專利名稱：酶制劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用作生物催化劑的新的酶制劑。
技術(shù)背景
微生物和分離的酶廣泛用作化學(xué)工業(yè)或食品制造中的催化劑。例如A.Liese， K.Seelbach, C. Wandrey, Industrial Biotransformations, Wiley-VCH :2000, ffeinheim, Germany提供了綜述。
為了保證經(jīng)濟(jì)使用這些生物催化劑，必需滿足一些條件生物催化劑必需在反應(yīng)條件下保持活性足夠長時(shí)間，在反應(yīng)結(jié)束之后應(yīng)容易除去并且應(yīng)盡可能多次重復(fù)使用。理想地，應(yīng)當(dāng)在非常廣泛的反應(yīng)條件(例如溫度范圍、所用溶劑類型、壓力，等)下滿足這些條件，以提供盡可能通用的催化劑。
為了滿足這些條件，通常需要將所用酶或含有酶的微生物固定。
通常，酶或含酶微生物非共價(jià)地固定在載體上；所用載體經(jīng)常是具有適當(dāng)粒度分布的離子交換樹脂或聚合物顆粒。其實(shí)例有市售產(chǎn)品得自Novozymes A/S，Bagsvaerd, Denmark 的 Novozym 435、Lipozym RM IM 或 Lipozym TL IM 或者得自 Amano, Japan 的 Amano PS0這些實(shí)例是具有廣泛用途的固定脂肪酶，由于這些固定物在非水系統(tǒng)，即，僅包括有機(jī)溶劑(即使有的話)的系統(tǒng)，中也具有工業(yè)可利用的活性，例如J. Chem. Soc. ,Chem. Comm. 1989,934-935中所述。然而使用這種固定物的缺陷首先是根據(jù)所用反應(yīng)系統(tǒng)發(fā)生的酶或含酶微生物的解吸附，例如在使用表面活性劑組分的情況下。在對(duì)比實(shí)施例1中顯示與這種解吸附有關(guān)的活性損失。此外，這種制劑不具有足夠的機(jī)械穩(wěn)定性，結(jié)果，即使能使用，僅可以在接受大大受限制的重復(fù)使用性的情況下，在簡單的攪拌反應(yīng)器中使用。在對(duì)比實(shí)施例2中顯示了這些制劑的機(jī)械不穩(wěn)定。
為了能夠重復(fù)使用這些酶制劑，需要使用其它反應(yīng)器設(shè)計(jì)。例如，Eur. J. Lipid Sci. Technol. 2003，105，601-607描述了使用固定床反應(yīng)器進(jìn)行脂肪酶-催化的酯化反應(yīng)。 然而，該方法的缺陷是限于低粘度均勻反應(yīng)混合物，這是由于高粘度混合物或懸浮體不能通過固定床運(yùn)送。
K. Faber “ Biotransformations in Organic Chemistry “ , Springer :2000, Berlir^Germany在第384頁描述了使用加入到海藻酸鹽中的酶。然而，由此獲得的制劑具有極其低的機(jī)械穩(wěn)定性并且在非水系統(tǒng)中僅呈現(xiàn)低的活性。
此外，描述了固定酶與反應(yīng)物質(zhì)(例如戊二醛)的隨后交聯(lián)。然而，缺陷是與改性之前的活性相比，交聯(lián)的制劑的比活經(jīng)常大大降低。而且，該方法不能改善機(jī)械穩(wěn)定性。
同樣描述了在反應(yīng)載體上共價(jià)固定酶。其缺陷是在酶表面需要有合適的官能團(tuán)， 其可以與載體反應(yīng)；此外，結(jié)果經(jīng)常導(dǎo)致酶活損失。
J. Am. Chem. Soc. 1999，121，9487-9496描述了將酶加入到稱之為溶膠-凝膠的硅氧烷基質(zhì)中。溶膠-凝膠制劑的缺陷是粒度分布低，使通過過濾的有效去除復(fù)雜化、缺少機(jī)械穩(wěn)定性、發(fā)生解吸附、使用有毒反應(yīng)物(TE0S的毒性，例如參見Nippon Sanso Giho 1990， 9，68-72 和 Archives of Toxicologyl994,68, 277-283 ；TMOS 的毒性例如參見 Fundamental and Applied Toxicology 1989,13,285-295)；對(duì)于無毒溶膠-凝膠的生產(chǎn)，需要大量步驟， 例如貯藏超過6個(gè)月或者在350°C下熱處理，如Polimery w Medycynie 2000,30,45-54 ψ 所述，并且其溶脹性能非常大地取決于所用溶劑并且不能通用于不同反應(yīng)系統(tǒng)(含水和非水)。J.Sol Gel Sci. Technol. 2003，沈，1183-1187通過實(shí)例顯示了觀察到的酶活性的溶劑依賴性并因此不能滿足廣泛使用性的需要。
Landbauforschung Volkenrode5 2002, special edition 241，41-46 描述了其中酶首先固定在“細(xì)”聚硅氧烷顆粒上然后包封在溶膠-凝膠中的溶膠-凝膠制劑。因此部分解決了機(jī)械穩(wěn)定性的問題，但是所述實(shí)驗(yàn)顯示僅在所選溶劑中獲得足夠的活性；完全沒有描述在無溶劑系統(tǒng)中的使用。此外，這些制劑不是以直接可用的形式獲得，而是首先必需切成適當(dāng)大小，這僅僅在工業(yè)規(guī)模可以實(shí)施。
J. Mol. Catal. B, 2005，35,93-99描述了通過將酶水溶液加入到稱之為靜態(tài)乳劑的機(jī)械穩(wěn)定的聚硅氧烷球中的固定酶。所得制劑的比活盡管高達(dá)33U/g，但是與上述在惰性載體上的固定物相比還太低，其中可以容易地獲得大于1000U/g的比活(U=單位或ymol/ min) ο
WO 03/106607A1同樣描述了這種靜態(tài)乳劑，但是專門描述了在含水系統(tǒng)中使用； 該應(yīng)用是洗滌組合物，即不是生物催化，并且所得粒度為約10 μ m,對(duì)于從有機(jī)反應(yīng)混合物中有效過濾掉來說太小。
因此一直需要一種酶固定方法，克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，以實(shí)現(xiàn)迄今不能實(shí)現(xiàn)的生物催化過程。發(fā)明內(nèi)容
因此，本發(fā)明的目的是提供沒有現(xiàn)有技術(shù)制劑的一種或多種缺陷的酶制劑。具體地說，應(yīng)提供酶制劑，它相對(duì)機(jī)械力和解吸附具有高的穩(wěn)定性，同時(shí)優(yōu)選在不同的含水和非水反應(yīng)混合物中具有的比活足夠高，以能夠工業(yè)應(yīng)用。基于它們的粒度分布，酶制劑應(yīng)優(yōu)選能夠以簡單方式從反應(yīng)系統(tǒng)中除去并且重復(fù)使用。
從下面說明書的內(nèi)容、實(shí)施例和權(quán)利要求，沒有具體解釋的其它目的將是顯而易見的。
已出人意料地發(fā)現(xiàn)，通過將酶或含酶微生物固定在惰性載體上，然后用通過氫化硅烷化獲得的聚硅氧烷涂層涂布獲得的酶制劑能夠?qū)崿F(xiàn)上述目的。
本發(fā)明因此提供了酶制劑以及它們作為工業(yè)生物催化劑的用途，該酶制劑可以通過包括固定在惰性載體上的酶或含酶微生物的酶固定物并提供有通過氫化硅烷化獲得的聚硅氧烷涂層獲得。
本發(fā)明還提供了一種制備本發(fā)明酶制劑的方法，其特征在于對(duì)包括固定在惰性載體上的酶或含酶微生物的酶固定物提供通過氫化硅烷化獲得的聚硅氧烷涂層。
本發(fā)明的酶制劑具有相對(duì)機(jī)械應(yīng)力和解吸附的穩(wěn)定性高的優(yōu)點(diǎn)。除了這些改進(jìn)的性能，本發(fā)明的酶制劑在各種含水反應(yīng)混合物(例如在三丁酸甘油酯的水解中)和非水反6應(yīng)混合物(例如在月桂酸丙酯的無溶劑合成中)中具有工業(yè)應(yīng)用的足夠高的比活，本發(fā)明的酶制劑也具有通過選擇載體材料和其相關(guān)粒度分布來調(diào)整粒度，使得能夠從反應(yīng)系統(tǒng)中簡單地除去酶制劑，并因此也可以重新使用該酶制劑的優(yōu)點(diǎn)。
具體實(shí)施方式
下面通過實(shí)例描述本發(fā)明的酶制劑及其制備方法，然而本發(fā)明決不限于這些描述的實(shí)施方案。當(dāng)下面描述范圍、通式或化合物類時(shí)，它們不應(yīng)僅包括明確提及的相應(yīng)范圍或基團(tuán)，而是也包括通過選擇單個(gè)值(范圍)或化合物獲得的所有子范圍和次基團(tuán)。當(dāng)將文獻(xiàn)引入本說明書時(shí)，它們的內(nèi)容應(yīng)完全加入到本發(fā)明的公開內(nèi)容中。當(dāng)可能具有多于一個(gè)的不同單元的化合物在本發(fā)明的內(nèi)容中描述時(shí)，例如有機(jī)改性的聚硅氧烷，它們可以以隨機(jī)分布(統(tǒng)計(jì)學(xué)低聚物)或規(guī)則(嵌段低聚物)存在于這些化合物中。至于在這些化合物中的單元的數(shù)目的信息應(yīng)解釋為平均值，所有適合化合物的平均。
本發(fā)明的酶制劑顯著的是它們可以通過向固定在惰性載體上的包括酶或含酶微生物的酶固定物提供通過氫化硅烷化獲得的聚硅氧烷涂層獲得。
為了制得該酶固定物，可以使用整個(gè)細(xì)胞、靜止細(xì)胞、純化酶或含有相應(yīng)酶的細(xì)胞提取物、或它們的混合物。優(yōu)選使用水解酶，例如脂肪酶、酯酶或蛋白酶，例如得自皺褶假絲(Candida rugosa) > itIMi^SI# (Candida antarctica)Thermomyceslangosiosus、豬胰腺、米黑毛霉(Mucor miehei), Alcaligines sp.的脂肪酶、得自皺褶假絲酵母的膽固醇酯酶、得自豬肝的酯酶，更優(yōu)選脂肪酶。因此，酶固定物優(yōu)選包括得自水解酶類的酶，優(yōu)選脂肪酶。
所用惰性載體可以是惰性有機(jī)或無機(jī)載體。所用或者存在于酶固定物中的惰性載體優(yōu)選是具有其中至少90%的顆粒具有10-5000μπι，優(yōu)選50μπι-2000μπι的粒度的粒度分布的那些微粒載體。所用有機(jī)載體尤其可以是那些包含聚丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸酯、聚乙烯基苯乙烯、苯乙烯-二乙烯基苯共聚物、聚丙烯、聚乙烯、聚對(duì)苯二甲酸乙二酯、PTFE和/或其它聚合物或者由它們組成。根據(jù)待固定的酶，所用載體材料可以特別是酸性或堿性離子交換樹脂，例如Duolite Α568、Duolite XAD 761、Duolite XAD 1180、 Duolite XAD 7ΗΡ、Amberlite IR 120、Amberlite IR 400、Amberlite CG 50、Amberlyst 15 (都是 Rohm and Haas 的產(chǎn)品)或 Lewatit CNP 105 和 Lewatit VP OC 1600 (Lanxess, Leverkusen, Germany的產(chǎn)品)。所用無機(jī)載體可以是現(xiàn)有技術(shù)已知的氧化的和/或陶瓷載體。特別是，所用無機(jī)載體例如可以是C鹽、沸石、二氧化硅、可控多孔玻璃(CPG)或其它載體，如 L. Cao, “ Carrier-bound Immobilized Enzymes :Principles, Application and Design"，Wiley-VCH :2005,ffeinheim,Germany中所述。更優(yōu)選，存在于酶固定物中的惰性載體或者用于制備酶固定物的惰性載體包括聚乙烯基苯乙烯、聚甲基丙烯酸酯或聚丙烯酸
根據(jù)本發(fā)明，在顆粒上的固定可以共價(jià)或非共價(jià)地進(jìn)行，優(yōu)選非共價(jià)地進(jìn)行。就非共價(jià)固定而言，載體例如可以用酶水溶液(可以任選含有其它組分，例如無機(jī)鹽或去污劑) 培養(yǎng)或浸漬。該培養(yǎng)/浸漬例如可以在0°C-50°C，優(yōu)選0°C-40°C的溫度下進(jìn)行。優(yōu)選培養(yǎng)/浸漬進(jìn)行幾分鐘到幾小時(shí)。該培養(yǎng)過程可以隨后通過蛋白質(zhì)測(cè)定的常規(guī)方法測(cè)定溶液中的酶濃度。達(dá)到所需固定度之后，載體可以優(yōu)選用水洗滌，并且如果需要的話，進(jìn)行干燥。
其中
N = a+b+c+d+2 = 3-850，優(yōu)選 6-160，
a = 1-800，優(yōu)選 2-150，
b = 0-400，優(yōu)選 2-75，
c = 0-10，優(yōu)選 0，
d = 0-10，優(yōu)選 0，
R1各自相同或不同，并且選自以下的組飽和或不飽和的、任選枝化的具有1-30 個(gè)碳原子的烷基、具有7-30個(gè)碳原子的烷芳基和具有6-30個(gè)碳原子的芳基，優(yōu)選具有1-4 個(gè)碳原子的烷基或苯基，特別是甲基；
R2a各自是氫或R1;
R2b各自是氫或R1;
R3各自是相同或不同的通式Ia的基團(tuán)
以這種方式獲得的酶固定物然后可以提供有本發(fā)明的聚硅氧烷涂層。
然而，根據(jù)本發(fā)明，也可以使用可商購獲得的酶固定物，例如得自Novozymes A/S， Bagsvaerd, Denmark 白勺 Novozym 435、Lipozym RM IM 或 Lipozym TL IM，或者得自 Amano, Japan StJ Amano PS。
根據(jù)本發(fā)明，聚硅氧烷涂層是通過氫化硅烷化獲得的。為此，優(yōu)選Si-H-官能的聚娃氧烷在有催化劑，優(yōu)選過渡金屬催化劑的情況下，與具有至少一個(gè)末端碳-碳雙鍵，優(yōu)選至少兩個(gè)碳-碳雙鍵的有機(jī)改性的聚硅氧烷反應(yīng)。
所用Si-H-官能的聚硅氧烷優(yōu)選是通式I的SiH聚硅氧烷
權(quán)利要求
1.酶制劑，通過包括固定在惰性載體上的酶或含酶微生物的酶固定物獲得，所述酶固定物提供有通過氫化硅烷化獲得的聚硅氧烷涂層。
2.權(quán)利要求1的酶制劑，特征在于所述酶是得自水解酶類的酶，優(yōu)選脂肪酶類。
3.權(quán)利要求1和2任一項(xiàng)的酶制劑，特征在于所述惰性載體具有其中90%的顆粒的粒度為10-5000 μ m的粒度分布。
4.權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)的酶制劑，特征在于所用的惰性載體包括聚乙烯基苯乙烯、聚甲基丙烯酸酯或聚丙烯酸酯。
5.權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)的酶制劑，特征在于所述聚硅氧烷涂層是通過用含末端碳-碳雙鍵的聚硅氧烷氫化硅烷化SiH-官能的聚硅氧烷獲得的。
6.權(quán)利要求5的酶制劑，特征在于所用SiH組分是通式I的聚硅氧烷
7.權(quán)利要求6的酶制劑，特征在于所用SiH組分是通式I的聚硅氧烷
8.權(quán)利要求5-7中至少一項(xiàng)的酶制劑，特征在于所用含末端碳-碳雙鍵的聚硅氧烷是通式II的聚硅氧烷N = m+n+o+p+2 = 3-1000, m = 1-800， η = 0-20， ο = 0-10， ρ = 0-10，R4各自相同或不同的且選自以下基團(tuán)飽和或不飽和的、任選枝化的具有1-30個(gè)碳原子的烷基、具有7-30個(gè)碳原子的烷芳基和具有6-30個(gè)碳原子的芳基； R5各自是末端不飽和的烷基或烷氧基或R4 ； &各自是相同或不同的通式IIa的基團(tuán)
9.權(quán)利要求5-8中至少一項(xiàng)的酶制劑，特征在于所用含末端碳-碳雙鍵的聚硅氧烷是通式II的聚硅氧烷
10.權(quán)利要求1-7任一項(xiàng)的酶制劑的制備方法，特征在于對(duì)包括固定在惰性載體上的酶或含酶微生物的酶固定物提供通過氫化硅烷化獲得的聚硅氧烷涂層。
11.權(quán)利要求10的方法，特征在于通過將所述酶固定物與含SiH-官能的聚硅氧烷、含末端碳-碳雙鍵的聚硅氧烷和在氫化硅烷化條件下催化氫化硅烷化的催化劑的反應(yīng)混合物接觸，向所述酶固定物提供聚硅氧烷涂層。
12.權(quán)利要求1-9任一項(xiàng)的酶制劑作為工業(yè)生物催化劑的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及酶制劑，其可以通過固定在惰性載體上的酶或含酶微生物的酶固定物獲得，所述酶固定物提供有通過氫化硅烷化獲得的聚硅氧烷涂層，本發(fā)明還涉及這種酶制劑的制備方法和酶制劑作為工業(yè)生物催化劑的用途。
文檔編號(hào)C12N11/08GK102517273SQ201110404869
公開日2012年6月27日 申請(qǐng)日期2008年7月4日 優(yōu)先權(quán)日2007年7月6日
發(fā)明者A·布特, L·維曼, M·安佐格-舒馬赫, O·圖姆 申請(qǐng)人:贏創(chuàng)戈?duì)柕率┟滋赜邢薰?br>