與分子育種湖北省 重點實驗室提供，為常用品種。豬基因組DNA采用北京百泰克生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)的基 因組DNA試劑盒（按該試劑盒說明書進行操作）提取，具體步驟如下所述：
[0031] (1)采集20-50mg豬的耳組織，用眼科手術(shù)剪剪成糊狀后放入2ml的離屯、管中，加 入200y1裂解液化，用槍頭吹打均勻。
[0032] (2)加入20y1蛋白酶K(20mg/ml)，劇烈顛倒充分混勻，55°C水浴鍋中消化過夜。
[0033] (3)加入200y1結(jié)合液CB(該試劑盒自帶），充分顛倒混勻，70°C放置lOmin。
[0034] (4)冷卻后加入100ii1異丙醇，劇烈顛倒充分混勻。
[0035] (5)用1血的槍頭吸取上述混合物，加入吸附柱AC中，10000巧m離屯、30s，倒掉收 集管中的廢液。
[0036] (6)加入500uL抑制物去除液IR(該試劑盒自帶），1200化pm離屯、30s，棄廢液。
[0037] (7)加入700y1漂洗液WB，12000巧m離屯、30s，倒掉廢液。 陽〇3引 做重復操作步驟（7)。
[0039] (9)將吸附柱AC放回收集管中，12000巧m離屯、2min，盡量去除漂洗液，W免殘留的 乙醇抑制下游反應。 W40] (10)取出吸附柱AC，放入一個干凈的離屯、管中，向吸附膜的中間部位加 50-100y1洗脫緩沖液邸，室溫放置3-5min，12000巧m離屯、Imin，將溶液收集到離屯、管中。
[0041] (11)對提取出的DNA的濃度及質(zhì)量進行檢測后置于-20°C下保存?zhèn)溆谩?br>[0042] 2、豬ACADL基因片段的獲得
[0043] (l)PCR擴增
[0044] 根據(jù)ACADL基因的基因組序列（GenBank登陸號：NC_D89478. 1)設計W下引物對：
[0045]正向引物：5 'GTGGAAAATGGAATGAAAG3，，
[0046]反向引物：5，CCAATAACCTGATGAGACT3，。
[0047] 利用上述引物在大白豬、長白豬和梅山豬基因組DNA中進行PCR擴增，PCR反 應體系25yL體系中各組分的濃度為lOOng模板DNA、1Xhqbuffer2. 5mmol/X、