專利名稱：一種人白血病細(xì)胞胞質(zhì)體的制備及鑒定方法
一種人白血病細(xì)胞胞質(zhì)體的制備及鑒定方法技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種人白血病細(xì)胞胞質(zhì)體的制備及鑒定方法。
背景技術(shù)：
細(xì)胞質(zhì)在細(xì)胞分化過程中起著決定作用，胞質(zhì)體(Cytoplast)即去核細(xì)胞，是研究線粒體DNA、細(xì)胞質(zhì)膜成分及功能、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞分化等很好的生物模型，也是通過細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)替換實(shí)現(xiàn)細(xì)胞重構(gòu)的必備要件。胞質(zhì)體的制備方法分為侵入性脫核和非侵入性脫核兩種，前者是采用顯微操作機(jī)械去核，適用于體積較大的細(xì)胞；后者是在細(xì)胞松弛素 (Cytochalasin B, CB)介導(dǎo)下通過離心脫核，適用于體積較小的細(xì)胞。CB介導(dǎo)的脫核技術(shù)已普遍用于大量胞質(zhì)體的制備。但針對體外非貼壁生長細(xì)胞胞質(zhì)體的制備該項(xiàng)技術(shù)還有諸如預(yù)處理方法、脫核介質(zhì)、脫核溫度、胞質(zhì)體純化及鑒定等技術(shù)環(huán)節(jié)有待改進(jìn)。本發(fā)明針對這些技術(shù)環(huán)節(jié)，對體外懸浮生長的人白血病細(xì)胞HL-60胞質(zhì)體的制備進(jìn)行了優(yōu)化，為進(jìn)一步實(shí)施人白血病細(xì)胞胞質(zhì)體和成體干細(xì)胞核質(zhì)體的細(xì)胞重構(gòu)，探討白血病細(xì)胞胞質(zhì)在細(xì)胞分化過程中的作用奠定了基礎(chǔ)。
人白血病細(xì)胞胞質(zhì)體是研究腫瘤細(xì)胞線粒體DNA、細(xì)胞質(zhì)膜成分及功能、代謝變化、物質(zhì)交換等重要的生物模式；另一方面，通過其胞質(zhì)體與體細(xì)胞核進(jìn)行細(xì)胞重構(gòu)，對闡明細(xì)胞質(zhì)在細(xì)胞分化過程中的分子機(jī)制具有重要意義。然而，人白血病細(xì)胞體外培養(yǎng)呈非貼壁生長，具有高增殖性，大量瘤細(xì)胞處于有絲分裂期，單用CB不易脫核，不能獲得高收率的胞質(zhì)體。
制備高純度的胞質(zhì)體是實(shí)現(xiàn)大量細(xì)胞重構(gòu)和其它后續(xù)研究的必要前提。任何通過 CB介導(dǎo)所制備的胞質(zhì)體都會有未脫核細(xì)胞的混雜，為了保證后實(shí)驗(yàn)的精準(zhǔn)性，胞質(zhì)體應(yīng)進(jìn)一步純化。但目前未見這方面的介紹。
胞質(zhì)體的鑒定方法較多，有姬母薩染色、HE染色、Hoechst 33258染色、DAPI染色等，但這些方法存在染色后的胞質(zhì)體不能用于后續(xù)研究，如姬母薩染色、HE染色，或不能直接染色胞質(zhì)體，如Hoechst 33258染色、DAPI染色。
基于上述人白血病細(xì)胞胞質(zhì)體的制備及鑒定存在的問題，本發(fā)明提供一種人白血病細(xì)胞胞質(zhì)體的制備及鑒定方法。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明解決的技術(shù)問題是現(xiàn)有人白血病細(xì)胞胞質(zhì)體的制備及鑒定存在的胞質(zhì)體收率不高，染色后的胞質(zhì)體不能用于后續(xù)研究或不能直接染色胞質(zhì)體等問題，本發(fā)明是提供一種人白血病細(xì)胞胞質(zhì)體制備方法和鑒定方法。
本發(fā)明采用的技術(shù)方案，本發(fā)明的人白血病細(xì)胞胞質(zhì)體的制備方法，包括以下步驟第一，取對數(shù)生長期人白血病HL-60細(xì)胞，離心后去上清，沉淀用培養(yǎng)基懸浮。取Percoll溶液于離心管中，將上述細(xì)胞懸液鋪于Percoll溶液面，離心去除白膜層，沉淀用無血清DMEM懸浮，得到純化的HL-60細(xì)胞；
第二，將上述純化的細(xì)胞懸液加入細(xì)胞松馳素和秋水酰堿，孵育，離心去除上清，留細(xì)胞沉淀；
第三，將細(xì)胞沉淀再懸浮于含細(xì)胞松馳素的Percoll溶液中，加入超速離心管中配平， 轉(zhuǎn)子提前預(yù)熱至34°C，水平離心吸棄上清，收集Percoll液面上的部分，加入預(yù)冷的DMEM 混勻，離心去除上清，沉淀用DMEM懸浮，再離心去除上清，沉淀用DMEM懸浮，得到胞質(zhì)體懸液；
第四，將上述的胞質(zhì)體懸液鋪于Percoll液面上，水平離心吸取白膜層，加入DMEM混合，離心除去上清，用DMEM懸浮，得到人白血病細(xì)胞胞質(zhì)體。本發(fā)明的人白血病細(xì)胞胞質(zhì)體的鑒定方法，采用熒光雙染色鑒定人白血病細(xì)胞胞質(zhì)體向胞質(zhì)體懸液中加4，6-聯(lián)脒-2-苯基吲哚二鹽酸鹽儲存液，再加入羧基熒光素二醋酸鹽琥珀酰亞胺酯儲存液，混勻，避光孵育，離心去上清；再加入PBS懸浮，離心去上清，此步驟再重復(fù)二次，適量PBS懸浮沉淀，將液體移入M孔板，沉降，用熒光顯微鏡觀察結(jié)果。本發(fā)明達(dá)到的有益效果①基于秋水仙堿具有抑制腫瘤細(xì)胞有絲分裂作用， 與細(xì)胞松馳素聯(lián)用在34°C條件下離心可明顯提高脫核率，人白血病HL-60細(xì)胞的脫核率可達(dá)90% 93%，明顯高于單用CB脫核；②采用38% Percoll密度梯度離心法純化胞質(zhì)體其純度>95%，胞質(zhì)體直徑> 5 ym,脫核前HL-60細(xì)胞的平均直徑為9. 92 μ m ； ③DNA熒光染料4，6-聯(lián)脒-2-苯基吲哚二鹽酸鹽(4 ‘，6-diamidino-2-phenylindole, dihydrochloride, DAPI)可穿透活細(xì)胞細(xì)胞膜與雙鏈DNA結(jié)合并產(chǎn)生比DAPI自身強(qiáng)20余倍的藍(lán)色熒光，無明顯細(xì)胞毒性；胞質(zhì)蛋白質(zhì)熒光染料羧基熒光素二醋酸鹽琥珀酰亞胺酯 (5, 6-carboxyflu-orescein diacetate succinimidyl ester，CFSE)是一禾中無細(xì)胞毒性焚光染料，經(jīng)紫外光激發(fā)呈綠色熒光，進(jìn)人細(xì)胞后不可逆地與胞內(nèi)的氨基結(jié)合偶聯(lián)到蛋白質(zhì)上，不被代謝降解，采用DAPI和CFSE熒光雙染色鑒定胞質(zhì)體有極高區(qū)分度，被CFSE嗜染的胞質(zhì)體可再用于后續(xù)的研究；④本發(fā)明方法適用于所有體外非貼壁生長腫瘤細(xì)胞胞質(zhì)體的制備及鑒定。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1
本發(fā)明的人白血病細(xì)胞胞質(zhì)體的制備方法，具體包括以下步驟 第一，取對數(shù)生長期人白血病HL-60細(xì)胞，1000轉(zhuǎn)/分離心5分鐘，去上清，沉淀用Iml 培養(yǎng)基懸浮，取42% Percoll溶液3ml于15ml離心管中，將上述細(xì)胞懸液小心鋪于Percoll 溶液面，20°C，1500轉(zhuǎn)/分離心30分鐘，去除白膜層，沉淀用無血清DMEM懸浮至1ml，此為純化的HL-60細(xì)胞；
第二，上述純化的細(xì)胞懸液(5X IO7個細(xì)胞//ml)加入CB (終濃度為10yg/ml) 和秋水酰堿(終濃度為5 μ g/ml)，同時設(shè)置僅含CB (終濃度為10 μ g/ml)組作為對照， 37°C孵育30分鐘。1000轉(zhuǎn)/分離心5分鐘，去除上清，留細(xì)胞沉淀；
第三，細(xì)胞沉淀再懸浮于含10μ g/mlCB的50% Percoll溶液中，加入超速離心管中配平，轉(zhuǎn)子提前預(yù)熱至34°C，于34°C、20 600轉(zhuǎn)/分水平離心70分鐘，吸棄上清(細(xì)胞成分)，收集Percoll液面上的部分，按1 :4 (V/V)加入預(yù)冷的DMEM混勻，于10°C、2 350轉(zhuǎn)/分離心15分鐘，去除上清。沉淀用5ml的DMEM懸浮，于10°C、2 350轉(zhuǎn)/分離心15分鐘，去除上清，沉淀用5ml的DMEM懸浮，即為胞質(zhì)體懸液。通過此步驟，CB聯(lián)合秋水酰堿組的HL-60 細(xì)胞的脫核率達(dá)93. 4%，而單用CB組的脫核率僅為75. 5% ；第四，將制備的胞質(zhì)體懸液體積1.5ml，分別鋪于:3ml 38%的Percoll液面上，于20°C、 1490轉(zhuǎn)/分水平離心30min，吸取白膜層，用DMEM按1 :4體積混合，10°C，2 350r/min離心15分鐘，除去上清，以適量DMEM懸浮，此為純化的胞質(zhì)體，其純度為95. 4%，而純化前為 92. 3% ；實(shí)施例2本發(fā)明的人白血病細(xì)胞胞質(zhì)體的鑒定方法，具體包括以下步驟 熒光雙染色鑒定胞質(zhì)體將上述純化的胞質(zhì)體懸液調(diào)體積至1ml，每管加DNA熒光染料 4，6-聯(lián)脒-2-苯基吲哚二鹽酸鹽(4'，6-diamidino-2-phenylindole, dihydrochloride, DAPI)儲存液(lmg/ml)50y 1 (終濃度為50μ g/ml)，再加入胞質(zhì)蛋白質(zhì)熒光染料羧基熒光素二醋酸鹽琥拍酉先亞胺酉旨(5，6-carboxyflu-orescein diacetate succinimidyl ester, CFSE)儲存液(δμπιο / ml) 1μ 1 (終濃度為5nmol/ ml)，混勻，37°C避光孵育20分鐘，于 10°C, 2 350轉(zhuǎn)/分離心12分鐘，去上清，加5mlPBS懸浮，10°C，2350轉(zhuǎn)/分離心12分鐘， 去上清，同法重復(fù)兩次，適量PBS懸浮沉淀，將液體移入M孔板，沉降20分鐘，熒光顯微鏡觀察，胞質(zhì)體嗜染CFSE呈綠色熒光但不顯DAPI藍(lán)色，而有核細(xì)胞的胞質(zhì)和核分別呈綠色和藍(lán)色。于倒置熒光顯微鏡下隨機(jī)觀察5個視野，用測微尺測量胞質(zhì)體的大小，并計算直徑彡5 μ m胞質(zhì)體的百分比，結(jié)果為直徑彡5 μ m的胞質(zhì)體達(dá)81. 3%，脫核前HL-60細(xì)胞的平均直徑為9. 92 μ m。
權(quán)利要求
1.一種人白血病細(xì)胞胞質(zhì)體的制備方法，其特征在于包括以下步驟第一，取對數(shù)生長期人白血病HL-60細(xì)胞，離心后去上清，沉淀用培養(yǎng)基懸浮，取 Percoll溶液于離心管中，將上述細(xì)胞懸液鋪于Percoll溶液面，離心去除白膜層，沉淀用無血清DMEM懸浮，得到純化的HL-60細(xì)胞懸液；第二，將上述純化的HL-60細(xì)胞懸液加入細(xì)胞松馳素和秋水酰堿，孵育，離心去除上清，留細(xì)胞沉淀；第三，將上述的細(xì)胞沉淀再懸浮于含細(xì)胞松馳素的Percoll溶液中，加入超速離心管中配平，轉(zhuǎn)子提前預(yù)熱，水平離心吸棄上清，收集Percoll液面上的部分，加入預(yù)冷的DMEM 混勻，離心去除上清，沉淀用DMEM懸浮，再離心去除上清，沉淀用DMEM懸浮，得到胞質(zhì)體懸液；第四，將上述的胞質(zhì)體懸液鋪于Percoll液面上，水平離心吸取白膜層，加入DMEM混合，離心除去上清，用DMEM懸浮，得到人白血病細(xì)胞胞質(zhì)體。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種人白血病細(xì)胞胞質(zhì)體的制備方法得到人白血病細(xì)胞胞質(zhì)體的鑒定方法，其特征在于采用熒光雙染色鑒定人白血病細(xì)胞胞質(zhì)體向人白血病細(xì)胞胞質(zhì)體懸液中加4，6-聯(lián)脒-2-苯基吲哚二鹽酸鹽儲存液，再加入羧基熒光素二醋酸鹽琥珀酰亞胺酯儲存液，混勻，避光孵育，離心去上清；再加入PBS懸浮，離心去上清，此步驟再重復(fù)二次，PBS懸浮沉淀，將液體移入M孔板，沉降，用熒光顯微鏡觀察結(jié)果。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種人白血病細(xì)胞胞質(zhì)體的制備及鑒定方法，經(jīng)純化的人白血病HL-60細(xì)胞用細(xì)胞松馳素和秋水酰堿處理，在34℃條件下離心脫核，收集胞質(zhì)體組份經(jīng)Percoll密度梯度離心法純化得到純化的胞質(zhì)體；采用DAPI和CFSE熒光雙染色鑒定胞質(zhì)體。本發(fā)明方法可使非貼壁生長的人白血病HL-60細(xì)胞的脫核率達(dá)90%以上，純化的胞質(zhì)體純度達(dá)95%以上，直徑≥5μm的胞質(zhì)體達(dá)81%，嗜染CFSE熒光探針的胞質(zhì)體可直接用于后續(xù)研究；經(jīng)本發(fā)明方法獲得的HL-60細(xì)胞胞質(zhì)體可廣泛用于白血病細(xì)胞胞質(zhì)成分及其代謝和功能、細(xì)胞重構(gòu)、細(xì)胞分化、細(xì)胞凋亡等研究；本發(fā)明方法適用于所有體外非貼壁生長腫瘤細(xì)胞胞質(zhì)體的制備及鑒定。
文檔編號C12N5/09GK102492655SQ20111040458
公開日2012年6月13日 申請日期2011年12月8日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月8日
發(fā)明者陳代雄 申請人:遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院