專利名稱：一種肌內(nèi)脂肪沉積fto基因的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及動物分子育種的基因工程技術(shù)，特別是一種與豬肌內(nèi)脂肪沉積相關(guān)的脂肪沉積與肥胖相關(guān)(fat mass and obesity associated, FTO)基因技術(shù)。
背景技術(shù)：
近年來，由于豬的選育工作中過度追求高瘦肉率，導(dǎo)致豬肉品質(zhì)的嚴(yán)重下降。隨著生活水平的不斷提高，人們對豬肉顏色、嫩度、風(fēng)味等肉品質(zhì)特性的要求也越來越高。肌內(nèi)脂肪(intramuscular fat, IMF)是影響肉品質(zhì)的重要因素，目前已得到越來越多的認(rèn)識和重視。肌內(nèi)脂肪的沉積是一個復(fù)雜的生理生化過程，主要涉及肌肉內(nèi)甘油三酯的代謝，包括甘油三酯的合成、分解及轉(zhuǎn)運(yùn)等過程。因此，肌內(nèi)脂肪細(xì)胞內(nèi)的脂類代謝是肌內(nèi)脂肪沉積的基礎(chǔ)。FTO 基因(Fat Mass and Obesity Associated, FTO)是一種與肥胖相關(guān)的等位基因，也稱肥胖基因。2007年英國牛津大學(xué)馬克·麥卡錫等研究人員首先鑒別出了等位基因FTO基因，定位在人16號染色體上，一個副本來自父體，另一副本來自母體，呈雙螺旋結(jié)構(gòu)。體內(nèi)FTO基因變異的人，如果兩個副本均變異，其肥胖的幾率會比那些無變異副本的人高出70%之多。小鼠實驗表明，F(xiàn)TO基因過度活躍會造成小鼠飲食過度，從而導(dǎo)致體重大幅增加。對人類的研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)TO基因使人缺乏對食欲的控制。正常的“一日三餐”無法消除 FTO基因攜帶者的饑餓感，導(dǎo)致他們不停進(jìn)食，并導(dǎo)致肥胖。且FTO基因?qū)κ秤挠绊懪c年齡、性別、社會經(jīng)濟(jì)背景或身高體重指數(shù)無關(guān)。因此，F(xiàn)TO基因是與肥胖相關(guān)的重要基因。德國科學(xué)家發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)TO基因受到抑制的老鼠出生后生長較慢，脂肪組織和瘦肉組織較少。出生 6周之內(nèi)，這些老鼠體重比其它同類輕30%至40%。研究人員認(rèn)為，F(xiàn)TO基因會抑制新陳代謝，降低能量消耗效率而導(dǎo)致肥胖。因此，這些FTO基因受到抑制的老鼠消耗能量較快。此外，F(xiàn)TO基因也可能通過影響內(nèi)分泌激素，如瘦素、脂聯(lián)素、腎上腺素等來調(diào)控食欲和能量代謝過程。FTO基因位于染色體16ql2. 2，基因全長約400kb，包括9個外顯子，全部編碼蛋白質(zhì)。FTO基因在人、鼠、豬以及其他哺乳動物中高度保守。FTO基因?qū)儆诜茄t素雙加氧酶超家族，編碼2 -酮戊二酸依賴型核酸脫甲基酶，是一種核酸修復(fù)酶，能作用于下丘腦弓狀核， 調(diào)節(jié)食欲和能量代謝。FTO基因mRNA在大腦內(nèi)，尤其下丘腦mRNA的表達(dá)最豐富，但在其他組織也有表達(dá)。動物實驗研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)TO基因能夠使DNA去甲基化，并參與DNA修復(fù)、脂肪酸代謝和翻譯后修飾?；蚪M關(guān)聯(lián)分析發(fā)現(xiàn)FT0基因內(nèi)有許多單核苷酸多態(tài)性位點，這些單核苷酸多態(tài)性位點與肥胖和胰島素敏感性有關(guān)，F(xiàn)TO基因的變異增加肥胖和2型糖尿病的風(fēng)險。目前FTO基因的功能仍然還是一個謎。FTO基因與肥胖存在顯著相關(guān)性毋庸置疑， 但體育鍛煉程度、飲食習(xí)慣、能量攝入對FTO基因表達(dá)的影響尚無定論。從目前的研究可以看出，F(xiàn)TO基因影響肥胖和2型糖尿病，然而FTO基因在很多組織中的廣泛表達(dá)，是否預(yù)示著FTO功能的普遍性；FT0參與肥胖的同時，是否還參與其他生物過程，因此，F(xiàn)TO基因的功能鑒定及其作用機(jī)制需要進(jìn)一步的研究。迄今為止，F(xiàn)T0基因的表達(dá)對豬肌內(nèi)脂肪沉積和 脂類代謝的影響及調(diào)節(jié)機(jī)理，國內(nèi)外尚未見報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種肌內(nèi)脂肪沉積FT0基因，采用基因芯片技術(shù)和生物信 息學(xué)分析方法，在對豬肌肉組織和肌內(nèi)脂肪細(xì)胞基因表達(dá)譜的研究中發(fā)現(xiàn)FT0基因參與肌 內(nèi)脂肪細(xì)胞脂類代謝過程，并首次從版納微型豬肌肉組織中克隆了 FT0基因。具體為
一種肌內(nèi)脂肪沉積FT0基因，是從版納微型豬肌肉組織中分離、克隆的與肌內(nèi)脂肪沉 積相關(guān)的脂肪沉積與肥胖相關(guān)(FT0)基因，基因的CDS序列全長為1518bp，其CDS核苷酸 序列如SEQ. ID. NO. 1。并且，CDS核苷酸序列編碼505個氨基酸，氨基酸序列如SEQ. ID. NO. 2。 對上述特征的肌內(nèi)脂肪沉積FT0基因設(shè)計引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，檢測FT0基因在豬心、肝、 脾、肺、腎、肌肉和脂肪七個組織的組織表達(dá)譜，結(jié)果顯示FT0基因在脂肪組織中大量表達(dá)， 初步表明FT0基因在脂肪細(xì)胞中調(diào)控脂肪沉積的功能。豬是脂肪沉積型動物，其脂肪沉積能力在不同品種之間變化很大。我國一些肉質(zhì) 優(yōu)良的地方豬種是最寶貴和稀缺的基因資源，這在優(yōu)質(zhì)豬肉的培育中有獨特的利用價值。 版納微型豬是云南省優(yōu)良的地方豬種，具有耐粗飼、適應(yīng)性強(qiáng)、肉質(zhì)優(yōu)良、肌內(nèi)脂肪豐富，肌 纖維細(xì)密，肉質(zhì)鮮嫩等優(yōu)良特性。然而，目前對版納微型豬的生長發(fā)育及肌內(nèi)脂肪沉積的分 子機(jī)制知之甚少。近年來，本發(fā)明采用基因芯片技術(shù)和生物信息學(xué)分析方法，在對豬肌肉組 織和肌內(nèi)脂肪細(xì)胞基因表達(dá)譜的研究中發(fā)現(xiàn)FT0基因參與肌內(nèi)脂肪細(xì)胞的脂類代謝過程， 并首次從版納微型豬肌肉組織中克隆了 FT0基因。因此，研究版納微型豬FT0基因的序列 與表達(dá)模式，分析其核苷酸和氨基酸序列結(jié)構(gòu)，從分子水平了解版納微型豬肌內(nèi)脂肪沉積 較多的規(guī)律，為進(jìn)一步研究該基因的功能及為改善豬胴體脂肪性狀的育種工作提供理論基 礎(chǔ)。本發(fā)明克隆得到版納微型豬FT0基因⑶S全序列，全長為1518bp，提交到 Genbank，登錄號為JQ031263。與Genbank提供的豬FT0基因相比較，發(fā)現(xiàn)有八個核苷酸突 變位點，其中六個為有義突變，導(dǎo)致六個氨基酸發(fā)生相應(yīng)變化。FT0蛋白在物種間的同源性較高，通過進(jìn)化樹可以看出，豬與牛的親緣性較近，其 次是羊、人、大鼠。豬FT0蛋白氨基酸序列與牛、羊、人和大鼠的同源性分別為91%、90%、89% 和83%。FT0蛋白在不同物種間的高度保守性提示它們功能的重要性，這些基因的保守性也 是FT0在各個物種中相應(yīng)的生理特點保持不變的分子基礎(chǔ)。另外，F(xiàn)T0在脂肪組織中的大 量表達(dá)，也證明了它在肌內(nèi)脂肪沉積等方面有重要作用。


圖1是本發(fā)明的PCR擴(kuò)增FT0基因圖示。圖2是本發(fā)明的FT0基因在不同組織中的表達(dá)水平柱圖。圖3是本發(fā)明的FT0基因酶切鑒定圖。圖4是本發(fā)明的進(jìn)化樹分析圖。圖5是本發(fā)明的FT0蛋白二級結(jié)構(gòu)預(yù)測圖。
圖6是本發(fā)明的FTO蛋白磷酸化位點預(yù)測圖。圖7是本發(fā)明的FTO蛋白糖基化位點預(yù)測圖。圖8是本發(fā)明的FTO蛋白疏水性分析圖。圖9是本發(fā)明的FTO蛋白的三級結(jié)構(gòu)模型圖。
具體實施例方式一種肌內(nèi)脂肪沉積FTO基因，是從版納微型豬肌肉組織中分離、克隆的與肌內(nèi)脂肪沉積相關(guān)的脂肪沉積與肥胖相關(guān)(Fat mass and obesity associated, FTO)基因，其特征在于基因的CDS序列全長為1518bp,其CDS核苷酸序列如SEQ. ID. NO. I。并且，CDS核苷酸序列編碼505個氨基酸，氨基酸序列如SEQ. ID. NO. 2。對上述特征的肌內(nèi)脂肪沉積FTO基因設(shè)計引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，檢測FTO基因在豬心、肝、脾、肺、腎、肌肉和脂肪七個組織的組織表達(dá)譜，結(jié)果顯示FTO基因在脂肪組織中大量表達(dá)，初步表明FTO基因在脂肪細(xì)胞中調(diào)控脂肪沉積的功能。I、肌肉組織中總RNA的提取
采取50kg成年版納微型豬肌肉組織立即放入液氮中保存?zhèn)溆?。利用RNA提取試劑提取版納微型豬肌肉組織總RNA，具體操作參照試劑盒說明進(jìn)行。將提取的RNA反轉(zhuǎn)錄成 cDNA，_20°C保存，待用。2、PCR引物設(shè)計及PCR反應(yīng)條件
根據(jù) GenBank 中豬 FTO 序列信息(GenBank 登錄號 AY448008),利用 Primer Premier 5. O設(shè)計引物，并合成。用于克隆的FTO基因的引物序列為
F :5，- ATGAAGCGAACCCCAACC -3，
R:5’ - CTAGGGTTTGGCTTCCAG -3’
用于熒光定量的FTO基因的引物序列為
F :5，- AACCGCCGAGGAACGAGA -3，
R :5，- GCTGCCACTGCTGATAGAA -3，
內(nèi)參18S rRNA的引物序列為
F :5’ -CTGCCTTCCTTGGATGTG -3’
R:5’ -GCGGCTTTGGTGACTCTA -3’
FTO基因克隆的PCR反應(yīng)條件為94°C預(yù)變性4min;94°C變性40s、55°C退火40s、 72°C延伸I. 5min 35個循環(huán)；72°C后延伸IOmin進(jìn)行擴(kuò)增，產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定其亮度和特異性。通過PCR擴(kuò)增，得到了長度為1518bp的片段。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)I. 5%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，確認(rèn)擴(kuò)增的產(chǎn)物的長度大小同于目的片段大小。熒光定量PCR的反應(yīng)條件為95°C預(yù)變性30s ;95 °C變性5 s，60°C退火30s、 72°C延伸30s，40個循環(huán)進(jìn)行擴(kuò)增。數(shù)據(jù)處理的方法為，檢測心、肝、脾、肺、腎、肌肉、脂肪七個組織中FTO基因的相對表達(dá)量，實驗數(shù)據(jù)以18S rRNA作為內(nèi)參，采用雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法處理。 結(jié)果顯示，F(xiàn)TO在被檢測的7個組織中都有表達(dá)，在肝中高量表達(dá)，在脂肪、腎、脾和肺中大量表達(dá)，在肌肉、心中少量表達(dá)。3、FTO基因的克隆及序列分析按照瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒書說明書回收特異性條帶，產(chǎn)物連接于pMD-18T載體，轉(zhuǎn)化至ToplO感受態(tài)細(xì)胞，氨芐篩選挑取陽性克隆，分別接種于IOmL LB液體培養(yǎng)基中， 37°C振蕩過夜，提取質(zhì)粒經(jīng)Ecor I和Hind III雙酶切鑒定為陽性，進(jìn)行測序。4、測序結(jié)果
所得到的版納微型豬FTO編碼區(qū)(CDS)全長1518bp，核苷酸序列如說明書核苷酸和氨基酸序列表SEQ. ID. NO. I所示，并提交到Genbank數(shù)據(jù)庫，登錄號為JQ031263。CDS序列編碼505個氨基酸，其氨基酸序列如說明書核苷酸和氨基酸序列表SEQ. ID. NO. 2所示。5、測序結(jié)果與Genbank中提供的序列比對
登錄http://www. ebi. ac. uk/Tools/clustalw2/,以版納微型豬的核苷酸序列同 GeneBank中豬FTO基因(登錄號為NM_001112692. I)的⑶S序列進(jìn)行序列比對。結(jié)果發(fā)現(xiàn)有八個突變位點，即第38位由G變?yōu)锳，163位由G變?yōu)門，213位由A變?yōu)镚，509位由C 變?yōu)門，594位由C變?yōu)镚，614位由G變?yōu)锳，，796位由A變?yōu)镚，988位由G變?yōu)锳。其中六個為有義突變，導(dǎo)致氨基酸序列發(fā)生相應(yīng)變化，即第13位氨基酸由甘氨酸G變?yōu)楣劝彼?E，55位氨基酸由甘氨酸G變?yōu)榘腚装彼酑，170位氨基酸由丙氨酸A變?yōu)槔i氨酸V，205位由絲氨酸S變?yōu)樘於０種，266位氨基酸由天冬酰胺N變?yōu)樘於彼酓，330位由丙氨酸A變?yōu)樘K氨酸T。如說明書核苷酸和氨基酸序列表。6、FTO基因核苷酸與氨基酸序列同源性分析
登錄http://www. ebi. ac. uk/Tools/clustalw2/,以版納微型豬FTO基因測序結(jié)果與牛(登錄號為BC140478. I)、人(登錄號為NM_001080432. 2)、羊(登錄號為EU072419. I)和大鼠(登錄號為BC168239. I) FTO基因的核苷酸和氨基酸序列比對分析，結(jié)果顯示版納微型豬與牛、人、羊和大鼠的FTO基因的⑶S序列同源性分別為89%、88%、88%和84% ；CDS序列所編碼氨基酸的同源性分別為91%、89%、90%和83%。如說明書核苷酸和氨基酸序列表。7、FTO基因的進(jìn)化樹分析
利用Meg4軟件的鄰近(Neighbor-joining)方法構(gòu)建版納微型豬(Genbank登錄號JQ031263)、牛(登錄號為BC140478. I)、人(登錄號為NM_001080432. 2)、羊(登錄號為 EU072419. I)和大鼠(登錄號為BC168239. I) FTO蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化樹，結(jié)果顯示版納微型豬與牛、羊的親緣性較近，其次是人、大鼠。8、FTO蛋白分子量、等電點預(yù)測分析
使用ExPASy的在線軟件Compute pi/MW分析版納微型豬FTO蛋白的等電點(pi)為 5. 18、理論分子量(pW)為 58164. 11 Da。9、FTO蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)預(yù)測分析
登陸http://bioinf. cs. ucl. ac. uk/psipred/,對版納微型豬FTO蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測，共有201個螺旋、33個伸展鏈和271個卷曲結(jié)構(gòu)。10、FTO蛋白質(zhì)磷酸化位點預(yù)測
登陸 http://www. cbs. dtu. dk/services/NetPhos/,對豬 FTO 蛋白質(zhì)憐酸化位點進(jìn)行預(yù)測，結(jié)果顯示，共有22個磷酸化位點，其中絲氨酸磷酸化位點有10個、蘇氨酸磷酸化位點有7個、酪氨酸磷酸化位點有5個。11、FTO蛋白質(zhì)糖基化位點預(yù)測
登錄 http://www. cbs. dtu. dk/services/NetNGlyc/,對版納微型豬 FTO 蛋白糖基化位點預(yù)測，結(jié)果顯示FTO蛋白在第200、246、302位有3個糖基化位點。12、FTO蛋白質(zhì)疏水性分析
登陸http://web. expasy. org/protscale/,對FTO蛋白質(zhì)疏水性進(jìn)行分析,結(jié)果顯示為未水性蛋白。13、FTO蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)的預(yù)測分析
登錄http://swissmodel. expasy. org/, Swiss-Model 軟件給出 FTO 蛋白質(zhì)可能的三級結(jié)構(gòu)模型圖。
權(quán)利要求
1.一種肌內(nèi)脂肪沉積FTO基因，是從版納微型豬肌肉組織中分離、克隆的與肌內(nèi)脂肪沉積相關(guān)的脂肪沉積與肥胖相關(guān)(fat mass and obesity associated, FTO)基因,其特征在于基因的⑶S序列全長為1518bp，其⑶S核苷酸序列如SEQ. ID. NO. 1，并且，⑶S核苷酸序列編碼505個氨基酸，氨基酸序列如SEQ. ID. NO. 2。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述一種肌內(nèi)脂肪沉積FTO基因，其特征在于對上述特征的肌內(nèi)脂肪沉積FTO基因設(shè)計引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，檢測FTO基因在豬心、肝、脾、肺、腎、肌肉和脂肪七個組織的組織表達(dá)譜，結(jié)果顯示FTO基因在脂肪組織中大量表達(dá)，初步表明FTO基因在脂肪細(xì)胞中調(diào)控脂肪沉積的功能。
全文摘要
本發(fā)明公開一種肌內(nèi)脂肪沉積FTO基因，是從版納微型豬肌肉組織中分離、克隆的與肌內(nèi)脂肪沉積相關(guān)的脂肪沉積與肥胖相關(guān)(fatmassandobesityassociated,FTO)基因，基因的CDS序列全長為1518bp,其CDS核苷酸序列如SEQ.ID.NO.1。并且，CDS核苷酸序列編碼505個氨基酸，氨基酸序列如SEQ.ID.NO.2。檢測FTO基因在豬心、肝、脾、肺、腎、肌肉和脂肪七個組織的組織表達(dá)譜，結(jié)果顯示FTO基因在脂肪組織中大量表達(dá)，初步表明FTO基因在脂肪細(xì)胞中調(diào)控脂肪沉積的功能。
文檔編號C12N15/12GK102586254SQ20111041849
公開日2012年7月18日 申請日期2011年12月15日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月15日
發(fā)明者楊明華, 潘洪彬, 王靜, 趙素梅, 高士爭, 黃英 申請人:云南農(nóng)業(yè)大學(xué)