專利名稱：一種檢測(cè)轉(zhuǎn)基因植物成分的重組質(zhì)粒及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及包含酶或微生物的測(cè)定或檢驗(yàn)方法，具體涉及包括葉綠體 RBCL(ribulose, 1. 5-bisphosphate carboxylose large subunit，核SMH 1，二 舞酸幾化酶大亞基)基因的重組質(zhì)粒。
背景技術(shù)：
隨著轉(zhuǎn)基因生物(GMO)的迅速發(fā)展，其安全性在全球范圍內(nèi)引起激烈的爭(zhēng)論與普遍關(guān)注。為保障消費(fèi)者的知情權(quán)和選擇權(quán)，世界上許多國家和地區(qū)都制定了相應(yīng)的法律和法規(guī)，加強(qiáng)對(duì)進(jìn)出口轉(zhuǎn)基因植物及其產(chǎn)品的管理，這給為轉(zhuǎn)基因生物安全監(jiān)管提供技術(shù)支撐的轉(zhuǎn)基因檢測(cè)工作帶來更大的挑戰(zhàn)?；诤怂岬霓D(zhuǎn)基因檢測(cè)技術(shù)是轉(zhuǎn)基因檢測(cè)的重要方法。目前轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的核酸檢測(cè)方法主要有核酸分子雜交技術(shù)(southern blot)、PCR檢測(cè)技術(shù)和基因芯片技術(shù)。無論是哪種核酸檢測(cè)方法都必須以一種準(zhǔn)確、可靠、穩(wěn)定的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)作為陽性對(duì)照，以防止假陰性的出現(xiàn)。傳統(tǒng)的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)是以轉(zhuǎn)基因材料與其對(duì)應(yīng)的非轉(zhuǎn)基因材料按一定的質(zhì)量比例配制而成，目前主要依靠從國外購買，不僅價(jià)格高，還很不方便， 嚴(yán)重影響日常轉(zhuǎn)基因檢測(cè)工作及檢測(cè)技術(shù)研究的開展，因此亟需研制新型陽性對(duì)照材料。質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子是一種含有轉(zhuǎn)基因檢測(cè)目的外源基因和內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因的特異性片段的重組質(zhì)粒分子。與傳統(tǒng)的陽性標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)相比，質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子具有以下幾方面的優(yōu)點(diǎn)(1) 可以通過微生物進(jìn)行大量培養(yǎng)無限獲得，提取簡(jiǎn)便，且純度較高，用量少；( 可長期保存， 穩(wěn)定性好，使檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性得到很大的提高；C3)同一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)分子可以同時(shí)包含多個(gè)外源目的基因，經(jīng)濟(jì)又高效，是GMO鑒定檢測(cè)中是很好的標(biāo)準(zhǔn)陽性物質(zhì)替代物。因此構(gòu)建陽性標(biāo)準(zhǔn)分子已經(jīng)成為國際上轉(zhuǎn)基因檢測(cè)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。目前國際上所構(gòu)建的轉(zhuǎn)基因成分標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒分子都是將1個(gè)品種或品系的內(nèi)源參照基因和目的基因同時(shí)克隆到1個(gè)質(zhì)粒中，在做不同物種、不同品系轉(zhuǎn)基因成分檢測(cè)時(shí)， 需要多個(gè)標(biāo)準(zhǔn)分子，比較繁瑣。現(xiàn)有的轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品主要含轉(zhuǎn)基因植物成分。云南植物研究 2002,24(3) :334-340發(fā)表了題為《植物轉(zhuǎn)基因成分PCR檢測(cè)內(nèi)對(duì)照系統(tǒng)的建立》(作者 權(quán)潔霞等)一文，該文通過對(duì)23種植物的研究結(jié)果證實(shí)了植物葉綠體RBCL基因可作為內(nèi)源參照基因用于轉(zhuǎn)基因植物及其產(chǎn)品的檢測(cè)。現(xiàn)有商業(yè)化的轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品中絕大多數(shù)都含有 CaMV35S啟動(dòng)子或/和NOS終止子，目前也有針對(duì)CaMV35S啟動(dòng)子和NOS終止子檢測(cè)轉(zhuǎn)基因植物及其產(chǎn)品的相關(guān)報(bào)導(dǎo)，但CaMV35S啟動(dòng)子和NOS終止子的檢測(cè)主要用于已知產(chǎn)品配料和轉(zhuǎn)基因背景的產(chǎn)品檢測(cè)，對(duì)于未知產(chǎn)品配料和轉(zhuǎn)基因背景的產(chǎn)品(尤其是加工產(chǎn)品)，則由于缺乏通用的標(biāo)準(zhǔn)品或質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子而無法進(jìn)行準(zhǔn)確的判斷。因此制備一種通用的檢測(cè)轉(zhuǎn)基因成分的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子具有非常重要的意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種檢測(cè)轉(zhuǎn)基因植物成分的重組質(zhì)粒，使用重組質(zhì)粒可對(duì)轉(zhuǎn)基因植物及其產(chǎn)品進(jìn)行多靶點(diǎn)定性檢測(cè)，具有方便快捷的優(yōu)點(diǎn)。
本發(fā)明解決上述問題的技術(shù)方案是—種檢測(cè)轉(zhuǎn)基因植物成分的重組質(zhì)粒，該質(zhì)粒包括載體和基因片段，其特征在于， 所述的基因片段由葉綠體RBCL基因的特異性序列、CaMV35S啟動(dòng)子的特異性序列和NOS終止子的特異性序列融合構(gòu)成，其中，所述的葉綠體RBCL基因的特異性序列如SEQ ID NO. 1所示；所述的CaMV35S啟動(dòng)子的特異性序列如SEQ ID NO. 2所示；所述的NOS終止子的特異性序列如SEQ ID NO. 3所示。本發(fā)明所述的重組質(zhì)粒，其中所述的載體可以是常用的pMD-T系列載體，如， PMD18-T 或pMD19-T。本發(fā)明所述的重組質(zhì)粒，其中所述的基因片段的融合方法為常用重組DNA分子的方法，如，酶切連接法和接頭連接法。由于酶切連接法存在尋找酶切位點(diǎn)困難以及多個(gè)目的片段的連接需要進(jìn)行多次的酶切、連接，不僅操作繁瑣，而且連接效率較低，因此采用接頭連接法較為理想。針對(duì)本發(fā)明所述的基因片段，本發(fā)明人所推薦的連接順序依次是RBCL、 CaMV35S和N0S，其中，RBCL與CaMV!35S之間的接頭的序列如SEQ ID NO. 4所示，CaMV!35S與 NOS之間的接頭的序列如SEQ ID NO. 5所示。上述SEQ ID NO. 1至SEQ ID N0. 5所示序列的DNA片段可委托專業(yè)公司合成，也可從相關(guān)的植物產(chǎn)品中提取。為了節(jié)約資源，本發(fā)明人推薦以轉(zhuǎn)基因大豆GTS40-3-2為原料，并設(shè)計(jì)出特定的引物即可制備出含SEQ ID NO. 1 SEQ ID N0. 3所示序列的重組基因片段，具體制備方法如下所述。本發(fā)明所述的重組質(zhì)粒，其中所述的基因片段是以轉(zhuǎn)基因大豆GTS40-3-2為原料并采用下述引物對(duì)擴(kuò)增得到(I)擴(kuò)增葉綠體RBCL基因的特異性序列的引物對(duì)上游引物5，-AATCTTCTACTGGTACATGGAC-3，(SEQID N0. 6)，下游引物5，-GCCACCGGATCCACCGCCACCTCATCATCTTTGGTAAAATCAAG-3，(SEQID N0. 7)；(II)擴(kuò)增CaMV35S啟動(dòng)子特異性序列的引物對(duì)上游引物5，-GGTGGCGGTGGATCCGGTGGCGCTCCTACAAATGCCATCA-3，(SEQIDN0. 8)，下游引物5，-CAAGACCGGCAACAGGATTCGATAGTGGGATTGTGCGTCA-3'(SEQID N0. 9)；(III)擴(kuò)增NOS終止子特異性序列的引物對(duì)上游引物5，-TGACGCACAATCCCACTATCGAATCCTGTTGCCGGTCTTG-3，(SEQIDN0. 10)，下游引物5，-TTATCCTAGTTTGCGCGCTA-3，(SEQID N0. 11)。得到所述的重組基因片段后經(jīng)過割膠回收純化后按公知的方法插入商用載體即可得到本發(fā)明所述重組質(zhì)粒，該重組質(zhì)?？捎糜谵D(zhuǎn)基因植物成分的檢測(cè)，本發(fā)明所推薦的具體應(yīng)用方案如下一種快速檢測(cè)轉(zhuǎn)基因植物成分的多重PCR試劑盒，該試劑盒由引物、DNA聚合酶、 PCR反應(yīng)液和陽性對(duì)照品組成，其特征在于，所述的陽性對(duì)照品為本發(fā)明所述的重組質(zhì)粒；所述的引物分別為(A)擴(kuò)增葉綠體RBCL基因特異性序列的引物對(duì)
上游引物5，-TGTGGACCGATGGGCTTAC-3，(SEQID NO. 12)，下游引物5，-TGAGGCGGACCTTGGAAAG-3，(SEQID NO. 13)；(B)擴(kuò)增CaMV35S啟動(dòng)子特異性序列的引物對(duì)上游引物5，-GCTCCTACAAATGCCATCA-3，(SEQID NO. 14)，下游引物5，-GATAGTGGGATTGTGCGTCA-3，(SEQ ID NO. 15)；(C)擴(kuò)增NOS終止子特異性序列的弓丨物對(duì)上游引物5，-ATCCTGTTGCCGGTCTTG-3，(SEQ ID NO. 16)，下游引物5，-GTATAATTGCGGGACTCTAATC-3，(SEQ ID N0. 17)。由于RBCL是植物共同的內(nèi)參照基因，而其中的特異性序列(即SEQ ID NO. 1所示) 又是體現(xiàn)RBCL特異性的核心區(qū)域，且有80% 85%的商業(yè)化轉(zhuǎn)基因植物使用了 CaMV35S 啟動(dòng)子，90%以上的轉(zhuǎn)基因作物使用了 NOS終止子，因此本發(fā)明將外源基因RBCL、CaMV35S 和NOS插入商業(yè)載體所得到的重組質(zhì)粒用于檢測(cè)轉(zhuǎn)基因植物成分具有以下有益效果1、目前市售的轉(zhuǎn)基因農(nóng)產(chǎn)品的種類和品系繁多，如果采用現(xiàn)有的轉(zhuǎn)基因標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行鑒定，有關(guān)檢測(cè)單位各種不同的轉(zhuǎn)基因標(biāo)準(zhǔn)品就必須齊備，尤其是在對(duì)待檢產(chǎn)品的轉(zhuǎn)基因背景一無所知的情況下就無法進(jìn)行。而采用本發(fā)明所述的重組質(zhì)粒則可進(jìn)行初步排查， 然后再針對(duì)少數(shù)問題產(chǎn)品進(jìn)行準(zhǔn)確的基因分析，其資源之省、工作量之小是可預(yù)見的；2、本發(fā)明所述的基因片段由RBCL、CaMV35S和NOS的特異性序列(即SEQ ID NO. 1 3)融合構(gòu)成，因此檢測(cè)的特異性更強(qiáng)。3、由于轉(zhuǎn)基因大豆GTS40-3-2是一種標(biāo)準(zhǔn)品，且其內(nèi)同時(shí)含有RBCL、CaMV35S和 NOS三種基因，因此本發(fā)明所述的基因片段不僅容易獲得，而且方法簡(jiǎn)單。


圖1為本發(fā)明所述基因片段的重組流程及原理示意圖。圖2為本發(fā)明所述重組質(zhì)粒的一種具體實(shí)施的結(jié)構(gòu)示意圖。
具體實(shí)施例方式下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件操作，例如 Sambrook 等編著的分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(New York Co Id Spring Harbor Laboratory Press, 2001)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。為了描述方便，下述實(shí)施例中，用代號(hào)RBCL-CaMV35S_N0S表示本發(fā)明所述的基因片段，用代號(hào)pMD-RBCL-CaMV35S-N0S表示采用商用載體PMD18-T所構(gòu)建的重組質(zhì)粒。例1 重組質(zhì)粒 pMD-RBCL_CaMV;35S-NOS 的構(gòu)建一、實(shí)驗(yàn)材料轉(zhuǎn)基因大豆GTS40-3-2，購自歐洲IRMM公司。二、試劑PMD18-T載體、T4DNA連接酶及緩沖液、2Xpremix Taq DNA聚合酶及其緩沖液 DL2000 Marker購自寶生物工程(大連)有限公司；PCR產(chǎn)物回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒購自O(shè)MEGA生物技術(shù)有限公司；CTAB，Tris，EDTA等其他生化試劑購自廣州學(xué)友生物技術(shù)有限公司；Dffia感受態(tài)菌株由本實(shí)驗(yàn)室保存；引物由上海英濰捷基生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。三、主要儀器設(shè)備C1000 型 PCR 儀(Bio-Rad Laboratories, Inc.)Gel 型凝膠成像系統(tǒng)(Bio-fcid Laboratories, Inc.)Biophotometer plus 紫夕卜分光光度計(jì)(Eppendorf, Inc.)其他儀器包括恒溫水浴鍋，離心機(jī)，恒溫培養(yǎng)箱，電子天平，微量移液器等。四、實(shí)驗(yàn)方法和過程1、引物設(shè)計(jì)通過GenBank查詢和檢索相關(guān)國內(nèi)外文獻(xiàn)資料獲得植物內(nèi)參照基因RBCL， CaMV35S啟動(dòng)子和NOS終止子特異性序列。根據(jù)獲得的序列信息，利用I^rimer Premier 5 軟件，設(shè)計(jì)三對(duì)定性PCR引物，分別用于擴(kuò)增RBCL基因、CaMV35S啟動(dòng)子特異性序列和NOS 終止子特異性序列。RBCL基因特異性序列擴(kuò)增引物由RBCL-F和RBCL-R組成，RBCL-R帶有含21個(gè)寡核苷酸的接頭。CaMV35S啟動(dòng)子特異性序列引物由35S-F和組成，35S-F帶有含 21個(gè)寡核苷酸的接頭，且與RBCL-R引物的接頭互補(bǔ)。NOS終止子特異性序列引物由NOS-F 和NOS-R組成。35S-R與NOS-F完全互補(bǔ)。2、特異性序列擴(kuò)增2. 1 總 DNA 提取(1)稱取Ig轉(zhuǎn)基因大豆GTS40-3-2樣品至50mL離心管中。(2)加入10mL65°C預(yù)熱的CTAB提取緩沖液和RNase A酶，顛倒混勻后于65°C溫育30min，期間顛倒混勻離心管2-3次，12000rpm離心機(jī)，離心lOmin，轉(zhuǎn)移2_4mL上清液至 IOmL離心管中。(3)加入與上清等體積的三氯甲烷，顛倒混勻后，12000rpm離心機(jī)，離心lOmin，轉(zhuǎn)移上清液至IOmL離心管中。(4)加入2 X體積的CTAB沉淀液，顛倒混勻后，室溫靜置Ih ； 12000rpm離心機(jī)，離心lOmin，棄上清。(5)向沉淀中加入400 μ L氯化鈉溶液，使沉淀溶解，轉(zhuǎn)移溶解液至 1. 5mLEppendorf 離心管。(6)在溶解液中加入等體積三氯甲烷，顛倒混勻，用12000rpm離心機(jī)，離心lOmin， 轉(zhuǎn)移上層水相至1. 5mLEppendorf離心管。(7)加入0. 6倍體積4 V預(yù)冷的異丙醇，顛倒混勻后，4 °C下靜置30min， 4°C 12000rpm離心機(jī)，離心lOmin，小心棄去上清液。(8)加入700 μ L4°C預(yù)冷的70%乙醇，傾斜離心管，輕轉(zhuǎn)數(shù)圈后，4°C 12000rpm離心機(jī)，離心lOmin，小心棄去上清液。(9)重復(fù)一次，室溫或核酸真空干燥系統(tǒng)中揮干液體。(10)加50 μ LTE緩沖溶液溶解，調(diào)整濃度至100ug/mL，_20°C保存?zhèn)溆谩?. 2PCR 擴(kuò)增PCR擴(kuò)增的引物見表1。2. 2. 1 重組片段 RBCL-35S 的 PCR 擴(kuò)增根據(jù)表1列出的引物，以轉(zhuǎn)基因大豆GTS40-3-2陽性標(biāo)準(zhǔn)品基因組DNA為模板，進(jìn)行特異性序列擴(kuò)增，反應(yīng)體系和程序見表2和表3。獲得454bp的RBCL基因特異性序列 (RBCL基因43!3bp，接頭為21bp)與CaMV35S基因特異性序列(CaMV35S基因l%bp，接頭為 21bp)。表1引物設(shè)計(jì)表
權(quán)利要求
1.一種檢測(cè)轉(zhuǎn)基因植物成分的重組質(zhì)粒，該質(zhì)粒包括載體和基因片段，其特征在于，所述的基因片段由葉綠體RBCL基因的特異性序列、CaMV35S啟動(dòng)子特異性序列和NOS終止子的特異性序列融合構(gòu)成，其中，所述的葉綠體RBCL基因的特異性序列如SEQ ID NO. 1所示； 所述的CaMV35S的特異性序列如SEQ ID NO. 2所示； 所述的NOS終止子的特異性序列如SEQ ID NO. 3所示。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組質(zhì)粒，其特征在于，所述的基因片段是以轉(zhuǎn)基因大豆 GTS40-3-2為原料并采用下述引物對(duì)擴(kuò)增得到(I)擴(kuò)增葉綠體基因RBCL的特異性序列的引物對(duì) 上游引物5’ -AATCTTCTACTGGTACATGGAC-3，，下游引物5’ -GCCACCGGATCCACCGCCACCTCATCATCTTTGGTAAAATCAAG-3，；(II)擴(kuò)增35S啟動(dòng)子基因CaMV35S的特異性序列的引物對(duì)上游引物5，-GGTGGCGGTGGATCCGGTGGCGCTCCTACAAATGCCATCA-3，， 下游引物5，-CAAGACCGGCAACAGGATTCGATAGTGGGATTGTGCGTCA-3，；(III)擴(kuò)增終止子基因NOS的特異性序列的引物對(duì)上游引物5’ -TGACGCACAATCCCACTATCGAATCCTGTTGCCGGTCTTG-3，， 下游引物5’ -TTATCCTAGTTTGCGCGCTA-3。
3.一種快速檢測(cè)轉(zhuǎn)基因植物成分的多重PCR試劑盒，該試劑盒由引物、DNA聚合酶、PCR 反應(yīng)液和陽性對(duì)照品組成，其特征在于，所述的陽性對(duì)照品為權(quán)利要求1所述的重組質(zhì)粒； 所述的引物分別為(A)擴(kuò)增葉綠體基因RBCL特異性序列的引物對(duì) 上游引物5’ -TGTGGACCGATGGGCTTAC-3，，下游引物5，-TGAGGCGGACCTTGGAAAG-3，；(B)擴(kuò)增轉(zhuǎn)基因植物成分CaMV35S啟動(dòng)子特異性序列的引物對(duì) 上游引物5，-GCTCCTACAAATGCCATCA-3，，下游引物5，-GATAGTGGGATTGTGCGTCA-3，；(C)擴(kuò)增轉(zhuǎn)基因植物成分NOS終止子特異性序列的引物對(duì) 上游引物5’ -ATCCTGTTGCCGGTCTTG-3，，下游引物5’ -GTATAATTGCGGGACTCTAATC-3，。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種檢測(cè)轉(zhuǎn)基因植物成分的重組質(zhì)粒，該質(zhì)粒包括載體和基因片段，其特征在于，所述的基因片段由葉綠體RBCL基因的特異性序列、花椰菜花葉病毒35S(CaMV35S)啟動(dòng)子的特異性序列和根農(nóng)桿菌(NOS)終止子的特異性序列融合構(gòu)成，其中，所述的葉綠體RBCL基因特異性序列如SEQ ID NO.1所示；所述的CaMV35S啟動(dòng)子特異性序列如SEQ ID NO.2所示；所述的NOS終止子特異性序列如SEQ ID NO.3所示。本發(fā)明所述的重組質(zhì)粒及其配套的多重PCR試劑盒可用于轉(zhuǎn)基因植物及其產(chǎn)品的多靶點(diǎn)定性檢測(cè)，具有方便快捷的優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號(hào)C12N15/63GK102392040SQ201110355470
公開日2012年3月28日 申請(qǐng)日期2011年11月10日 優(yōu)先權(quán)日2011年11月10日
發(fā)明者劉唐書, 周琳華, 肖維威, 馬文麗 申請(qǐng)人:南方醫(yī)科大學(xué)