具有鱗翅目活性的新蘇云金芽孢桿菌基因的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及具有鱗翅目活性的新蘇云金芽孢桿菌基因。本發(fā)明提供了編碼多肽的得自蘇云金芽孢桿菌菌株的核酸及其變體和片段，所述多肽具有針對昆蟲害蟲包括鱗翅目的殺蟲活性。本發(fā)明的特定實施方案提供了編碼殺蟲蛋白質的分離的核酸、殺蟲組合物、DNA構建體以及包括實施方案的核酸的轉化的微生物和植物。這些組合物在用于控制害蟲特別是植物害蟲的方法中有用。
【專利說明】具有鱗翅目活性的新蘇云金芽孢桿菌基因 [0001] 本申請為申請?zhí)?01080012854. 1的分案申請，要求2009年1月23日的優(yōu)先權。 發(fā)明領域
[0002] 本發(fā)明涉及得自新蘇云金芽孢桿菌基因的天然存在 和重組的核酸，其編碼特征在于針對昆蟲害蟲的殺蟲活性的殺蟲多肽。本發(fā)明的組合物和 方法利用所公開的核酸，及其編碼的殺蟲多肽，以控制植物害蟲。
[0003] 發(fā)明背景 昆蟲害蟲是世界農作物損失中的主要因素。例如，黏蟲攝食、小地老虎損害或玉米螟損 害對于農業(yè)生產者可以是經濟上破壞性的。來自對單獨的田間和甜玉米的玉米螟攻擊的昆 蟲害蟲相關作物損失在損害和控制費用方面已達到每年約10億美元。
[0004] 傳統(tǒng)上，用于影響昆蟲害蟲群體的主要方法是廣譜化學殺昆蟲劑的應用。然而，消 費者和政府管理者同樣變得越來越關注與合成化學殺蟲劑的生產和使用相關的環(huán)境危害。 因為此種關注，管理者已禁止或限制一些較危險殺蟲劑的使用。因此，存在開發(fā)可替代殺蟲 劑的重大興趣。
[0005] 使用微生物試劑例如真菌、細菌或另一個昆蟲物種生物學控制具有農業(yè)重要性的 昆蟲害蟲提供了對合成化學殺蟲劑的環(huán)境友好和商業(yè)上有吸引力的替代物。一般來說，生 物殺蟲劑的使用呈現了污染和環(huán)境危害的較低危險，并且生物殺蟲劑提供了比傳統(tǒng)廣譜化 學殺昆蟲劑特有的更大的靶特異性。此外，生物殺蟲劑經常生產成本更少，并且因此改善關 于廣泛多樣作物的經濟產量。
[0006] 已知芽孢桿菌屬UaciBm)的微生物的特定物種具有針對廣泛范圍的昆蟲 害蟲的殺蟲活性，所述昆蟲害蟲包括鱗翅目)、雙翅目)、鞘翅 目半翅目等。蘇云金芽孢桿菌和日本甲蟲芽孢桿菌 papiBiae)在迄今為止發(fā)現的最成功的生物控制試劑中。昆蟲致病性也已歸 因于幼蟲類芽孢桿菌C5. 緩病芽孢桿菌C5. 球形芽孢桿菌(漢 (Harwook，編輯（（1989(Plenum Press)，306)、和錯狀芽抱桿菌(漢 Cerew1SO(WC) 96/10083)的菌株。殺蟲活性看起來集中于伴孢結晶蛋白質內含物，盡管殺蟲 蛋白質已也從芽孢桿菌屬的營養(yǎng)生長階段中分離。編碼這些殺蟲蛋白質的幾種基因已得到 分離和表征(參見例如美國專利號5, 366, 892和5, 840, 868)。
[0007] 微生物殺昆蟲劑特別是得自芽孢桿菌屬菌株的那些，作為化學害蟲控制的替代物 已在農業(yè)中起重要作用。近來，通過基因工程改造作物植物以產生來自芽孢桿菌屬的殺蟲 蛋白質，農業(yè)科學家已開發(fā)了具有增強的昆蟲抗性的作物植物。例如，玉米和棉花植物已 進行基因工程改造，以產生從沒?的菌株中分離的殺蟲蛋白質（參見例如，Aronson (2002) Cell Mol. Life Sci. m Od ·Α\?-Α25 辦chnevf 等}明、Microbiol Mol Biol Rev. 62 (3):775-806)。這些基因工程改造的作物目前廣泛用于美國農業(yè)中，并且已給農民提供 了對傳統(tǒng)昆蟲控制方法的環(huán)境友好的替代物。此外，基因工程改造為包含殺蟲Cry毒素的 馬鈴薯已銷售給美國農民。雖然它們已被證明是在經濟上非常成功的，但這些基因工程改 造的、昆蟲抗性的作物植物僅提供針對狹窄范圍的經濟上重要的昆蟲害蟲的抗性。
[0008] 因此，仍需要具有針對昆蟲害蟲的更廣泛范圍的殺昆蟲活性的新毒素，例如針 對來自鱗翅目的更多種昆蟲有活性的毒素。此外，仍需要具有針對多種昆蟲害蟲的活性的 生物殺蟲劑和具有改善的殺昆蟲活性的生物殺蟲劑。
[0009] 發(fā)明概述 提供了用于影響昆蟲害蟲的組合物和方法。更具體而言，本發(fā)明的實施方案涉及利 用編碼殺昆蟲肽的核苷酸序列影響昆蟲的方法，以產生表達實施方案的殺昆蟲多肽的轉 化的微生物和植物。此種害蟲包括農業(yè)上重要的昆蟲，例如：玉米螟(玉米螟 和西南玉米桿草螟（西南玉米桿草螟CZT/airaea 在一些實 施方案中，核苷酸序列編碼對于屬于鱗翅目的至少一種昆蟲是殺蟲的多肽。
[0010] 實施方案提供了核酸及其片段和變體，其編碼具有針對昆蟲害蟲的殺蟲活性的多 肽(例如分別編碼SEQIDN0:2、4、6、8、10、12或14的SEQIDN0:1、3、5、7、9、11或13)。得 自的實施方案的野生型(例如天然存在的）核苷酸序列編碼新殺昆蟲肽。實施方案進一 步提供了所公開的核苷酸序列的片段和變體，其編碼生物學活性(例如殺昆蟲）多肽。
[0011] 實施方案進一步提供了由實施方案的天然存在或修飾的(例如誘變處理或操作 的）核酸編碼的分離的殺蟲(例如殺昆蟲）多肽。在特定例子中，實施方案的殺蟲蛋白質包 括全長蛋白質和多肽的片段，其由設計為將特定氨基酸序列引入實施方案的多肽內的誘變 處理的核酸產生。在特定實施方案中，相對于它們衍生自其的天然存在的多肽的活性，多肽 具有增強的殺蟲活性。
[0012] 實施方案的核酸還可以用于產生轉基因(例如轉化的）單子葉或雙子葉植物，其特 征在于包括至少一種穩(wěn)定摻入的核苷酸構建體的基因組，所述核苷酸構建體包括與啟動子 可操作地連接的實施方案的編碼序列，所述啟動子驅動所編碼的殺蟲多肽的表達。因此，還 提供了轉化的植物細胞、植物組織、植物及其種子。
[0013] 在具體實施方案中，可以使用已對于在宿主植物中增加的表達最佳化的核酸產生 轉化的植物。例如，實施方案的殺蟲多肽之一可以進行反翻譯（back-translate)，以產生包 括對于在特定宿主中的表達最佳化的密碼子的核酸，例如作物植物例如玉米(玉蜀黍（Zea 植物。由此種轉化的植物(例如雙子葉植物或單子葉植物）的編碼序列的表達將導 致殺蟲多肽的產生，且對植物賦予增加的昆蟲抗性。一些實施方案提供了表達殺蟲多肽的 轉基因植物，這在用于影響各種昆蟲害蟲的方法中有用。
[0014] 實施方案進一步包括包含實施方案的殺昆蟲多肽的殺蟲或殺昆蟲組合物，并且可 以任選包括進一步的殺昆蟲肽。實施方案包含此種組合物對昆蟲害蟲環(huán)境的應用，以影響 昆蟲害蟲。
[0015] 發(fā)明詳述 本發(fā)明的實施方案涉及用于影響昆蟲害蟲特別是植物害蟲的組合物和方法。更具體 而言，實施方案的分離的核酸及其片段和變體包括編碼殺蟲多肽(例如蛋白質）的核苷酸序 列。所公開的殺蟲蛋白質針對昆蟲害蟲例如但不限于鱗翅目的昆蟲害蟲是生物學活性的 (例如殺蟲的）。目的昆蟲害蟲包括但不限于：玉米螟(玉米螟)和西 南玉米桿草螟(Afairaea (西南玉米桿草螟)。
[0016] 實施方案的組合物包括分離的核酸及其片段和變體，其編碼殺蟲多肽，包括實施 方案的核苷酸序列的表達盒，分離的殺蟲蛋白質和殺蟲組合物。一些實施方案提供了特征 在于相對于相應野生型蛋白質的殺蟲活性，針對鱗翅目改善的殺昆蟲活性的修飾的殺蟲多 肽。實施方案進一步提供了用這些新核酸轉化的植物和微生物，和涉及此種核酸、殺蟲組合 物、轉化的生物及其產物在影響昆蟲害蟲中的使用的方法。
[0017] 實施方案的核酸和核苷酸序列可以用于轉化任何生物，以產生所編碼的殺蟲蛋白 質。提供了涉及使用此種轉化的生物來影響或控制植物害蟲的方法。實施方案的核酸和 核苷酸序列還可以用于轉化細胞器例如葉綠體（McBride等人（1995)/^0(6^/70/(?^ 13 : 362-365;和 Kota 等人（1999)/￥oc. Jcaol 5bi."說 96:1840-1845)。
[0018] 實施方案進一步涉及天然存在的編碼序列的片段和變體的鑒定，其編碼生物學活 性的殺蟲蛋白質。實施方案的核苷酸序列在用于影響害蟲的方法中直接有用，所述害蟲特 別是昆蟲害蟲，例如鱗翅目的害蟲。因此，實施方案提供了用于影響昆蟲害蟲的新方法，其 不依賴于傳統(tǒng)的、合成化學殺昆蟲劑的使用。實施方案涉及天然存在的、生物可降解的殺蟲 劑和編碼其的基因的發(fā)現。
[0019] 實施方案進一步提供了天然存在的編碼序列的片段和變體，其也編碼生物學活性 (例如殺蟲)多肽。實施方案的核酸包含已對于通過特定生物的細胞表達最佳化的核酸或核 苷酸序列，例如基于具有增強的殺蟲活性的多肽的氨基酸序列，已使用植物優(yōu)選的密碼子 反翻譯（即反向翻譯)的核酸序列。實施方案進一步提供了對實施方案的多肽賦予改善或改 變的性質的突變。參見例如，于2003年6月25日提交的共同未決的美國申請?zhí)?0/606, 320 和于2003年12月24日提交的10/746, 914。
[0020] 在下文說明書中，廣泛使用了許多術語。提供了下述定義以促進實施方案的理解。
[0021] 單位、前綴和符號可以以其SI公認形式表示。除非另有說明，否則分別地，核酸以 5'到3'方向從左往右書寫；氨基酸序列以氨基到羧基方向從左往右書寫。數字范圍包括 限定范圍的數字。氨基酸在本文中可以通過其通常已知的三字母符號或通過IUPAC-IUB生 物化學命名委員會（Biochemical Nomenclature Commission)推薦的單字母符號提及。同 樣地，核苷酸可以通過其通常公認的單字母編碼提及。上述術語通過參考就整體而言的說 明書更全面地定義。
[0022] 如本文使用的，"核酸"包括提及單或雙鏈形式的脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸 聚合物，并且除非另有說明，否則包含具有天然核苷酸的基本性質的已知類似物(例如肽核 酸)，因為它們以與天然存在的核苷酸的那種相似的方式與單鏈核酸雜交。
[0023] 如本文使用的，術語"編碼"或"編碼的"當在特定核酸背景中使用時，意指核酸包 括指導核苷酸序列翻譯成特定蛋白質的必需信息。蛋白質由其編碼的信息由密碼子的使用 指定。編碼蛋白質的核酸可以包括在核酸的翻譯區(qū)內的非翻譯序列(例如內含子)，或可以 缺乏此種間插非翻譯序列(例如如在cDNA中）。
[0024] 如本文使用的，關于指定多核苷酸或其編碼的蛋白質的"全長序列"意指具有自然 (非合成)、內源序列的完整核酸序列或完整氨基酸序列。全長多核苷酸編碼全長、催化活性 形式的指定蛋白質。
[0025] 如本文使用的，在核苷酸序列方向背景中使用的術語"反義"指以反義鏈被轉錄的 方向與啟動子可操作地連接的雙鏈體多核苷酸序列。反義鏈與內源轉錄產物足夠互補，從 而使得內源轉錄產物的翻譯經常被抑制。因此，當術語"反義"在特定核苷酸序列背景中使 用時，該術語指參考轉錄產物的互補鏈。
[0026] 術語"多肽"、"肽"和"蛋白質"在本文中可互換使用，以指氨基酸殘基的聚合物。 該術語應用于其中一個或多個氨基酸殘基是相應天然存在的氨基酸的人工化學類似物的 氨基酸聚合物，以及天然存在的氨基酸聚合物。
[0027] 術語"殘基"或"氨基酸殘基"或"氨基酸"在本文中可互換使用，以指摻入蛋白質、 多肽或肽(總起來說"蛋白質"）內的氨基酸。氨基酸可以是天然存在的氨基酸，并且除非另 有限定，否則可以包含天然氨基酸的已知類似物，其可以以與天然存在的氨基酸相似的方 式起作用。
[0028] 實施方案的多肽可以由本文公開的核酸或使用標準分子生物學技術產生。例如， 實施方案的蛋白質可以通過實施方案的重組核酸在合適宿主細胞中的表達或可替代地通 過先體外后體內程序的組合產生。
[0029] 如本文使用的，術語"分離的"和"純化的"可互換使用，以指實質上或基本上不含 這樣的組分的核酸或多肽或其生物學活性部分，所述組分正常伴隨核酸或多肽或與核酸或 多肽相互作用，如在其天然存在的環(huán)境中發(fā)現的。因此，分離或純化的核酸或多肽當通過重 組技術產生時，基本上不含其他細胞材料或培養(yǎng)基，或當化學合成時，基本上不含化學前體 或其他化學試劑。
[0030] "分離的"核酸一般不含在核酸由其衍生的生物的基因組DNA中天然側接核酸的序 列(例如蛋白質編碼序列)(即位于核酸5'和3'末端的序列)。例如，在各種實施方案中，分 離的核酸可以包含小于約5 kb、4 kb、3 kb、2 kb、l kb、0. 5 kb或0. I kb核苷酸序列，其在 核酸由其衍生的細胞的基因組DNA中天然側接核酸。
[0031] 如本文使用的，當其用于指實施方案的多肽時，術語"分離的"或"純化的"指分離 的蛋白質基本上不含細胞材料，并且包括具有小于約30%、20%、10%或5% (按干重計)污 染蛋白質的蛋白質制劑。當實施方案的蛋白質或其生物學活性部分重組產生時，培養(yǎng)基相 當于小于約30^^20^^10%或5% (按干重計）化學前體或非目的蛋白質化學試劑。
[0032] 說明書自始至終，單詞"包括"或其變形應理解為暗示包括所述元件、整數或步驟， 或元件、整數或步驟組，但不排除任何其他元件、整數或步驟，或元件、整數或步驟組。
[0033] 如本文使用的，術語"影響昆蟲害蟲"指在任何發(fā)育階段時實現昆蟲攝食、生長和 /或行為中的改變，包括但不限于：殺死昆蟲；延緩生長；阻止生殖能力；拒食劑活性；等。 [0034] 如本文使用的，術語"殺蟲活性"和"殺昆蟲活性"同義使用，以指生物或物質(例 如蛋白質）的活性，這可以通過但不限于下述進行測量：在攝食和暴露合適時間長度后的害 蟲死亡率、害蟲重量減輕、害蟲驅性以及害蟲的其他行為和身體改變。因此，具有殺蟲活性 的生物或物質不利地影響害蟲適合度的至少一個可測量參數。例如，"殺蟲蛋白質"是自身 或與其他蛋白質組合展示出殺蟲活性的蛋白質。
[0035] 如本文使用的，術語"殺蟲有效量"意味著當存在于害蟲的環(huán)境中時，具有殺蟲活 性的物質或生物的量。對于每種物質或生物，殺蟲有效量對于特定環(huán)境中受影響的每種害 蟲以經驗為根據進行測定。類似地，"殺昆蟲有效量"可以用于指當害蟲是昆蟲害蟲時的"殺 蟲有效量"。
[0036] 如本文使用的，術語"重組工程改造的"或"工程改造的"意味著利用重組DNA技 術，以引入(例如工程改造）蛋白質結構中的變化，這基于蛋白質作用機制的理解和待引入、 缺失或取代的氨基酸的考慮。
[0037] 如本文使用的，術語"突變型核苷酸序列"或"突變"或"誘變處理的核苷酸序列" 意味著已誘變處理或改變以包含一個或多個核苷酸殘基(例如堿基對）的核苷酸序列，所述 核苷酸殘基不存在于相應野生型序列中。此種誘變或改變由核酸殘基的一個或多個添加、 缺失、或取代或置換組成。當突變通過添加、去除或置換蛋白酶解位點的氨基酸進行時，此 種添加、去除或置換可以在蛋白酶解位點基序內或附近，只要達到突變目的（即只要改變在 位點上的蛋白酶解)。
[0038] 突變型核苷酸序列可以編碼顯示改善或減少的殺昆蟲活性的突變型殺昆蟲毒素， 或對包含其的多肽賦予改善或減少的殺昆蟲活性的氨基酸序列。如本文使用的，在蛋白質、 多肽或氨基酸序列背景中，術語"突變型"或"突變"指已誘變處理或改變以包含一個或多 個氨基酸殘基的序列，所述氨基酸殘基不存在于相應野生型序列中。此種誘變或改變由氨 基酸殘基的一個或多個添加、缺失、或取代或置換組成。突變型多肽顯示改善或減少的殺昆 蟲活性，或代表對包含其的多肽賦予改善的殺昆蟲活性的氨基酸序列。因此，術語"突變型" 或"突變"指突變型核苷酸序列和編碼的氨基酸之一或兩者。突變型可以單獨或與實施方 案的其他突變型或其他突變型以任何相容組合使用。"突變型多肽"可以相反地顯示殺昆蟲 活性中的減少。當超過一個突變加入特定核酸或蛋白質時，突變可以同時或順次加入；如果 順次，那么突變可以以任何合適次序加入。
[0039] 如本文使用的，術語"改善的殺昆蟲活性"或"改善的殺蟲活性"指實施方案的殺昆 蟲多肽，相對于其相應野生型蛋白質的活性，其具有增強的殺昆蟲活性，和/或針對更廣泛 范圍的昆蟲有效的殺昆蟲多肽，和/或對于昆蟲具有特異性的殺昆蟲多肽，所述昆蟲對野 生型蛋白質的毒性不易感。改善或增強的殺蟲活性的發(fā)現要求相對于針對相同昆蟲測定的 野生型殺昆蟲多肽的殺蟲活性，顯示針對昆蟲靶至少10%的殺蟲活性增加，或至少20%、 25%、30%、35%、40%、45%、50%、60%、70%、100%、150%、200%或 300%或更大的殺蟲 活性增加。
[0040] 例如，提供了改善的殺蟲或殺昆蟲活性，其中相對于受野生型毒素影響的昆蟲 范圍，更廣泛或更狹窄范圍的昆蟲受多肽影響。當需要通用性時，更廣泛范圍的影響可能 是希望的，而當例如有益昆蟲可能以其他方式受毒素的使用或存在影響時，更狹窄范圍的 影響可能是希望的。雖然實施方案不受任何特定作用機制的束縛，但改善的殺蟲活性也可 以通過多肽的一種或多種特征中的改變提供；例如相對于相應野生型蛋白質的穩(wěn)定性或壽 命，多肽在昆蟲腸中的穩(wěn)定性或壽命可以得到增加。
[0041] 如本文使用的，術語"毒素"指顯示殺蟲活性或殺昆蟲活性或改善的殺蟲活性或改 善的殺昆蟲活性的多肽。"Α?"或"蘇云金芽孢桿菌"毒素意欲包括在各種菌株中發(fā)現的 更廣泛類別的Cry毒素，這包括此種毒素如例如或
[0042] 術語"蛋白酶解位點"或"切割位點"指這樣的氨基酸序列，其賦予對于一類蛋白 酶或特定蛋白酶的敏感性，從而使得包含氨基酸序列的多肽由該類蛋白酶或特定蛋白酶消 化。蛋白酶解位點被說成對于識別該位點的一種或多種蛋白酶是"敏感的"。本領域認識到 消化效率將變化，并且消化效率中的減少可以導致多肽在昆蟲腸中的穩(wěn)定性或壽命中的增 力口。因此，蛋白酶解位點可以賦予對于超過一種蛋白酶或一類蛋白酶的敏感性，但在那個位 點由各種蛋白酶的消化效率可以不同。蛋白酶解位點包括例如胰蛋白酶位點、胰凝乳蛋白 酶位點和彈性蛋白酶位點。
[0043] 研究已顯示鱗翅目的昆蟲腸蛋白酶包括胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶和彈性蛋白酶。 參災鄭\如，Lenz 等）Arch. Insect Biochem. Physiol. 16:201-212;和 Hedegus 等人（2003)Arch. /aseci 人 53 :30_47。例如，約 18 種不同膜蛋白酶已 在棉鈴蟲C/fe/ic〇K6?/77a arffiigera)幼蟲中腸中發(fā)現(參見Gatehouse等人（1997)/aseci Biochem. Mol. BioL 27 :929_944)。這些蛋白酶的優(yōu)選蛋白酶解底物位點已得到研究。 參見例如，Peterson 等人（1995)/as(9ci #〇乂 人 25:765-774。
[0044] 已做出努力以理解Si毒素的作用機制并且工程改造具有改善性質的毒素。已顯 示昆蟲腸蛋白酶可以影響價Cry蛋白質對昆蟲的影響。一些蛋白酶通過將Cry蛋白質從 "毒素原"形式加工成毒性形式或"毒素"而將其激活。參見Oppert (1999)JrcA Biochem. Phys. 42 :1-12 ;和 Carroll 等人（1997)7； JflFerieAraie 70 : 41-49。毒素的這種激活可以包括從蛋白質中去除N和C末端肽，并且還可以包括蛋白質的 內部切割。其他蛋白酶可以降解Cry蛋白質。參見Oppert,同上。
[0045] 具有不同特異性的Cry毒素的氨基酸序列比較揭示5個高度保守的序列區(qū)段 (block)。在結構上，毒素包括3個獨特結構域，其從N到C末端是：牽涉于孔形成的7 α 螺旋簇(被稱為"結構域1")、牽涉于細胞結合的3個反平行β折疊(被稱為"結構域2")、 和β夾心(被稱為"結構域3")。這些結構域的位置和性質是本領域技術人員已知的。參 見例如，Li 等人（1991 305:815-821 和 Morse 等人（2001) Stracitfre，9:409-417。 當提及特定結構域例如結構域1時，應當理解就特定序列而言的結構域的確切終點并不關 鍵，只要序列或其部分包括提供歸因于特定結構域的至少一些功能的序列。因此，例如當提 及"結構域1"時，意指特定序列包括7 α螺旋簇，但就該簇而言使用或提及的序列的確切終 點并不關鍵。本領域技術人員熟悉此種終點的測定和此種功能的評價。
[0046] 在更佳表征且改善Si毒素的努力中，研究了細菌Si的菌株。發(fā)現由菌株培養(yǎng) 物制備的晶體制劑具有針對玉米螟的殺蟲活性(參見例如實驗實施例1)。采取努力以鑒定 編碼來自所選菌株的晶體蛋白質的核苷酸序列，并且從這些細菌菌株中分離實施方案的野 生型（即天然存在的）核酸，克隆到表達載體內，并且轉化到大腸桿菌(萬cWi)內。依賴于 給定制劑的特征，認識到殺蟲活性的證實有時需要胰蛋白酶預處理，以激活殺蟲蛋白質。因 此，應當理解一些殺蟲蛋白質需要蛋白酶消化(例如通過胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶等）用于 激活，而其他蛋白質在不存在激活的情況下是生物學活性的(例如殺蟲的)。
[0047] 此種分子可以通過例如于2003年6月25日提交的美國申請?zhí)?0/606, 320和于 2003年12月24日提交的10/746, 914中所述的方法加以改變。此外，核酸序列可以工程改 造為編碼包含另外突變的多肽，相對于天然存在的多肽的殺蟲活性，所述另外突變賦予改 善或改變的殺蟲活性。此種工程改造的核酸的核苷酸序列包括在野生型序列中未發(fā)現的突 變。
[0048] 實施方案的突變型多肽一般通過包括下述步驟的方法進行制備：獲得編碼家 族多肽的核酸序列；基于靶結構域在毒素作用方式中的提議功能的考慮，分析多肽的結構 以鑒定基礎基因序列用于誘變的特定"靶"位點；將一個或多個突變引入核酸序列中，以產 生所編碼多肽序列的一個或多個氨基酸殘基中的所需改變；并且就殺蟲活性測定產生的多 肽。
[0049] 許多Bt殺昆蟲毒素通過其氨基酸序列和三級結構中的相似性相關至各種程度， 并且用于獲得毒素的晶體結構的方法是眾所周知的。和多肽的示例性高分 辨率晶體結構解決在參考文獻中可獲得?；虻慕鉀Q的結構（Li等人（1991>Vai?r e 353:815-821) 了解了毒素的結構和功能之間的關系。Si毒素所公開的結構分析和與特定 結構、基序等相關的報道的功能的組合考慮指出毒素的特定區(qū)域與蛋白質作用方式的特定 功能和分立的步驟相關。例如，從中分離的許多毒素一般描述為包括3個結構域：與孔 形成有關的7螺旋束、已牽涉于受體結合的3折疊結構域、和β夾心基序（Li等人（1991) Nature 305 :815-821)〇
[0050] 如美國專利號7, 105, 332和于2003年12月24日提交的未決的美國申請?zhí)?10/746, 914中報道的，Cry蛋白質的毒性可以通過靶向位于毒素結構域1的α螺旋3和 4之間的區(qū)域得到改善。這個理論的前提為關于殺昆蟲毒素的大量知識，包括：1)已報道 毒素結構域1的α螺旋4和5插入襯在易感昆蟲中腸里的細胞的脂雙層內（Gazit 等人（1998)/￥oc. 乂 JcaiZ 95 :12289-12294);2)本發(fā)明人對胰蛋白酶和胰 凝乳蛋白酶切割位點在野生型蛋白質的氨基酸序列內的位置的了解；3)在通過胰蛋白酶和 胰凝乳蛋白酶處理的體外激活后，野生型蛋白質針對特定昆蟲更有活性的觀察；和4)毒素 從3'末端消化導致對于昆蟲的毒性減少的報道。
[0051] 可以產生一系列突變且將其置于多種背景序列中，以產生具有增強或改變的殺蟲 活性的新多肽。參見例如，于2003年6月25日提交、現在放棄的美國申請?zhí)?0/606, 320 ; 和于2003年12月24日提交的10/746, 914。這些突變包括但不限于：在位于結構域1的螺 旋3和4之間的區(qū)域中至少一個更加蛋白酶敏感的位點(例如胰蛋白酶切割位點）的添加； 野生型序列中的原始蛋白酶敏感位點由不同蛋白酶敏感位點的置換；在特定位置中多個蛋 白酶敏感位點的添加；接近一個或多個蛋白酶敏感位點的氨基酸殘基的添加，以改變多肽 的折疊且因此增強多肽在一個或多個蛋白酶敏感位點的消化；和添加突變以保護多肽不受 減少毒性的降解性消化(例如制備一系列突變，其中野生型氨基酸由纈氨酸置換，以保護多 肽不受消化)。突變可以單獨或以任何組合使用，以提供實施方案的多肽。
[0052] 以這種方式，實施方案提供了包括多種突變的序列，例如包括定位于所編碼多肽 結構域1的α螺旋3和4之間的另外或可替代蛋白酶敏感位點的突變。其為另外或可替 代蛋白酶敏感位點的突變可以對幾類蛋白酶或酶例如彈性蛋白酶敏感，所述幾類蛋白酶例 如絲氨酸蛋白酶，其包括胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶。因此，其為另外或可替代蛋白酶敏感位 點的突變可以這樣設計，從而使得位點容易由一類蛋白酶識別和/或切割，所述蛋白酶例 如哺乳動物蛋白酶或昆蟲蛋白酶。蛋白酶敏感位點還可以設計為由已知在生物中產生的特 定類別的酶或特定酶切割，例如由谷實夜蛾故zea產生的胰凝乳蛋白酶（Lenz等 人（1991)ArcA /aseci 人 16:201-212)。突變還可以賦予對于蛋白酶 解消化的抗性，例如對于在肽的C末端通過胰凝乳蛋白酶的消化。
[0053] 在所編碼多肽的氨基酸序列中的另外和/或可替代蛋白酶敏感位點的存在可以 改善由實施方案的核酸編碼的多肽的殺蟲活性和/或特異性。因此，實施方案的核苷酸序 列可以進行重組工程改造或操作，以產生與未修飾的野生型毒素的那種相比較，具有改善 或改變的殺昆蟲活性和/或特異性的多肽。此外，本文公開的突變可以置于其他核苷酸 序列中或與其他核苷酸序列結合使用，以提供改善的性質。例如，通過昆蟲胰凝乳蛋白酶 例如在宿帶夜蛾或谷實夜蛾中發(fā)現的胰凝乳蛋白酶（Hegedus等人（2003)ArcA Jfl1Seci Biocheim Physiol ·沿.AWLexvL 等）\XV^Y)ArcL· Insect Biocheim Physiol. V6 ·. 201-212)容易切割的蛋白酶敏感位點，可以置于βτ背景序列中，以提供對于那個序列改 善的毒性。以這種方式，實施方案提供了具有改善的性質的毒性多肽。
[0054] 例如，誘變處理的βτ核苷酸序列可以包括另外突變體，其包括將第二個胰蛋白 酶敏感的氨基酸序列（除天然存在的胰蛋白酶位點外)引入所編碼多肽內的另外密碼子。實 施方案的可替代添加突變體包括設計為將至少一個另外不同的蛋白酶敏感位點引入多肽 內的另外密碼子，例如緊接地位于天然存在的胰蛋白酶位點5'或3'的胰凝乳蛋白酶敏感 位點。可替代地，可以產生取代突變體，其中破壞編碼天然存在的蛋白酶敏感位點的核酸的 至少一個密碼子，并且將可替代密碼子引入核酸序列內，以提供不同(例如取代）蛋白酶敏 感位點。置換突變體也可以添加到序列中，其中破壞存在于所編碼多肽中的天然存在 的胰蛋白酶切割位點，并且在其位置中引入胰凝乳蛋白酶或彈性蛋白酶切割位點。
[0055] 認識到可以使用編碼其為蛋白酶解位點或推定的蛋白酶解位點的氨基酸序列（例 如序列如NGSR、RR或LKM)的任何核苷酸序列，并且用于將這些切割位點中的任何一種引入 變體多肽內的密碼子的確切特性可以依賴于用途即在特定植物物種中的表達而改變。還認 識到所公開突變中的任何一種可以引入實施方案的任何多核苷酸序列內，其包括關于氨基 酸殘基的密碼子，所述氨基酸殘基提供靶向用于修飾的自然胰蛋白酶切割位點。因此，全長 毒素或其片段的變體可以進行修飾，以包含另外或可替代切割位點，并且這些實施方案預 期由本文公開的實施方案的范圍包含。
[0056] 本領域技術人員將認識到任何有用突變可以添加到實施方案的序列中，只要所編 碼多肽保留殺蟲活性。因此，序列還可以這樣進行突變，從而使得所編碼多肽對通過胰凝乳 蛋白酶的蛋白酶解消化是抗性的。超過一個識別位點可以以任何組合添加到特定位置中， 并且多個識別位點可以添加到毒素中或從毒素中去除。因此，另外突變可以包括3、4個或 更多個識別位點。應認識到多個突變可以在任何合適多核苷酸序列中進行工程改造；因此， 全長序列或其片段可以進行修飾，以包含另外或可替代切割位點，以及對于蛋白酶解消化 是抗性的。以這種方式，實施方案提供了包含改善殺蟲活性的突變的毒素，以及使用其 他沒?毒素用于影響害蟲的改善的組合物和方法。
[0057] 突變可以保護多肽不受蛋白酶降解，例如通過去除來自不同區(qū)域的推定的蛋白酶 解位點，例如推定的絲氨酸蛋白酶位點和彈性蛋白酶識別位點。此種推定的位點中的一些 或所有可以這樣去除或改變，從而使得減少在原始位點的位置的蛋白酶解。通過比較突變 型多肽與野生型毒素、或通過比較在其氨基酸序列中不同的突變型毒素，可以評估蛋白酶 解中的變化。推定的蛋白酶解位點和蛋白酶解位點包括但不限于下述序列：RR，胰蛋白酶切 割位點；LKM，胰凝乳蛋白酶位點；和NGSR，胰蛋白酶位點。這些位點可以通過任何數目和種 類的氨基酸殘基的添加或缺失加以改變，只要多肽的殺蟲活性得到增加。因此，相對于自然 或背景序列，由包括突變的核苷酸序列編碼的多肽將包括至少一個氨基酸改變或添加，或 2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、 30、32、35、38、40、45、47、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、 200、210、220、230、240、250、260、270或280個或更多個氨基酸改變或添加。多肽的殺蟲活 性還可以通過自然或全長序列的平截加以改善，如本領域已知的。
[0058] 實施方案的組合物包括編碼殺蟲多肽的核酸、及其片段和變體。特別地，實施方案 提供了分離的核酸分子，其包括編碼例如SEQ ID NO :2中所示的氨基酸序列的核苷酸序列， 或編碼所述氨基酸序列的核苷酸序列，例如SEQ ID NO :1中所示的核苷酸序列，及其片段和 變體。
[0059] 使人感興趣的是編碼實施方案的殺蟲蛋白質的最佳化的核苷酸序列。如本文使 用的，短語"最佳化的核苷酸序列"指對于在特定生物例如植物中的表達最佳化的核酸。最 佳化的核苷酸序列可以使用本領域已知的方法對于任何目的生物進行制備。參見例如，于 2003年6月25日提交、現在放棄的美國申請?zhí)?0/606, 320,和于2003年12月24日提交 的10/746, 914,其描述了編碼所公開的殺蟲蛋白質的最佳化的核苷酸序列。在這個例子中， 核苷酸序列通過反向翻譯蛋白質的氨基酸序列且改變核苷酸序列進行制備，以便包括玉蜀 黍優(yōu)選的密碼子，同時仍編碼相同氨基酸序列。這個程序由Murray等人（1989) JciifeTfes. 17:477-498更詳細地描述。最佳化的核苷酸序列在增加殺蟲蛋白質在植物中 的表達中有用，所述植物例如禾本科（Gramineae)(禾本科（Poaceae))的單子葉植物，例如 玉蜀黍或玉米植物。
[0060] 實施方案進一步提供了由實施方案的天然存在或修飾的核酸編碼的分離的殺蟲 (例如殺昆蟲）多肽。更具體而言，實施方案提供了包括SEQ ID NO :2中所示的氨基酸序列 的多肽，和由本文描述的核酸編碼的多肽，例如SEQ ID NO :1中所示的那些，及其片段和變 體，例如編碼 SEQ ID N0s:4、6、8、10、12 和 14 中所示的肽的 SEQ ID N0s:3、5、7、9、ll 或 13 中所示的變體。
[0061] 在特定實施方案中，實施方案的殺蟲蛋白質提供了全長殺昆蟲多肽、全長殺昆蟲 多肽的片段、和通過設計為將特定氨基酸序列引入實施方案的多肽內的誘變處理的核酸產 生的變體多肽。在特定實施方案中，引入多肽內的氨基酸序列包括提供了關于酶例如蛋白 酶的切割位點的序列。
[0062] 本領域已知毒素的殺蟲活性一般通過肽在昆蟲腸中由各種蛋白酶的切割得到 激活。因為肽可能不總是以完全效率在昆蟲腸中切割，所以與全長毒素自身相比較，全長毒 素的片段可以具有增強的殺蟲活性。因此，實施方案的一些多肽包括全長殺昆蟲多肽的片 段，并且相對于它們由其衍生的天然存在的殺昆蟲多肽的活性，一些多肽片段、變體和突變 將具有增強的殺蟲活性，特別是如果在就活性篩選前天然存在的殺昆蟲多肽在體外不由蛋 白酶激活的話。因此，本申請包含序列的截短形式或片段。
[0063] 突變可以置于任何背景序列內，包括此種截短的多肽，只要多肽保留殺蟲活性。使 用本領域已知或本文其他地方描述的測定，本領域技術人員可以關于殺蟲活性容易地比較 2種或更多種蛋白質。應當理解實施方案的多肽可以通過本文公開的核酸的表達或通過使 用標準分子生物學技術產生。
[0064] 認識到殺蟲蛋白質可以是寡聚的，并且將在分子量、殘基數目、組分肽、針對特定 害蟲的活性和其他特征方面不同。然而，通過本文闡述的方法，可以分離且表征針對多種害 蟲有活性的蛋白質。實施方案的殺蟲蛋白質可以與其他毒素或其他殺昆蟲蛋白質組合 使用，以增加昆蟲靶范圍。此外，實施方案的殺蟲蛋白質與具有不同性質的其他毒素或 其他殺昆蟲原理組合使用對于昆蟲抗性的預防和/或管理具有特定效用。其他殺昆蟲試劑 包括蛋白酶抑制劑(絲氨酸和半胱氨酸類型)、α -淀粉酶和過氧化物酶。
[0065] 核苷酸和由其編碼的氨基酸序列及多肽的片段和變體也由實施方案包含。如本文 使用的，術語"片段"指實施方案的多核苷酸的核苷酸序列的部分或多肽的氨基酸序列的部 分。核苷酸序列的片段可以編碼保留自然或相應全長蛋白質的生物學活性且因此具有殺蟲 活性的蛋白質片段。因此，認識到實施方案的一些多核苷酸和氨基酸序列可以被正確地稱 為片段和突變體。
[0066] 應當理解術語"片段"當其用于指實施方案的核酸序列時，還包含作為雜交探針有 用的序列。這類核苷酸序列一般不編碼保留生物學活性的片段蛋白質。因此，核苷酸序列 的片段可以范圍為至少約20個核苷酸、約50個核苷酸、約100個核苷酸、和最高達編碼實 施方案的蛋白質的全長核苷酸序列。
[0067] 編碼實施方案的殺蟲蛋白質的生物學活性部分的實施方案的核苷酸序列片段將 編碼至少 15、25、30、50、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1，000、1，100 或 1，200 個 鄰接氨基酸，或最高達實施方案的殺蟲多肽中存在的氨基酸總數目（例如對于SEQ ID NO: 2的1218個氨基酸)。因此，應當理解實施方案還包含這樣的多肽，其為實施方案的示例性 殺蟲蛋白質的片段，且具有至少 15、25、30、50、100、200、300、400、500、600、700、800、900、 1，000、1，100或1，200個鄰接氨基酸，或最高達實施方案的殺蟲多肽中存在的氨基酸總數 目（例如對于SEQ ID NO :2的1218個氨基酸）的長度。作為雜交探針或PCR引物有用的 實施方案的核苷酸序列片段一般無需編碼殺蟲蛋白質的生物學活性部分。因此，實施方案 的核酸片段可以編碼殺蟲蛋白質的生物學活性部分，或它可以是可使用本文公開的方法用 作雜交探針或PCR引物的片段。殺蟲蛋白質的生物學活性部分可以通過下述進行制備：分 離實施方案的核苷酸序列之一的部分，表達殺蟲蛋白質的編碼部分(例如通過體外重組表 達)，且評估殺蟲蛋白質的編碼部分的活性。
[0068] 其為實施方案的核苷酸序列片段的核酸包括至少16、20、50、75、100、150、200、 250、300、350、400、450、500、600、700、800、1，000、1，200、1，400、1，600、1，800 或 2,000 個 核苷酸，或最高達本文公開的核苷酸序列中存在的核苷酸數目（例如對于SEQ ID NO :1的 3656個核苷酸)。特定實施方案預想了衍生自（例如由其產生）實施方案的第一種核酸的 片段，其中所述片段編碼特征在于殺蟲活性的截短的毒素。由實施方案的多核苷酸片段編 碼的截短多肽特征在于，相對于通過片段由其衍生的第一種核酸編碼的相應全長多肽的活 性，等價或改善的殺蟲活性。預想實施方案的此種核酸片段可以在自然或相應全長編碼序 列的3'末端上截短。核酸片段還可以在自然或相應全長編碼序列的5'和3'末端上截短。 [0069] 術語"變體"在本文中用于指基本上相似的序列。對于核苷酸序列，保守變體包括 由于遺傳密碼的簡并性，編碼實施方案的殺蟲多肽之一的氨基酸序列的那些序列。天然存 在的等位基因變體例如這些可以借助于眾所周知的分子生物學技術進行鑒定，例如如本文 概述的聚合酶鏈反應（PCR)和雜交技術。
[0070] 變體核苷酸序列還包括合成衍生的核苷酸序列，例如通過使用位點定向誘變生 成，但仍編碼實施方案的殺蟲蛋白質，例如突變型毒素的那些。一般地，實施方案的特定核 苷酸序列的變體將與那種特定核苷酸序列具有至少約70%、75%、80%、85%、86%、87%、 88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多序列同一性， 如通過本文其他地方描述的序列比對程序使用缺省參數測定的。實施方案的核苷酸序列的 變體可以與那種序列相差少至1-15個核苷酸，少至1-10例如6-10,少至5,少至4、3、2或 甚至1個核苷酸。
[0071] 實施方案的特定核苷酸序列的變體（即示例性核苷酸序列）還可以通過比較由變 體核苷酸序列編碼的多肽和由參考核苷酸序列編碼的多肽之間的百分比序列同一性進行 評價。因此，例如，公開了編碼與SEQ ID NO :2的多肽具有給定百分比序列同一性的多肽的 分離的核酸。在任何2個多肽之間的百分比序列同一性可以使用本文其他地方描述的序列 比對程序使用缺省參數進行計算。當實施方案的任何給定多核苷酸對通過由它們編碼的2 個多肽共享的百分比序列同一性比較進行評價時，2個所編碼多肽之間的百分比序列同一 性是至少約 40 %、45 %、50 %、55 %、60 %、65 %、70 %，一般至少約 75 %、80 %、85 %，至少約 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%，或至少約98%、99%或更多序列同一性。
[0072] 如本文使用的，術語"變體蛋白質"包含通過下述衍生自自然蛋白質的多肽：對于 自然蛋白質的N末端和/或C末端的一個或多個氨基酸的缺失(所謂的平截）或添加；在自 然蛋白質中的一個或多個位點上的一個或多個氨基酸的缺失或添加；或在自然蛋白質中的 一個或多個位點上的一個或多個氨基酸的取代。因此，術語"變體蛋白質"包含自然蛋白質 的生物學活性片段，其包括足夠數目的鄰接氨基酸殘基，以保留自然蛋白質的生物學活性， 即具有殺蟲活性。相對于自然蛋白質，此種殺蟲活性可以是不同或改善的，或它可以是未改 變的，只要殺蟲活性被保留。
[0073] 由實施方案包含的變體蛋白質是生物學活性的，即它們繼續(xù)具有自然蛋白質的所 需生物學活性，即如本文描述的殺蟲活性。此種變體可以起因于例如遺傳多態(tài)性或人為操 作。實施方案的自然殺蟲蛋白質的生物學活性變體將與自然蛋白質的氨基酸序列具有至少 約 60%、65%、70%、75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、 95%、96 %、97 %、98 %、99 %或更多序列同一性，如通過本文其他地方描述的序列比對程序 使用缺省參數測定的。實施方案的蛋白質的生物學活性變體可以與那種蛋白質相差少至 1-15個氨基酸殘基，少至1-10例如6-10,少至5,少至4、3、2或甚至1個氨基酸殘基。
[0074] 實施方案進一步包含用實施方案的至少一種核酸、包括核酸的表達盒、或包括表 達盒的載體轉化的微生物。在一些實施方案中，微生物是在植物上繁殖的那種。本發(fā)明的 實施方案涉及被囊化的殺蟲蛋白質，其包含能夠表達實施方案的至少一種殺蟲蛋白質的轉 化的微生物。
[0075] 實施方案提供了包括實施方案的轉化的微生物的殺蟲組合物。在此種實施方案 中，轉化的微生物一般連同合適載體一起，以殺蟲有效量存在于殺蟲組合物中。實施方案還 包含殺蟲組合物，其包括連同合適的載體一起，以殺昆蟲有效量，單獨或與實施方案的轉化 的生物和/或實施方案的被囊化的殺蟲蛋白質組合的實施方案的分離的蛋白質。
[0076] 實施方案進一步提供了通過使用與至少一種其他或"第二種"殺蟲蛋白質組合的 實施方案的殺蟲蛋白質增加昆蟲靶范圍的方法。本領域已知的任何殺蟲蛋白質都可以在實 施方案的方法中采用。此種殺蟲蛋白質包括但不限于毒素、蛋白酶抑制劑、α-淀粉酶 和過氧化物酶。
[0077] 實施方案還包含包括實施方案的至少一種核苷酸序列的轉化的或轉基因植物。在 一些實施方案中，植物用核苷酸構建體穩(wěn)定轉化，所述核苷酸構建體包括與啟動子可操作 地連接的實施方案的至少一種核苷酸序列，所述啟動子驅動在植物細胞中的表達。如本文 使用的，術語"轉化的植物"和"轉基因植物"指在其基因組內包括異源多核苷酸的植物。一 般地，異源多核苷酸在轉基因或轉化的植物的基因組內穩(wěn)定整合，從而使得多核苷酸傳遞 給連續(xù)世代。異源多核苷酸可以單獨或作為重組表達盒的部分整合到基因組內。
[0078] 應當理解如本文使用的，術語"轉基因的"包括任何細胞、細胞系、愈傷組織、組織、 植物部分或植物，其基因型已通過異源核酸的存在加以改變，包括最初如此改變的那些轉 基因生物以及通過有性雜交或無性繁殖由最初轉基因生物產生的那些。如本文使用的，術 語"轉基因的"不包含通過常規(guī)植物育種方法或通過天然存在的事件的基因組改變(染色體 或染色體外的)，所述天然存在的事件例如隨機異體受精、非重組病毒感染、非重組細菌轉 化、非重組轉座或自發(fā)突變。
[0079] 如本文使用的，術語"植物"包括全植物、植物器官(例如葉、莖、根等)、種子、植物 細胞及其后代。轉基因植物的部分在實施方案的范圍內，并且包括例如源于先前用實施方 案的DNA分子轉化的轉基因植物或其后代且因此至少部分由轉基因細胞組成的植物細胞、 原生質體、組織、愈傷組織、胚以及花、莖、果實、葉和根。
[0080] 如本文使用的，術語植物包括植物細胞、植物原生質體、植物可以由其再生的植物 細胞組織培養(yǎng)物、植物愈傷組織、植物塊和植物細胞，其在植物或植物的部分中是完整的， 例如胚、花粉、胚珠、種子、葉、花、枝、果實、仁、穗、穗軸、外殼、莖、根、根尖、花藥等?？梢栽?實施方案的方法中使用的植物類別一般與適合于轉化技術的高等植物類別一樣廣泛，包 括單子葉和雙子葉植物。此種植物包括例如馬鈴薯iMerios--)和玉蜀黍(Zea mays ) 〇
[0081] 雖然實施方案不依賴于特定生物學機制用于增加植物對植物害蟲的抗性，但實施 方案的核苷酸序列在植物中的表達可以導致實施方案的殺蟲蛋白質的產生和植物對植物 害蟲的抗性中的增加。實施方案的植物在農業(yè)中在用于影響昆蟲害蟲的方法中有用。特定 實施方案提供了轉化的作物植物，例如玉蜀黍植物，其在用于影響植物的昆蟲害蟲例如玉 米螟的方法中有用。
[0082] "主題植物或植物細胞"是其中已就目的基因而言實現遺傳改變例如轉化的那種， 或由如此改變的植物或細胞遺傳且包括改變的植物或植物細胞。"對照"或"對照植物"或 "對照植物細胞"提供了用于測量主題植物或植物細胞的表型中的改變的參考點。
[0083] 對照植物或植物細胞可以包括例如：（a)野生型植物或細胞，即具有與用于遺傳 改變的原材料相同的基因型，所述遺傳改變導致主題植物或細胞；（b)具有與原材料相同 的基因型但已用無效構建體（即用對目的性狀不具有已知作用的構建體，例如包括標記基 因的構建體)轉化的植物或植物細胞；（c)在主題植物或植物細胞的后代中其為非轉化分離 子的植物或植物細胞；（d)在遺傳上等同于主題植物或植物細胞但不暴露于將誘導目的基 因表達的條件或刺激的植物或植物細胞；或（e)在其中目的基因不表達的條件下的主題植 物或植物細胞本身。
[0084] 本領域技術人員將容易確認在分子生物學領域中的進展例如位點特異性和隨機 誘變、聚合酶鏈反應方法和蛋白質工程改造技術，提供了適合于用于改變或工程改造有農 業(yè)價值的蛋白質的氨基酸序列和基礎遺傳序列的工具和規(guī)程的廣泛集合。
[0085] 因此，實施方案的蛋白質可以以各種方式加以改變，包括氨基酸取代、缺失、平截 和插入。用于此種操作的方法是本領域一般已知的。例如，殺蟲蛋白質的氨基酸序列變體 可以通過將突變引入合成核酸(例如DNA分子）內進行制備。用于誘變和核酸改變的方法 是本領域眾所周知的。例如，設計的改變可以使用寡核苷酸介導的位點定向誘變技術引入。 參見例如，Kunkel (1985)/￥oc.他從 JcatZ 5bi.82:488-492 ;Kunkel 等人（1987) ifeiAoofe i/? 7. 154:367-382;美國專利號 4,873, 192 ;Walker 和 Gaastra，編輯 Techniques in Molecular Biology (MacMillan Publishing Company,New York) 和其中引用的參考文獻。
[0086] 實施方案的誘變處理的核苷酸序列可以如此修飾，以便改變所編碼的多肽的一級 序列中存在的約1、2、3、4、5、6、8、10、12個或更多個氨基酸。可替代地，來自自然序列的 甚至更多改變可以這樣引入，從而使得與相應野生型蛋白質相比較，所編碼的蛋白質可以 具有至少約 1%或 2%，或約 3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%，或甚至約 13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%或20%、21%、22%、23%、24%或25%、30%、35% 或40%或更多改變或以其他方式修飾的密碼子。以相同方式，與相應野生型蛋白質相比較， 所編碼的蛋白質可以具有至少約1%或2%，或約3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、 11 %、12 %，或甚至約 13 %、14 %、15 %、16 %、17 %、18 %、19 %或 20 %、21 %、22 %、23 %、 24%或25%、30%、35%或40%或更多另外的密碼子。應當理解實施方案的誘變處理的核 苷酸序列意欲包含生物學功能的等價肽，其具有殺蟲活性，例如改善的殺蟲活性，如通過針 對玉米螟幼蟲的拒食劑性質測定的。此種序列可以由于已知在核酸序列和因此編碼的蛋白 質內天然存在的密碼子冗余和功能等價性而出現。
[0087] 本領域技術人員可認識到氨基酸添加和/或取代一般基于氨基酸側鏈取代基的 相對相似性，例如其疏水性、電荷、大小等?？紤]各種前述特征的示例性氨基酸取代組是本 領域技術人員眾所周知的，并且包括：精氨酸和賴氨酸；谷氨酸和天冬氨酸；絲氨酸和蘇氨 酸；谷氨酰胺和天冬酰胺；以及纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸。
[0088] 關于不影響目的蛋白質的生物學活性的合適氨基酸取代的指導可以在DayhofT ^ 1978) At las of Protein Sequence and Structure (Natl. Biomed. Res. Found., Washington，D.C.)的模型中找到，其引入本文作為參考。可以進行保守取代例如用具有相 似性質的另一個交換一個氨基酸。
[0089] 因此，實施方案的基因和核苷酸序列包括天然存在的序列和突變體形式。同樣地， 實施方案的蛋白質包含天然存在的蛋白質和其變異(例如截短的多肽）及修飾(例如突變 體）形式。此種變體將繼續(xù)具有所需殺蟲活性。明顯地，在編碼變體的核苷酸序列中將進 行的突變必須不將序列置于閱讀框外，并且一般不產生將產生二級mRNA結構的互補區(qū)。參 見，EP專利申請
【發(fā)明者】A.R.阿巴德, 董華, D.M.卡普卡-基茨曼, S.B.羅, 施曉梅 申請人:先鋒國際良種公司