專利名稱：一種大通量鑒定蘇云金芽孢桿菌毒力基因的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種鑒定蘇云金芽孢桿菌毒性基因的方法及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
蘇云金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis，簡稱Bt)是一種革蘭氏陽性細(xì)菌，它的分布極為廣泛，在芽孢形成的同時可形成具有殺蟲活性的由蛋白質(zhì)組成的伴胞晶體，又名殺蟲晶體蛋白Gnsectididal crystal proteins，簡稱ICPs)，ICPs是由cry基因編碼的，對敏感昆蟲有強(qiáng)烈毒性，而對高等動物和人無毒性。近幾十年來，Bt已廣泛應(yīng)用于控制多種鱗翅目、雙翅目、鞘翅目等害蟲。此外，Bt還對膜翅目、同翅目、直翅目、食毛目等多種害蟲及植物病原線蟲、螨類、原生動物有控害作用。目前在農(nóng)田害蟲、森林害蟲及衛(wèi)生害蟲的防治中Bt已成為化學(xué)合成農(nóng)藥的有力替代品，Bt還是轉(zhuǎn)基因抗蟲工程植物重要的基因來源。自1981年khn印f從菌株HD-IDipel中克隆了第一個能表達(dá)殺蟲活性的基因以來，人們已經(jīng)分離克隆了 390多種編碼殺蟲晶體蛋白的基因，根據(jù)編碼的氨基酸序列同源性它們被分別確定為不同的群、亞群、類和亞類。一般而言，Cryl，Cry2和Cry9等毒蛋白對鱗翅目害蟲有效；其中研究的最多的是Cryl和Cry9類蛋白，它們編碼的殺蟲晶體蛋白分子量為130-140kD，許多基因目前已被廣泛應(yīng)用于植物的鱗翅目害蟲的防治。蘇云金芽胞桿菌以色列亞種(B. thuringiensis subsp. israelensis，簡稱Bti)產(chǎn)生的毒素蛋白對蚊蟲具有很好殺蟲活性，被廣泛運(yùn)用于蚊蟲的防治。同時，Cyt蛋白具有溶細(xì)胞性，對某些Cry蛋白具有增效作用及延緩昆蟲的抗性。由于大規(guī)模和反復(fù)使用蘇云金芽胞桿菌，許多昆蟲種群已相繼在不同程度上對殺蟲晶體蛋白產(chǎn)生了抗性。上世紀(jì)80年中期開始，抗性問題不斷在實驗室及田間試驗中得到證實(M cGaughey，W. H. 1985. Science. 229 :193-195)，原因主要是持續(xù)使用單品種的Bt以及Bt轉(zhuǎn)基因抗蟲植物的應(yīng)用造成昆蟲種群長期受到殺蟲劑的選擇壓力。1985年， McGaughey 報道倉庫谷物害蟲印度谷螟(Plodia interpunctella)在 Dipel (Bt subsp. kurstaik HD-I的商品制劑)的選擇壓力下，繁殖15代后，抗性增加97倍；在高劑量選擇壓力下，抗性可增加250倍。1990年，在夏威夷首次證實大田中的小菜蛾對Bt殺蟲劑產(chǎn)生了明顯的抗性(Tabashnik，B E，et al. 1994. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 91 :4120-4124)，上世紀(jì)90年代以來，在我國應(yīng)用Bt殺蟲劑時間較長的深圳、廣州、上海等地，發(fā)現(xiàn)Bt殺蟲劑對小菜蛾防治效果明顯下降，意味著抗性已經(jīng)形成。目前發(fā)現(xiàn)在實驗室及田間至少有十幾種昆蟲對Bt及其殺蟲晶體蛋白產(chǎn)生了抗性，用選擇壓力數(shù)學(xué)模型預(yù)測到，在Bt轉(zhuǎn)基因抗蟲植物選擇壓力的條件下，昆蟲將會產(chǎn)生抗性。為避免抗性昆蟲所造成的損失，尋找新的高毒力基因資源是解決這個問題的有效途徑，這對我國的生物防治有著十分重要的意義。而傳統(tǒng)的尋找新基因的方法幾乎都是基于PCR，常用的方法有多重PCR，PCR-RFLP, Exclusive PCR，隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA (RAPD)鑒定，核酸分子雜交，基因芯片，蛋白鑒定。這些方法都有其缺點以及不足，例如采用PCR相關(guān)方法需要合成大量的引物，對于不同的基因類型需要進(jìn)行多次的PCR，十分耗時。核酸分子雜交，則需要合成大量的DNA探針等，這些方法對于一些與已發(fā)現(xiàn)的基因同源性低，很新的基因不能有效的識別，因此會失去大量的新模式基因。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于針對傳統(tǒng)鑒定新基因方法的不足提供一種新的鑒定Bt毒力基因資源的方法。本發(fā)明的目的還在于提供一種大規(guī)模、高通量的獲得Bt毒力基因的方法。本發(fā)明的技術(shù)方案如圖1所示。本發(fā)明是混合多株Bt菌株的基因組，進(jìn)行測序， 通過測序結(jié)果的組裝，結(jié)合與數(shù)據(jù)庫PFAM，GO, KEGG，Trimble的比對結(jié)果，提取毒力基因相關(guān)的CDS序列，通過NCBI的比對結(jié)果對所選的毒力基因相關(guān)CDS進(jìn)行分類，可鑒定出總基因組中所含的基因類型。再根據(jù)比對結(jié)果設(shè)計相應(yīng)的引物，提取所選菌株的基因組，使用所設(shè)計的引物對待測菌株的基因組進(jìn)行PCR擴(kuò)增，克隆得到大量的Bt毒力基因。本發(fā)明提供了一種高通量鑒定細(xì)菌功能基因的方法，包括以下步驟(1)選取在光學(xué)顯微鏡或者掃描電鏡下具有伴胞晶體的菌株作為目標(biāo)菌株，提取質(zhì)粒和基因組后，混合；(2)對混合后的質(zhì)粒和基因組進(jìn)行小片段文庫測序，將測序數(shù)據(jù)進(jìn)行組裝，得到測序短序列(reads)組裝為長的片段重疊群(contigs)進(jìn)而組裝為一定長度的片段 (scaffolds)；(3)利用軟件分析步驟O)中片段(scaffolds)中的開放閱讀框ORFs，與生物信息數(shù)據(jù)庫比對進(jìn)行注釋得到與功能基因具有同源性的0RF-1 ；(4)將步驟(3)獲得的ORFs-I與現(xiàn)有菌種的功能基因比對，鑒定出與功能基因具有同源性的ORFs-2，即鑒定出總基因組中所含的基因類型。進(jìn)一步，可根據(jù)上述步驟(4)中同源性的ORFs-2設(shè)計引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，克隆獲得細(xì)菌的功能基因。優(yōu)選地，所述細(xì)菌為蘇云金芽孢桿菌。優(yōu)選地，所述功能基因可以為cry、cyt、vip毒力基因、毒力因子調(diào)控基因和/或轉(zhuǎn)
錄基因。其中，步驟O)中所述的數(shù)據(jù)組裝，其參數(shù)為kmer 63。其中，步驟(3)中所述的與生物信息數(shù)據(jù)庫為KEGG、PFAM、GO、NR、Swiss-Prot和 / 或 TrEMBL。其中，NR、KEGG、Swiss-Prot和 TrEMBL 采用的是 Blast，其參數(shù)為 e-value Ie-5 ； PFAM的注釋采用的是hterPrc^can，GO的注釋基于NR注釋結(jié)果的Blast2G0比對。本發(fā)明提供了上述方法在細(xì)菌毒力資源鑒定中的應(yīng)用。本發(fā)明還提供了一種大規(guī)模獲得蘇云金芽孢桿菌毒力基因的方法，包括以下步驟(1)選取具有伴胞晶體的晶體類型豐富的Bt菌株，提取質(zhì)粒和基因組后，混合；(2)對混合基因組進(jìn)行小片段文庫測序，將測序數(shù)據(jù)進(jìn)行組裝，得到測序短序列(reads)組裝為長的片段重疊群(contigs)進(jìn)而組裝為一定長度的片段(scaffolds)；(3)利用軟件分析步驟O)中scaffolds中的開放閱讀框ORFs，與生物信息數(shù)據(jù)庫KEGG、PFAM、GO、Swiss-Prot和/或iTrEMBL比對，抽提出與功能基因相關(guān)的ORFs-I ；(4)將步驟(3)獲得的ORFs-I與現(xiàn)有Bt cry/cyt/vip基因比對，鑒定出與cry/ cyt/vip基因具有同源性的ORFs-2 ；(5)根據(jù)cry/cyt/vip基因具有同源性的0RFs_2序列設(shè)計引物，以所屬菌株的基因組為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行克隆，獲得Bt毒力基因。由于Bt毒力基因往往具有抗蟲性或溶細(xì)胞活性，本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠預(yù)見，將本發(fā)明方法中鑒定并克隆的Bt毒力基因與表達(dá)載體可操作地連接，得到能夠表達(dá)的蛋白重組載體，進(jìn)而可以通過諸如農(nóng)桿菌介導(dǎo)法、基因槍法、花粉管通道法等轉(zhuǎn)基因方法，將所述表達(dá)載體導(dǎo)入宿主，得到轉(zhuǎn)相應(yīng)抗性基因的轉(zhuǎn)化體，例如農(nóng)作物或者果樹等植物，使其具備抗蟲活性。因此本發(fā)明方法可應(yīng)用于制備植物殺蟲劑，進(jìn)一步可應(yīng)用于制備轉(zhuǎn)Bt基因的植物。本發(fā)明從基因組出發(fā)，通過生物信息學(xué)的方法實現(xiàn)了大規(guī)模、高通量、經(jīng)濟(jì)、適用的新型模式基因的鑒定和挖掘。本領(lǐng)域技術(shù)人員可根據(jù)本發(fā)明公開的方法，混合數(shù)株Bt基因組或者質(zhì)粒，可以采用不同覆蓋度的測序方法，對Bt中所含的基因包括毒性或者毒性相關(guān)以及一些功能基因進(jìn)行挖掘，同時可以用于對一個地區(qū)Bt基因的類型分布的評價。本領(lǐng)域技術(shù)人員還可以根據(jù)本發(fā)明公開的方法從ORF比對結(jié)果提取出其他研究方向的相關(guān)基因。例如可以從KEGG通路的比對結(jié)果中選擇與Bt菌毒力代謝相關(guān)的調(diào)控基因(圖2)。這對于擴(kuò)寬Bt模式基因的基因譜以及殺蟲譜是至關(guān)重要的。傳統(tǒng)的Bt毒力基因是不能得到這些額外的相關(guān)數(shù)據(jù)的，因此本發(fā)明具有重要的經(jīng)濟(jì)價值和應(yīng)用前景。


圖1是本發(fā)明方法的技術(shù)路線；圖2顯示的是KEGG種各類基因的分類，其中調(diào)控毒素基因的調(diào)控因子如箭頭所示；圖3是菌株掃描電鏡觀察圖；其中圖3a表示的是菌株ΒΤΜα8的晶體，晶體如箭頭所示呈圓形；圖北表示的是菌株Ε65-3的晶體，晶體如箭頭所示呈現(xiàn)菱形和正方形；圖3c 表示的是菌株YWC2-8的晶體，晶體如箭頭所示圓形；圖3d表示的是菌株&ιι59-2的晶體，晶體形狀如箭頭所示呈現(xiàn)出圓形；圖3e表示的是菌株hsl8-l的晶體類型，晶體如箭頭所示呈現(xiàn)出圓形。圖4插入片段分配頻率；圖5顯示的是所有引物在各個菌株所擴(kuò)增出的片段的凝膠電泳圖的總和。其中 M, marker ；1，cry52Bal (Bm59-2) ；2，cry390RF2 (hsl8-l) ；3，Binary (E65-3) ；4， cyt2Aa(BtMC28) ；5，cytIDa(BtMC28) ；6，cry2Aa(YWC2-8) ；7，cry53Aa(BtMC28) ；8， cry54Aa(BtMC28) ；9，cry30Fa(BtMC28) ；10，crylAc(YWC2-8) ；11，cry40Ba(BtMC28) ；12， cry8Ca(YWC2-8)。
具體實施例方式
5
以下實施例進(jìn)一步說明本發(fā)明的內(nèi)容，但不應(yīng)理解為對本發(fā)明的限制。在不背離本發(fā)明精神和實質(zhì)的情況下，對本發(fā)明方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬于本發(fā)明的范圍。 若未特別指明，實施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段。實施例11、采用本實驗室于四川省沐川原始森林地區(qū)土壤中分離得到的5株蘇云金芽孢桿菌BtMC28(保藏編號為CGMCC No. 2719，已在中國專利CN101503666B中公開； Bm59-2保藏編號為CGMCCNo. 2871，已在專利號為ZL 200910081598的發(fā)明專利申請中公開；E65-3保藏編號為CGMCC No. 5337 ；hsl8_l保藏編號為CGMCCNo. 2718，已在專利號為 ZL200910081594. 2的發(fā)明專利申請中公開；YWC2-8保藏編號為CGMCC No. 2860,已在專利號為ZL200910081599的發(fā)明專利申請中公開。掃描電鏡(5000X)觀察上述5株菌株，其晶體類型豐富，見圖3。IH ig # M JC .ArArturo Reyes-Ramirez, Jorge Ε. Ibarra. 2008. Plasmid patterns of Bacillus thuringiensis type strains. Appl. Environ. Microbiol. 74 125-129.中的方法分別提取這5株菌株的基因組。然后將基因組混合。2、混合基因組送至華大基因公司采用Illumina HiSeq paire-End小片段文庫測序。整體測序深度在50倍以上。3、采用Velvet 1. 1. 05對測序結(jié)果進(jìn)行整理以及組裝，參數(shù)為kmer63，將測序所得的Reads拼接為一些contigs進(jìn)而將這些contigs組裝為一定長度的scaffolds。共得到了 12. 25Mb的組裝數(shù)據(jù)量和12696個平均長度為756bp的開放閱讀框，其GC含量為 35. 64%。測序數(shù)據(jù)以及組裝結(jié)果如表1所示，插入片段分配頻率見圖4。表1數(shù)據(jù)組裝結(jié)果
權(quán)利要求
1.一種高通量鑒定細(xì)菌功能基因的方法，包括以下步驟1)選取在光學(xué)顯微鏡或者掃描電鏡下具有伴胞晶體的菌株作為目標(biāo)菌株，提取質(zhì)粒和基因組后，混合；2)對混合后的質(zhì)粒和基因組進(jìn)行小片段文庫測序，將測序數(shù)據(jù)進(jìn)行組裝，得到測序短序列組裝為長的片段重疊群，進(jìn)而組裝為一定長度的片段；3)利用軟件分析步驟幻中片段中的開放閱讀框ORFs，與生物信息數(shù)據(jù)庫比對進(jìn)行基因注釋，選取與功能基因具有同源性的0RF-1 ；4)將步驟3)獲得的ORFs-I與現(xiàn)有菌種的功能基因比對，鑒定出與功能基因具有同源性的ORFs-2，即鑒定出總基因組中所含的基因類型。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，還包括根據(jù)步驟4)中同源性的ORFs-2設(shè)計引物，PCR擴(kuò)增，克隆獲得細(xì)菌的功能基因。
3.如權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述的細(xì)菌為蘇云金芽孢桿菌。
4.如權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述功能基因為cry、cyt、vip毒力基因、毒力因子調(diào)控基因和/或轉(zhuǎn)錄基因。
5.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，步驟3)中所述的與生物信息數(shù)據(jù)庫為 KEGG, PFAM、GO、NR、Swiss-Prot 和 / 或 TrEMBL。
6.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，其中NR、KEGG,Swiss-Prot和TrEMBL采用的是Blast，其參數(shù)為e-value le_5 ；PFAM的注釋采用的是hterPrc^can，GO的注釋基于 NR注釋結(jié)果的Blast2G0比對。
7.如權(quán)利要求1或2所述的方法在細(xì)菌毒力資源鑒定中的應(yīng)用。
8.如權(quán)利要求3所述的方法鑒定的蘇云金芽孢桿菌毒力基因在制備殺蟲劑中的應(yīng)用。
9.如權(quán)利要求3所述的方法鑒定的蘇云金芽孢桿菌毒力基因在制備轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種基于生物信息學(xué)的方法挖掘蘇云金芽孢桿菌毒性基因的方法。本發(fā)明通過對Bt混合基因組進(jìn)行測序、數(shù)據(jù)組裝，獲得ORFs，與現(xiàn)有功能基因進(jìn)行比對，鑒定具有同源性的ORFs，再通過基因克隆的方法獲得該功能基因，實現(xiàn)了大規(guī)模、高通量、經(jīng)濟(jì)的新型模式基因的鑒定和挖掘。本方法可以對Bt菌株中所含的基因包括毒性或者毒性相關(guān)以及一些功能基因進(jìn)行挖掘，還可用于對一個地區(qū)基因的類型分布的評價。本方法確定的Bt毒力基因可應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物中，使其具備相應(yīng)抗性，具有重要的應(yīng)用和經(jīng)濟(jì)價值。
文檔編號C12R1/07GK102409104SQ20111040370
公開日2012年4月11日 申請日期2011年12月7日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月7日
發(fā)明者朱軍, 李雙成, 李巧, 李平, 王世全, 鄧其明, 鄭愛萍 申請人:四川農(nóng)業(yè)大學(xué)