專利名稱：：類固醇激素合成急性調(diào)節(jié)蛋白在制備防治脂肪肝藥物中的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，涉及一種膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白一類固醇激素合成急性調(diào)節(jié)蛋白的新用途，具體涉及類固醇激素合成急性調(diào)節(jié)蛋白在降低肝細(xì)胞脂肪沉積藥物中的用途。
背景技術(shù)：
：肝內(nèi)脂肪沉積是脂質(zhì)代謝紊亂引起的嚴(yán)重的并發(fā)癥，如果不能及時(shí)糾正脂質(zhì)代謝紊亂，將會(huì)進(jìn)一步發(fā)展為脂肪肝、肝臟纖維化和肝硬化等病變，嚴(yán)重影響人們的生活質(zhì)量。據(jù)有關(guān)統(tǒng)計(jì)，嚴(yán)重的高甘油三酯血癥和混合性高脂血癥的患者，其脂肪肝的發(fā)病率較正常人高5-6倍。通常，肝臟攝取游離脂肪酸后使之轉(zhuǎn)變成甘油三酯，甘油三酯再與特異的載脂蛋白結(jié)合生成極低密度脂蛋白。當(dāng)肝內(nèi)甘油三酯排泄障礙，便形成肝內(nèi)脂質(zhì)儲(chǔ)積，即臨床上常見(jiàn)的脂肪肝。目前臨床上尚無(wú)有效的針對(duì)脂肪肝的治療藥物，因此，尋找有效的干預(yù)藥物有著重要的理論意義和應(yīng)用價(jià)值。類固醇激素合成急性調(diào)節(jié)蛋白(Steroidogenicacuteregulatoryprotein,StAR)是促進(jìn)膽固醉由線粒體外膜轉(zhuǎn)入線粒體內(nèi)膜的重要轉(zhuǎn)運(yùn)體(LinD，SugawaraT，StraussJF,III,ClarkBJ,Stocco,DM,SaengerP,RogolA,MillerWL,1995，Science.267:1828-1831)。近年來(lái)有研究表明，StAR在肝細(xì)胞膽汁酸酸性合成途徑起關(guān)鍵作用，膽固醇由StAR轉(zhuǎn)運(yùn)至線粒體后，在線粒體內(nèi)膜細(xì)胞色素氧化酶(CYP27A1)的作用下生成27-羥化膽固醇等氧化固醇(oxysterol)，從而增加膽汁酸合成，加快膽固醇排泄(RenS,HylemonPB,MarquesD，GurleyE,BodhanP,HallE'RedfordK，GilG,PandakWM,2004,H印atology.40:910-917)?，F(xiàn)有技術(shù)對(duì)StAR的研究均局限于類固醇激素合成組織中，關(guān)于其在膽固醇等脂質(zhì)代謝中的作用未見(jiàn)有相關(guān)報(bào)道。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供類固醇激素合成急性調(diào)節(jié)蛋白新的藥用用途，具體涉及其在制備防治脂肪肝藥物中的用途。類固醇激素合成急性調(diào)節(jié)蛋白(StAR)是一種膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，可將膽固醇由線粒體外膜轉(zhuǎn)入線粒體內(nèi)膜，膽固醇可進(jìn)一步在線粒體內(nèi)膜細(xì)胞色素氧化酶的作用下生成調(diào)節(jié)性氧化固醇，可調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝關(guān)鍵基因的表達(dá)，維持膽固醇代謝平衡。本發(fā)明通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，證實(shí)了類固醇激素合成急性調(diào)節(jié)蛋白在小鼠肝臟內(nèi)過(guò)表達(dá)，以及進(jìn)一步產(chǎn)生的降低肝細(xì)胞中脂肪沉積的用途。本發(fā)明采用apoE基因敲除小鼠復(fù)制高血脂動(dòng)物模型，以攜帶人StAR全長(zhǎng)cDNA序列的腺病毒(Pandak醫(yī),RenS，MarquesD,HallE，RedfordK，MalloneeD，BohdanP，HeumanD,GilG，HylemonP，2002，JBiolChem.277(50):48158-48164)為載體，采用尾靜脈注射腺病毒的方法在小鼠肝臟內(nèi)過(guò)表達(dá)StAR,釆用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶法(RT—PCR)及蛋白質(zhì)免疫印跡實(shí)驗(yàn)(Westernblot)的方法證實(shí)小鼠肝臟內(nèi)StARmRNA及蛋白的過(guò)表達(dá)；采用血脂檢測(cè)試劑盒檢測(cè)肝組織中甘油三酯和膽固醇的含量；進(jìn)一步采用冰凍切片技術(shù)制備小鼠肝臟組織切片，用油紅O染色方法顯示小鼠肝臟組織中脂肪含量。結(jié)果表明，在正常飲食的情況下，24周齡的即oE基因敲除小鼠與同遺傳背景的C57BL/6J小鼠相比，血脂明顯升高；經(jīng)過(guò)尾靜脈注射腺病毒載體可以在小鼠肝臟內(nèi)過(guò)表達(dá)StAR的mRNA和蛋白；注射病毒140小時(shí)后，利用血脂檢測(cè)試劑盒顯示，注射含StAR基因病毒的小鼠肝組織中甘油三酯和膽固醇的含量較注射生理鹽水組以及注射空載體組明顯降低；并且利用油紅0對(duì)肝組織冰凍切片染色顯示其脂類物質(zhì)明顯較其它2組減少。因此證實(shí)StAR可減輕肝細(xì)胞中脂肪沉積。本發(fā)明的目的通過(guò)下述方法和步驟實(shí)現(xiàn)1、建立小鼠高血脂模型正常飲食飼喂apoE基因敲除小鼠；采用血脂檢測(cè)試劑盒檢測(cè)小鼠血脂，包括總膽固醇，甘油三酯，高密度脂蛋白膽固醇和低密度脂蛋白膽固醇。2、小鼠肝臟內(nèi)過(guò)表達(dá)StAR小鼠隨機(jī)分生理鹽水組、空載體組和過(guò)表達(dá)StAR組三組；通過(guò)尾靜脈注射腺病毒表達(dá)載體。3、小鼠肝臟內(nèi)StAR過(guò)表達(dá)的鑒定注射病毒140小時(shí)后，處死小鼠，取小鼠肝組織凍存留用；逆轉(zhuǎn)錄聚合酶法(RT-PCR)鑒定StARmRNA在肝臟內(nèi)的過(guò)表達(dá)-設(shè)計(jì)引物StAR基因的擴(kuò)增引物sense:5'-AAGAGGGCTGGAAGAAGGAG_3'antisense:5'-TCTCCTTGACATTGGGGTTC-3'產(chǎn)物片段為183bp，GAPDH基因的擴(kuò)增引物sense:5'-CCATTTGCAGTGGCAAAAG-3'antisense:5，-CACCCCATTTGATGTTAGTG-3'產(chǎn)物片段為201bp;RT-PCR實(shí)驗(yàn)；蛋白質(zhì)免疫印跡實(shí)驗(yàn)鑒定StAR蛋白在肝臟內(nèi)的過(guò)表達(dá)。4、檢測(cè)肝臟組織中的甘油三酯和膽固醇含量注射病毒140小時(shí)后，處死小鼠，各取0.2g肝組織；采用Folch法(CarlsonSE,GoldfarbS，1977，ClinicaChimicaActa.79:575-582)提取肝組織中的脂類物質(zhì)；采用血脂檢測(cè)試劑盒測(cè)定肝臟組織中甘油三酯和膽固醇的含量。5、小鼠肝臟組織中的油紅O染色小鼠肝組織的切片制備；肝組織切片的油紅O染色。本發(fā)明所采用的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和材料，其中apoE基因敲除小鼠購(gòu)自北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部，經(jīng)過(guò)基因型檢測(cè)證實(shí)apoE基因的缺失；C57BL/6J小鼠購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心；嚙齒類動(dòng)物普通飼料(復(fù)旦大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物部)；含序列1的人腎上腺1.6kbStARcDNA的腺病毒表達(dá)載體Ad-CMV-StAR，攜帶增強(qiáng)型綠色熒光蛋白腺病毒空載體Ad-CMV-EGFP,購(gòu)自北京本元正陽(yáng)基因技術(shù)股份有限公司；血脂檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海容盛生物技術(shù)有P艮公司；TrizolReagent禾口SuperscriptTMIIIFirst-StrandSynthesisSystemforRT-PCR(Invitrogen)、TaqDNAPolymerase和dNTPmix(Fermentas);兔抗大鼠StAR多克隆抗體(AbCom)、山羊抗兔HRP標(biāo)記IgG抗體(SANTACRUZ)、Proteaseinhibitorcocktailformammaliantissues(Roche)、SuperSignarWestPicoChemiluminescentSubstrate(Pierce);油紅0(Sigma公司)。本發(fā)明為尋找降低肝細(xì)胞內(nèi)脂肪沉積藥物、治療臨床上脂肪肝等脂質(zhì)代謝紊亂引起的疾病提供了依據(jù)；也為進(jìn)一步分析StAR在調(diào)節(jié)膽固醇代謝平衡中的作用機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。圖1是RT-PCR方法證實(shí)小鼠注射腺病毒后肝臟中StARmRNA的過(guò)表達(dá)圖其中，A:StAR;B:GAPDH;1:DNAladder;2:注射生理鹽水；3:注射空載體病毒；4:注射含StAR基因病毒。圖2是Westernblot方法證實(shí)小鼠注射腺病毒后肝臟中StAR蛋白的過(guò)表達(dá)圖其中，h注射生理鹽水；2:注射空載體病毒；3:注射含StAR基因病毒。圖3是三組小鼠肝組織中甘油三酯的含量其中，NS:注射生理鹽水組；Ad-CMV-EGFP:注射空病毒載體組；Ad-CMV-StAR:注射含StAR基因病毒組；**Ad-CMV-StARvs.NSgroup代O.Ol,##Ad-CMV-StARvs.Ad-CMV-EGFPgroup代O.Ol。圖4是三組小鼠肝組織中膽固醇含量其中，NS:注射生理鹽水組；Ad-CMV-EGFP:注射空病毒載體組；Ad-CMV-StAR:注射含StAR基因病毒組；**Ad-CMV-StARvs.NSgro叩代O.01，抑Ad-CMV-StARvs.Ad-CMV-EGFPgro叩代O.Ol。圖5是油紅0染色顯示肝臟切片中脂肪含量其中，h注射生理鹽水；2:注射空載體病毒；3:注射含StAR基因病毒。具體實(shí)施方式實(shí)施例l1、建立小鼠髙血脂模型小鼠喂養(yǎng)apoE基因敲除小鼠和同遺傳背景的C57BL/6J小鼠均以清潔級(jí)飼養(yǎng)于室溫22'C，相對(duì)濕度55%的動(dòng)物房，喂飼嚙齒類動(dòng)物普通飼料，自由進(jìn)食及飲水。小鼠血脂檢測(cè)1)血清的制備選取24周齡雄性apoE基因敲除小鼠和C57BL/6J各6只，實(shí)驗(yàn)前饑餓(正常飲水)12小時(shí)(晚8點(diǎn)去掉飼料，次日上午8點(diǎn)進(jìn)行實(shí)驗(yàn))，采用20%烏拉坦腹腔注射(0.5-0.7ml/100g體重)全麻，眼球取血，置于清潔離心管中，室溫靜置2小時(shí)，待血液凝固，3000rpm離心15min，取上清一20。C保存?zhèn)溆谩?)小鼠血清中血脂濃度測(cè)定，包括總膽固醇T-CHO、甘油三酯TG、低密度脂蛋白膽固醇LDL-C及高密度脂蛋白膽固醇HDL-C，取制備好的小鼠血清樣品，分別按照試劑盒說(shuō)明書檢測(cè)T一CHO，TG，LDL-C以及HDL-C的濃度。其中n=6，用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)軟件分析。2、小鼠肝臟內(nèi)過(guò)表達(dá)StAR實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選取及分組選用24周齡鄰oE基因敲除雄性小鼠34只，飼養(yǎng)于室溫25'C，相對(duì)濕度55%的清潔級(jí)動(dòng)物房，自由進(jìn)食及飲水，適應(yīng)環(huán)境2周后開(kāi)始實(shí)驗(yàn)。小鼠隨機(jī)分為生理鹽水組(NS)11只、空載體組(Ad-CMV-EGFP)11只，和過(guò)表達(dá)StAR組(Ad-CMV-StAR)12只。按常規(guī)方法，通過(guò)尾靜脈注射腺病毒表達(dá)載體；根據(jù)實(shí)驗(yàn)分組，由小鼠尾靜脈分別注射0.2ml生理鹽水、空載體病毒，約含1X101'病毒顆粒以及含StAR基因病毒，約含1X1011病毒顆粒。3、小鼠肝臟內(nèi)StAR過(guò)表達(dá)的鑒定小鼠肝臟組織提取在尾靜脈注射后140小時(shí)提取組織，實(shí)驗(yàn)前饑餓(正常飲水)12小時(shí)(晚8點(diǎn)去掉飼料，次日上午8點(diǎn)處死小鼠取組織)，采用20%烏拉坦腹腔注射(O.5-0.7ml/100g體重)全麻，無(wú)菌操作取肝臟用于抽提RNA和蛋白，一70'C保存。每只小鼠另取0.2g肝組織提取其中的脂類物質(zhì)。逆轉(zhuǎn)錄聚合酶法(RT-PCR)鑒定StARmRNA在肝臟內(nèi)的過(guò)表達(dá)1)設(shè)計(jì)引物StAR基因的擴(kuò)增引物sense:5'-AAGAGGGCTGGAAGAAGGAG-3'antisense:5，-TCTCCTTGACATTGGGGTTC-3'產(chǎn)物片段為183bp，GAPDH基因的擴(kuò)增引物sense:5'-CCATTTGCAGTGGCAAAAG-3'antisense:5'-CACCCCATTTGATGTTAGTG-3'產(chǎn)物片段為201bp;2)RT-PCR實(shí)驗(yàn)Trizol抽提肝組織總RNA，測(cè)定OD湖和OD挪值以計(jì)算純度JugRNA加oligdTlul,dNTPmixlul，用DEPC水補(bǔ)至15y1，65。C加熱5min，冰浴lmin;加入10X緩沖液2u1、25mMMgCl24ul、0.訓(xùn)TT2u1、RnaseOUT1"1、Superscript1"IIIRT1P1，混勻50。C恒溫水浴50rain，85。C5min，冰浴2min，加入RNaseH1y1，37'C孵育20min合成cDNA第一鏈。50ulPCR反應(yīng)體系，包括cDNA、StAR引物、GAPDH引物、dNTP、PCRbuffer、Taq酶、去離子水。設(shè)置PCR循環(huán)參數(shù)預(yù)變性94。C5min，變性94。C60s,復(fù)性55。C60s，延伸72。C60s，28個(gè)循環(huán)后延伸，72"C15min。瓊脂糖電泳，天能凝膠成像儀檢測(cè)結(jié)果。蛋白質(zhì)免疫印跡實(shí)驗(yàn)鑒定StAR蛋白在肝臟內(nèi)的過(guò)表達(dá)1)肝臟組織線粒體的分離及線粒體蛋白提取-①取200mg組織，加2ml線粒體提取液，于玻璃勻漿器中勻漿；②勻漿液于低溫離心機(jī)4。C600g離心15min，去除組織殘?jiān)?，轉(zhuǎn)移上清至新EP管；③4°C6500g離心20min，棄上清，沉淀用lml線粒體提取液重懸；繼續(xù)4'C6500g離心20min，棄上清，沉淀用0.5ml線粒體提取液重懸；⑤再次4°C6500g離心20min;◎小心去上清，加入20014線粒體提取液重懸沉淀；⑦移入玻璃勻漿器，上下勻漿5次；⑧用BCA法測(cè)定蛋白濃度。2)蛋白質(zhì)免疫印跡實(shí)驗(yàn)①先將樣品1,000rmp離心5min去除沉淀，用裂解緩沖液將樣品濃度調(diào)成一致，加入等體積的2x上樣緩沖液，10(TC水浴5min;②將樣品加入電泳孔槽中，空余孔槽加入等體積的lx上樣緩沖液，100V恒壓電泳至溴酚藍(lán)至凝膠底部；③先將PVDF膜在甲醇中平衡5-10min，然后將其連同Whatman3薩濾紙以及海綿墊在轉(zhuǎn)膜緩沖液中浸泡10min;電泳結(jié)束后，參考蛋白質(zhì)Markers切下目的蛋白所處凝膠區(qū)域，將其用轉(zhuǎn)膜緩沖液漂洗；在轉(zhuǎn)膜夾的負(fù)極面由下至上依次放海綿墊、3層Whatman3MM濾紙、凝膠、PVDF膜、3張Whatman3MM濾紙、海綿墊，用玻棒去除殘留于凝膠和PVDF膜之間的氣泡，然后裝好轉(zhuǎn)膜裝置，270mA恒流轉(zhuǎn)膜1.5h;⑤轉(zhuǎn)膜完畢后將轉(zhuǎn)膜裝置拆卸，將PVDF膜剪角以辯識(shí)膜的蛋白面，至封閉液在搖床上室溫封閉2h;(D用抗體稀釋液按l:1000稀釋一抗，一抗4'C孵育18h;用TBST漂洗4x10min;二抗(1:4000)室溫孵育lh，TBST漂洗4x15min;⑦將PVDF在事先混合好的ECL試劑中孵育5min，然后將PVDF膜置于顯色暗盒，進(jìn)入暗室用X光膠片曝光、顯影，調(diào)節(jié)顯、定影時(shí)間以使顯影效果最佳。4、檢測(cè)肝臟組織中甘油三酯和膽固醇含量如步驟3所述每只小鼠取0.2g小鼠肝組織備用；利用Folch法提取肝組織中的脂類物質(zhì)1)組織稱重，用氯仿甲醇(體積比2:1)勻漿肝組織；2)靜置后，吸取氯仿相；3)用氮?dú)獯蹈陕确?，加入血脂檢測(cè)試劑盒中的緩沖液以檢測(cè)其濃度。利用血脂檢測(cè)試劑盒測(cè)定肝臟組織中甘油三酯和膽固醇的含量按照試劑盒說(shuō)明書檢測(cè)肝組織中甘油三酯和膽固醇的含量，數(shù)值以每克濕重肝組織中的含量表示(mg/g.wwt)，用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)軟件分析。5、小鼠肝臟組織的油紅O染色小鼠肝組織冰凍切片的制備自尾靜脈注射病毒140小時(shí)后取肝組織行冰凍切片，實(shí)驗(yàn)前饑餓(正常飲水)12小時(shí)(晚8點(diǎn)去掉飼料，次日上午8點(diǎn)處死小鼠取組織)，采用20%烏拉坦腹腔注射(0.5-0.7ml/100g體重)全麻，0.9%的生理鹽水心內(nèi)灌注沖洗，4%多聚甲醛固定約30min，取部分肝組織，4%多聚甲醛固定過(guò)夜，梯度蔗糖溶液脫水，0CT包埋，于恒低溫冰凍切片機(jī)行連續(xù)切片，每片厚度為15wm。肝組織切片的油紅O染色1)油紅0染色液的配制于異丙醇溶液內(nèi)制備油紅0(0.25-0.5%)染色原液，臨用時(shí)于6ml染色原液內(nèi)加入4ml蒸餾水，放置5—10min，過(guò)濾使用。2)染色方法冰凍切片充分水洗；置密閉容器盛裝的油紅O染色液內(nèi)，染色10—15min;60%酒精分色至背景清晰，水洗；胞核淡染蘇木素，水洗至變藍(lán)；貼于載玻片上，甘油膠封固。3)結(jié)果脂類物質(zhì)呈鮮紅色，胞核呈藍(lán)色。結(jié)果顯示正常飲食apoE基因敲除小鼠血脂明顯高于同樣情況下的C57BL/6J小鼠。本發(fā)明選用的24周齡雄性apoE基因敲除小鼠和C57BL/6J，利用血脂檢測(cè)試劑盒檢測(cè)其血脂水平，結(jié)果顯示與C57BL/6J小鼠相比，apoE基因敲除小鼠血清中總膽固醇(T-CHO)、甘油三酯(TG)以及低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)均明顯增高，高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)則明顯降低。表l是小鼠血脂水平檢測(cè)結(jié)果，其中n-6，數(shù)數(shù)據(jù)以均數(shù)士標(biāo)準(zhǔn)差(3f土s)表示，組間差異用單因素方差分析統(tǒng)計(jì)。表l<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>其中*代0.05vs.C57BL/6J,**代0.01vs.C57BL/6J。RT-PCR結(jié)果顯示注射含StAR基因病毒后的小鼠肝臟內(nèi)StARmRNA表達(dá)較其它2組增高。本發(fā)明以逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈法在mRNA水平檢測(cè)注射病毒后，小鼠肝臟中StAR基因的表達(dá)，驗(yàn)證了通過(guò)尾靜脈注射的方法可以在肝臟內(nèi)過(guò)表達(dá)StAR基因。用GAPDH作為內(nèi)參照，結(jié)果顯示注射含StAR基因病毒后肝臟中StARmRNA量(4)明顯較其它2組(2，3)增高(圖1)。蛋白質(zhì)免疫印跡顯示注射含StAR基因病毒后的小鼠肝臟內(nèi)StAR蛋白的表達(dá)較其它2組增高。本發(fā)明以蛋白質(zhì)免疫印跡法在蛋白水平檢測(cè)注射病毒后，小鼠肝臟中StAR蛋白的表達(dá)，驗(yàn)證了通過(guò)尾靜脈注射的方法可以在肝臟內(nèi)過(guò)表達(dá)StAR蛋白。小鼠經(jīng)尾靜脈注射病毒140h后，提取肝組織線粒體蛋白質(zhì)經(jīng)蛋白質(zhì)免疫印跡實(shí)驗(yàn)檢測(cè)其中StAR蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果顯示注射含StAR基因病毒后肝臟中StAR蛋白量(3)明顯較其它2組(1，2)增高(圖2)。利用甘油三酯檢測(cè)試劑盒顯示注射含StAR基因病毒后肝臟組織中甘油三酯的含量明顯較其它2組降低。經(jīng)尾靜脈注射病毒140小時(shí)后，取小鼠肝組織，利用氯仿甲醇抽題肝臟中的脂類物質(zhì)，通過(guò)甘油三酯檢測(cè)試劑盒檢測(cè)顯示注射含StAR基因病毒的小鼠肝組織中甘油三酯的含量均較注射生理鹽水組和空載體病毒組小鼠明顯降低，其結(jié)果如表2和圖3所示，數(shù)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(i±s)表示，組間差異用單因素方差分析統(tǒng)計(jì)。表2組另ljn甘油三酯含量(mg/gwwt)膽固醇含量(mg/gwwt)NS1135.91±9.084.31±0.70Ad-CMV-EGFP1129.95±3.864.12±0.46Ad-CMV-StAR1215.56±7.22**抑3.19±0.54*柳其中**代0.01vs.NS，郎代O.Olvs.Ad-CMV-EGFP。利用膽固醇檢測(cè)試劑盒顯示注射含StAR基因病毒后肝臟組織中膽固醇的含量明顯較其它2組降低。經(jīng)尾靜脈注射病毒140小時(shí)后，取小鼠肝組織，利用氯仿甲醇抽題肝臟中的脂類物質(zhì)，通過(guò)膽固醇檢測(cè)試劑盒檢測(cè)顯示注射含StAR基因病毒的小鼠肝組織中膽固醇的含量均較注射生理鹽水組和空載體病毒組小鼠明顯降低，其結(jié)果如表2和圖4所示，數(shù)數(shù)據(jù)以均數(shù)土標(biāo)準(zhǔn)差(3f±s)表示，組間差異用單因素方差分析統(tǒng)計(jì)。油紅0染色顯示注射含StAR基因病毒的小鼠肝臟組織中脂類物質(zhì)較其它2組明顯減少。經(jīng)尾靜脈注射病毒140h后，取小鼠肝組織制備冰凍切片，用油紅O染色顯示注射含StAR基因病毒的小鼠肝組織中脂類物質(zhì)明顯較注射生理鹽水組和空載體病毒組小鼠肝組織減少，結(jié)果如圖5所示。SEQUENCELISTING<110>復(fù)旦大學(xué)<120〉類固醇激素合成急性調(diào)節(jié)蛋白在制備防治脂肪肝藥物中的用途<130>11<160>1<170>Patentlnversion3.1<210>1〈211>1605<212>PRT〈213〉人類<400>1GlyGlyGlyAlaCysThrCysAlaGlyAlaGlyGlyCysGlyAlaAla151015GlyCysThrThrGlyAlaGlyGlyGlyGlyCysThrCysAlaGlyGly202530AlaAlaGlyGlyAlaCysGlyAlaAlaGlyAlaAlaCysCysAlaCys354045CysCysThrThrGlyAlaGlyAlaGlyAlaAlaGlyAlaGlyGlyCys505560AlaGlyCysAlaGlyCysAlaGlyCysGlyGlyCysGlyGlyCysAla65707580GlyCysAlaGlyCysAlaGlyCysGlyGlyCysAlaGlyCysGlyAla859095CysCysCysCysAlaCysCysAlaCysThrGlyCysCysAlaCysAla100105110ThrThrThrGlyCysCysAlaGlyGlyAlaAlaAlaCysAlaAlaThr115120125GlyCysThrGlyCysThrAlaGlyCysGlyAlaCysAlaThrThrCys130135140AlaAlaGlyCysThrGlyThrGlyCysGlyCysThrGlyGlyGlyAla145150155160GlyCysThrCysCysThrAlaCysAlaGlyAlaCysAlaCysAlaThr165170175GlyCysGlyCysAlaAlaCysAlaThrGlyAlaAlaGlyGlyGlyGly180185190CysThrGlyAlaGlyGlyCysAlaAlaCysAlaGlyGlyCysThrGly195200205ThrGlyAlaThrGlyGlyCysCysAlaThrCysAlaGlyCysCysAla210215220GlyGlyAlaGlyCysThrGlyAlaAlaCysCysGlyGlyAlaGlyGly225230235240GlyCysCysCysThrGlyGlyGlyGlyGlyGlyCysCysCysCysAla245250255CysCysCysCysThrAlaGlyCysAlaCysGlyThrGlyGlyAlaThr260265270ThrAlaAlaCysCysAlaGlyGlyThrThrCysGlyGlyCysGlyGly275280285CysGlyGlyAlaGlyCysThrCysThrCysThrAlaCysThrCysGly290295300GlyThrThrCysThrCysGlyGlyCysThrGlyGlyAlaAlaGlyAla305310315320GlyAlaCysThrCysThrCysThrAlaCysAlaGlyThrGlyAlaCys325330335CysAlaGlyGlyAlaGlyCysThrGlyGlyCysCysThrAlaThrCys340345350ThrCysCysAlaGlyCysAlaGlyGlyGlyGlyGlyAlaGlyGlyAla355360365GlyGlyCysCysAlaThrGlyCysAlaGlyAlaAlaGlyGlyCysCys370375380ThrThrGlyGlyGlyCysAlaThrCysCysThrThrAlaGlyCysAla385390395400AlaCysCysAlaAlaGlyAlaGlyGlyGlyCysThrGlyGlyAlaAla405410415GlyAlaAlaGlyGlyAlaGlyAlaGlyThrCysAlaGlyCysAlaGly420425430GlyAlaCysAlaAlaThrGlyGlyGlyGlyAlaCysAlaAlaAlaGly435440445ThrGlyAlaThrGlyAlaGlyThrAlaAlaAlaGlyThrGlyGlyThr450455460CysCysCysAlaGlyAlaThrGlyThrGlyGlyGlyCysAlaAlaGly465470475480GlyThrGlyThrThrCysCysGlyGlyCysThrGlyGlyAlaGlyGly485490495ThrCysGlyThrGlyGlyThrGlyGlyAlaCysCysAlaGlyCysCys500505510CysAlaThrGlyGlyAlaGlyAlaGlyGlyCysThrCysThrAlaThr515520525GlyAlaAlaGlyAlaGlyCysThrCysGlyThrGlyGlyAlaGlyCys530535540GlyCysAlaThrGlyGlyAlaAlaGlyCysAlaAlaThrGlyGlyGly545550555560GlyGlyAlaGlyThrGlyGlyAlaAlaCysCysCysCysAlaAlaThr565570575GlyThrCysAlaAlaGlyGlyAlaGlyAlaThrCysAlaAlaGlyGly580585590ThrCysCysThrGlyCysAlaGlyAlaAlaGlyAlaThrCysGlyGly595600605AlaAlaAlaAlaGlyAlaThrAlaCysAlaThrThrCysAlaThrThr610615620AlaCysThrCysAlaCysGlyAlaGlyCysThrGlyGlyCysThrGly625630635640CysCysGlyAlaGlyGlyCysAlaGlyCysAlaGlyGlyAlaAlaAla645650655CysCysThrGlyGlyThrGlyGlyGlyGlyCysCysCysCysGlyThr660665670GlyAlaCysThrThrThrGlyThrGlyAlaGlyCysGlyThrGlyCys675680685GlyCysThrGlyThrGlyCysCysAlaAlaGlyCysGlyCysCysGly690695700AlaGlyGlyCysThrCysCysAlaCysCysThrGlyThrGlyThrGly705710715720CysThrGlyGlyCysThrGlyGlyCysAlaThrGlyGlyAlaCysAla725730735CysAlaGlyAlaCysThrThrCysGlyGlyGlyAlaAlaCysAlaThr740745750GlyCysCysThrGlyAlaGlyCysAlaGlyAlaAlaGlyGlyGlyThr755760765GlyThrCysAlaThrCysAlaGlyGlyGlyCysGlyGlyAlaGlyCys770775780AlaCysGlyGlyThrCysCysCysAlaCysThrThrGlyCysAlaThr785790795800GlyGlyThrGlyCysThrThrCysAlaCysCysCysGlyThrThrGly805810815GlyCysThrGlyGlyAlaAlaGlyThrCysCysCysThrCysThrAla820825830AlaGlyAlaCysCysAlaAlaAlaCysThrThrAlaCysGlyThrGly835840845GlyCysThrAlaCysThrCysAlaGlyCysAlaThrCysGlyAlaCys850855860CysThrCysAlaAlaGlyGlyGlyGlyThrGlyGlyCysThrGlyCys865870875880CysCysAlaAlaGlyAlaGlyCysAlaThrCysAlaThrCysAlaAla885890895CysCysAlaGlyGlyThrCysCysThrGlyThrCysCysCysAlaGly900905910AlaCysCysCysAlaGlyGlyThrGlyGlyAlaThrThrThrThrGly915920925CysCysAlaAlaCysCysAlaCysCysThrGlyCysGlyCysAlaAla930935940GlyCysGlyCysCysThrGlyGlyAlaGlyThrCysCysCysAlaCys945950955960CysCysThrGlyCysCysThrCysThrGlyAlaAlaGlyCysCysAla965970975GlyGlyThrGlyThrThrGlyAlaAlaGlyAlaCysCysAlaGlyCys980985990CysThrGlyCysThrGlyThrThrCysCysCysAlaAlaCysThrGly99510001005ThrGlyCysCysCysAlaGlyCysThrGlyCysAlaCysThrGly101010151020GlyThrAlaCysAlaCysAlaCysGlyCysThrCysAlaThrCys102510301035AlaGlyGlyAlaGlyAlaAlaThrCysCysCysThrAlaCysThr104010451050GlyGlyAlaAlaGlyCysCysThrGlyCysAlaAlaGlyThrCys105510601065ThrAlaAlaGlyAlaThrCysThrCysCysAlaThrCysThrGly107010751080GlyThrGlyAlaCysAlaGlyThrGlyGlyGlyAlaThrGlyGly108510901095GlyThrGlyGlyGlyGlyThrThrCysGlyThrGlyThrThrThr110011051110AlaGlyAlaGlyThrAlaThrGlyAlaCysAlaCysThrAlaGly111511201125GlyAlaThrThrCysAlaGlyAlaThrThrGlyGlyThrGlyAla113011351140AlaGlyThrThrThrThrThrAlaGlyThrAlaCysCysAlaAla114511501155GlyAlaAlaAlaAlaCysAlaGlyGlyGlyAlaThrGlyAlaGly116011651170GlyCysThrCysThrThrGlyGlyAlaThrThrAlaAlaAlaAla117511801185GlyGlyThrAlaAlaCysThrThrCysAlaThrThrCysAlaCys119011951200ThrGlyAlaThrThrAlaGlyCysThrAlaThrGlyAlaCysAla120512101215ThrGlyAlaGlyGlyGlyThrThrCysAlaGlyGlyCysCysCys122012251230CysThrAlaAlaAlaAlaThrAlaAlaThrThrGlyThrAlaAla123512401245AlaAlaCysThrThrThrThrThrThrThrCysThrGlyGlyGly125012551260CysCysCysThrThrAlaThrGlyThrAlaCysCysCysAlaCys126512701275CysThrAlaAlaAlaAlaCysCysAlaThrCysThrThrThrAla128012851290AlaAlaAlaThrGlyCysThrAlaGlyThrGlyGlyCysThrGly129513001305AlaThrAlaThrGlyGlyGlyThrGlyThrGlyGlyGlyGlyGly131013151320AlaThrGlyCysThrAlaAlaCysCysAlaCysAlaGlyGlyGly132513301335CysCysThrGlyAlaGlyAlaAlaGlyThrCysThrThrGlyCys134013451350ThrThrThrAlaThrGlyGlyGlyCysThrCysAlaAlaGlyAla135513601365AlaThrGlyCysCysAlaThrGlyCysGlyCysThrGlyGlyCys137013751380AlaGlyThrAlaCysAlaThrGlyThrGlyCysAlaCysAlaAla138513901395AlaGlyCysAlaGlyAlaAlaThrCysThrCysAlaGlyAlaGly140014051410GlyGlyThrCysThrCysCysThrGlyCysAlaGlyCysCysCys141514201425ThrCysThrGlyCysThrCysCysThrCysCysCysGlyGlyCys143014351440CysGlyCysThrGlyCysAlaCysAlaGlyCysAlaAlaCysAla144514501455CysCysAlaCysAlaGlyAlaAlaCysAlaAlaGlyCysAlaGly146014651470CysAlaCysCysCysCysAlaCysAlaGlyThrGlyGlyGlyThr147514801485GlyCysCysThrThrCysCysAlaGlyAlaAlaAlaThrAlaThr149014951500AlaGlyThrCysCysAlaAlaGlyCysThrThrThrCysThrCys150515101515ThrGlyThrGlyGlyAlaAlaAlaAlaAlaGlyAlaCysAlaAla152015251530AlaAlaCysThrCysAlaThrThrAlaGlyThrAlaGlyAlaCys153515401545AlaThrGlyThrThrThrCysCysCysThrAlaThrThrGlyCys155015551560ThrThrThrCysAlaThrAlaGlyGlyCysAlaCysCysAlaGly156515701575ThrCysAlaGlyAlaAlaThrAlaAlaAlaGlyAlaAlaThrCys158015851590AlaThrAlaAlaThrThrCysAlaCysAlaCysCys15951600160權(quán)利要求1、類固醇激素合成急性調(diào)節(jié)蛋白在制備防治脂肪肝藥物中的用途。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，其中所述的類固醇激素合成急性調(diào)節(jié)蛋白利用基因載體使其在肝臟組織中過(guò)表達(dá)。3、根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，其中所述的類固醇激素合成急性調(diào)節(jié)蛋白降低肝組織中甘油三酯和膽固醇的含量。4、根據(jù)權(quán)利要求2所述的用途，其中所述的基因載體通過(guò)靜脈導(dǎo)入肝組織。全文摘要本發(fā)明屬生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，涉及類固醇激素合成急性調(diào)節(jié)蛋白在降低肝細(xì)胞脂肪沉積藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明通過(guò)高血脂動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明，正常飲食的apoE基因敲除小鼠與同遺傳背景的C57BL/6J小鼠相比，血脂明顯升高；用于含StAR基因病毒的小鼠肝組織中甘油三酯和膽固醇的含量明顯降低，組織切片染色顯示其脂類物質(zhì)明顯減少，證實(shí)了類固醇激素合成急性調(diào)節(jié)蛋白有降低肝細(xì)胞中脂肪沉積的作用，可進(jìn)一步制備降低肝細(xì)胞內(nèi)脂肪沉積的藥物。本發(fā)明為尋找、治療臨床上脂肪肝等脂質(zhì)代謝紊亂引起的疾病提供了依據(jù)。文檔編號(hào)A61K38/17GK101134100SQ20061003074公開(kāi)日2008年3月5日申請(qǐng)日期2006年9月1日優(yōu)先權(quán)日2006年9月1日發(fā)明者任順林,寧艷霞,殷蓮華,趙鳳娣,超陸,陳思鋒申請(qǐng)人:復(fù)旦大學(xué)