專利名稱：鏈格孢屬真菌xnsp-MG1及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于微生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種新的鏈格孢屬菌，具體涉及一種鏈格孢屬菌xnsp-MGl及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
白藜蘆醇(resveratrol，3, 4’，5_三羥基二苯乙烯)是葡萄酒中主要的生物活性多酚。自1992年被認定為葡萄酒中預(yù)防心血管疾病的重要成分以來，白藜蘆醇越來越多地被證明具有預(yù)防和減緩癌癥、心血管疾病及缺血性損傷等多種疾病的功能，并有增強抗逆性和延長從酵母到脊椎動物多種生物生命的功效。 目前，人們普遍認為葡萄原料是決定酒中白藜蘆醇含量的主要因素。雖然人們也嘗試了其它方法來提高葡萄在采后和葡萄酒釀造過程中的白藜蘆醇含量，如在葡萄采后進行短時低溫處理、紫外照射等方法可以提高葡萄中白藜蘆醇含量，但其提高幅度有限。也有人將植物中控制白藜蘆醇合成的關(guān)鍵酶基因轉(zhuǎn)入酵母中，從而在葡萄酒發(fā)酵過程中合成白藜蘆醇，但表達結(jié)果尚不夠理想。

發(fā)明內(nèi)容
針對現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題與缺陷，本發(fā)明的目的在于提供一種新的鏈格孢菌，該菌能夠在發(fā)酵的過程中產(chǎn)生大量的白藜蘆醇。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案如下
一種鏈格孢屬(Alternaria. sp. ) xnsp-MGl (以下簡稱MGl),于2011年10月12日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號為CCTCC NO :M2011348，保藏地址中國武漢武漢大學(xué)。本發(fā)明還有一個目的是提供MGl在發(fā)酵產(chǎn)生白藜蘆醇中的應(yīng)用。本發(fā)明的MGl是從釀酒葡萄梅洛特的葡萄梗中分離出的，MGl發(fā)酵能夠產(chǎn)生大量的白藜蘆醇，而且生產(chǎn)能力穩(wěn)定。


圖I植物內(nèi)生菌分離純化至形態(tài)學(xué)鑒定中所用培養(yǎng)基的作用流程圖。圖2白藜蘆醇混標色譜圖。圖3菌株MGl的發(fā)酵液的液相色譜圖。圖4碳源種類對菌株MGl生長的影響直線。圖5氮源種類對菌株MGl生長的影響直線。圖6金屬離子對菌株MGl生長的影響直線。圖7培養(yǎng)溫度對菌株MGl生長的影響曲線。
圖8菌株MGl菌落特征顯微鏡圖。圖9a b菌株MGl的分生孢子和分生孢子著生方式形狀圖。圖10利用菌株MGl的ITS區(qū)基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹。圖11菌株MGl在液體發(fā)酵中的菌體生長曲線(□)與白藜蘆醇產(chǎn)生曲線。圖12 a d分別是接種量、裝液量、搖床轉(zhuǎn)速和培養(yǎng)溫度對菌株MGl發(fā)酵產(chǎn)生白藜蘆醇影響的曲線。圖13 a c分別是接種量與裝液量、裝液量與搖床轉(zhuǎn)速、裝液量與培養(yǎng)溫度間交互作用對菌株MGl發(fā)酵產(chǎn)生白藜蘆醇影響的曲線。
具體實施方式

以下結(jié)合發(fā)明人給出的附圖和具體試驗例及具體實施例來進一步說明本發(fā)明MGl的有益效果和制備方法。實施例I I材料與方法
I.I材料
I.I. I植物分離源梅洛特葡萄，于2010年8月初采自西北農(nóng)林科技大學(xué)葡萄種植資源圃，八成熟。I. I. 2培養(yǎng)基(I)菌種分離純化用培養(yǎng)基馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA)，牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基，高氏I號瓊脂培養(yǎng)基。(2)液體培養(yǎng)基馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基(PDB)，高氏一號液體培養(yǎng)基，牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基。(3)菌種鑒定培養(yǎng)基馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA)，馬鈴薯胡蘿卜瓊脂培養(yǎng)基(PCA)，察貝克氏培養(yǎng)基(Czapek)。I. I. 3主要儀器與試劑分析純級無水乙醇(天津博迪化工股份有限公司)，分析純級乙酸乙酯(天津博迪化工股份有限公司)，色譜純級甲醇(sigma公司)，色譜純級乙腈(sigma公司)，白藜蘆醇標品純度99% (中檢所)，Biospin真菌基因組DNA提取試劑盒(BioFlux 公司)，F(xiàn)ungal Identification PCR Kit (D317)試劑盒(大連寶生物公司)，分子生物學(xué)級瓊脂糖(Invitrogen公司)。Motic BA 400數(shù)碼成像光學(xué)顯微鏡(麥克奧迪公司)，TC-200型PCR擴增儀(美國伯樂公司)，Bio-Rad全自動凝膠成像系統(tǒng)(美國伯樂公司)。高效液相色譜系統(tǒng)LC-15C液相送液單元、SPD-15C紫外可見雙波長檢測器、CBM-20A控制器、SIL-IOAF自動進樣器(日本島津公司)，數(shù))11(1&811型(18色譜分析柱(250\4.6臟)(日本島津公司)，CT0-15C柱溫箱柱溫箱(日本島津公司)。I. 2實驗方法
I.2. I MGl的分離取新鮮的梅洛特葡萄的果實皮層、梗部及穗軸，將其在70%酒精中浸泡lmin，然后用3%次氯酸鈉(有效氯)溶液處理2min，再用無菌水清洗3次；之后使用無菌解剖刀將這些組織切成約5mmX 5mm大小的小塊，切面向下，每個部位的組織塊都分別放置于3種分離純用培養(yǎng)基上，每個處理設(shè)2個重復(fù)，于28°C培養(yǎng)3-7d。培養(yǎng)期間，將長出的菌絲體或菌落用接種針及時轉(zhuǎn)接到與分離用培養(yǎng)基相應(yīng)的新鮮固體培養(yǎng)基上，并用劃線法進行分離純化，直至純種。為了確保表面消毒徹底，將最后一次清洗水分別涂布于不同培養(yǎng)基上，在相同條件下進行培養(yǎng)，作為對照。如對照中無菌生長，則說明表面消毒徹底，能夠保證分離到的真菌是植物內(nèi)生菌而不是空氣中或植物分離源表面的附著菌。將用不同分離培養(yǎng)基獲得的菌種轉(zhuǎn)移至與其分離用培養(yǎng)基相同固體斜面上，在28°C下培養(yǎng)5d后取出，在4°C下保存，以供后續(xù)檢驗工作所需。1.2.2 MGl的篩選將分離純化后的各微生物菌種用三點接種法接種到與其保存用斜面培養(yǎng)基相同的固體平板培養(yǎng)基上，在28°C下培養(yǎng)活化5d后，用無菌水制成孢子或細菌懸浮液(血球板計數(shù)板計數(shù)，控制其濃度約為I X 107/ml);再取5ml上述懸浮液接種到與各菌種分離純化時所用培養(yǎng)基相應(yīng)的液體培養(yǎng)基中(250ml三角瓶裝料100ml)，在28°C、IOOr/ min的條件下發(fā)酵7d。發(fā)酵結(jié)束后,將培養(yǎng)物離心(4000 r/min,離心15 min),取上清液保存待用。收集沉淀下來的菌體，在_40°C下冷凍IOmin后研磨粉碎，將研碎的菌體與80%的乙醇水溶液以I :15的比例進行混合，在28°C 下浸泡IOh后，用70°C水浴回流2h，再進行過濾,收集濾液,殘渣用15倍體積的80%乙醇溶液進行重新浸泡、水浴回流、過濾、收集濾液，如此重復(fù)總共3次。最后，將每次收集到的浸提濾液與發(fā)酵液進行合并，再在60°C下減壓濃縮至IOOmL,再用50mL乙酸乙酯萃取3次；取乙酸乙酯層，用3%NaHC03 (體積比)溶液洗滌3次，棄去NaHCO3溶液層；殘液在50°C下減壓濃縮至干；殘留物用2. OmL甲醇溶解后，過O. 45 μ m微孔濾膜，用高效液相法檢測其中的白藜蘆醇濃度。液相檢測白藜蘆醇的檢測條件使用C18柱，采用二元梯度洗脫，流動相A為乙腈，B為水。起始為5% A, 95% B,保持5min ；28min時調(diào)整A為60%，B為40% ；33min時A為85%，B為15%，保持2min ； 40 min時A為5%，B為95% ;最后，平衡柱子，進下一個樣。進樣流速為I. OmL/min,柱溫為30°C,檢測波長為306nm ;進樣體積為20 μ I。根據(jù)白藜蘆醇標準品出峰時的保留時間對樣品中白藜蘆醇進行定性分析，并根據(jù)峰面積值計算樣品中反式白藜蘆醇含量。I. 2. 3 xnsp-MGl的分類鑒定結(jié)合菌種在固體培養(yǎng)基上的形態(tài)學(xué)特性、微觀特性及分子生物學(xué)特性對其進行分類鑒定。選用點接法將分離到各菌種接種到鑒定培養(yǎng)基上，進行插片培養(yǎng)。其中，鏈格孢屬用馬鈴薯胡蘿卜瓊脂培養(yǎng)基(PCA，馬鈴薯200g，胡蘿卜25g，瓊脂 20g，水 1000ml,自然 pH)，曲霉用 Czapek 培養(yǎng)基(NaNO3 2g，K2HPO4 lg, KCl 0. 5g，MgSO4
O.5g，F(xiàn)eSO4 0.018，蔗糖3(^，瓊脂15 2(^，水1000ml,自然pH)，其它真菌用PDA培養(yǎng)基(馬鈴薯200g，水1000ml，葡萄糖10_20g，瓊脂17_20g，自然pH)作為形態(tài)鑒定用培養(yǎng)基。整個分離純化、產(chǎn)白藜蘆醇能力檢驗及形態(tài)學(xué)鑒定中所用培養(yǎng)基的流程如圖I所
/Jn ο選取一株白藜蘆醇產(chǎn)量最高的微生物菌株進行分子生物學(xué)分類鑒定。即通過rDNAITS區(qū)序列分析進行分子確認。操作時，先將供試菌株接種于PDB培養(yǎng)基，在28°C、IOOr/min下培養(yǎng)3d后離心(4000 r/min，離心15 min)，收集沉淀下來的菌絲體于_40°C下凍存。使用時，取出凍存的菌絲體，在液氮條件下充分研磨后使用Biospin真菌基因組DNA提取試劑盒提取待測菌種的總DNA ;之后用Fungal Identification PCR Kit (D317)試劑盒進行ITS區(qū)全序列(包括ITSl、5. 8S rDNA、ITS2)PCR擴增，擴增條件為94°C預(yù)變性IOmin ；94°C變性lmin，55°C退火lmin，72°C延伸lmin，共30個循環(huán)；最后72°C下延至7min，終止溫度4°C。PCR完成后，取5. O μ IPCR產(chǎn)物在I. 0%瓊脂糖凝膠中進行電泳，紫外燈下檢測。I. 2. 3系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建將測得的ITS區(qū)基因序列提交給GenBank，并用Blastn 功能將測得的 rDNA 序列在 GenBank ( http://www. ncbi. nlm. nih. gov)中進行同源性比對，提取同源性高的序列并使用Phylip (version 3. 68)軟件包構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，確定待測菌株與庫中已有記錄間的親緣關(guān)系。2結(jié)果與分析
2.I MGl的篩選
將用各種培養(yǎng)基分離得到的菌株進行液體發(fā)酵后，按照I. 2. 2所述方法進行處理，獲得發(fā)酵液提取液。再用HPLC按照I. 2. 2所述液相條件分析其發(fā)酵產(chǎn)生白藜蘆醇的能力。白藜蘆醇標樣的液相圖譜如圖2所示，A :反式白藜蘆醇；B :順式白藜蘆醇。菌株MGl的發(fā)酵液的液相色譜圖如圖3所示，A :反式白藜蘆醇。檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在所分離到的30株內(nèi)生菌中，只有7株能在發(fā)酵條件下產(chǎn)生白藜蘆醇，其中3株是用Gause’s I培養(yǎng)基從葡萄軸中分離得到的，其它4株均來自于葡萄皮(I株用Gause’s I分離得到，3株用PDA培養(yǎng)基分得到K表I)。在發(fā)酵產(chǎn)白藜蘆醇的菌株中，5株在發(fā)酵液中的白藜蘆醇產(chǎn)量小于40 μ g/1，只有2株菌的產(chǎn)量較高，分別為MGl (97μ g/1)和菌株MP15 (951^/1)。其中MGl是 用Gause’s I培養(yǎng)基從葡萄軸中分離得到，MP15是用PDA培養(yǎng)基從葡萄皮中分離得到。這說明(1)能夠發(fā)酵產(chǎn)生白藜蘆醇的葡萄內(nèi)生菌主要是內(nèi)生真菌；(2)葡萄中能夠發(fā)酵產(chǎn)生白藜蘆醇的內(nèi)生菌主要存在于葡萄軸和葡萄皮中；(3)采用高氏I號培養(yǎng)基和PDA培養(yǎng)基均能獲得白藜蘆醇產(chǎn)量較高的葡萄內(nèi)生真菌。表IMGl的形態(tài)特征
權(quán)利要求
1.鏈格孢屬(Alternaria.sp. ) xnsp-MGl，保藏號為CCTCC NO: M2011348。
2.權(quán)利要求I所述的鏈格孢屬(Alternaria.sp. )xnsp-MGl在發(fā)酵產(chǎn)生白藜蘆醇中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種鏈格孢屬 (Alternaria.sp.)xnsp-MG1，該菌株已于2011年10月12日在中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，保藏編號CCTCCNOM2011348。該菌株MG1是從釀酒葡萄梅洛特的葡萄梗中分離出的，其發(fā)酵不僅能夠產(chǎn)生大量的白藜蘆醇，而且生產(chǎn)能力穩(wěn)定。
文檔編號C12P7/22GK102719362SQ201110374849
公開日2012年10月10日 申請日期2011年11月23日 優(yōu)先權(quán)日2011年11月23日
發(fā)明者師俊玲 申請人:西北農(nóng)林科技大學(xué)