專利名稱：小鏈霉菌的應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于微生物發(fā)酵領域,具體涉及小鏈霉菌(Streptomyces parvus)CGMCCN0.4027用于制備arylomycins的應用。
背景技術：
Alexandra H0ltzel等在 2002 年從 Streptomyces sp.TU6075 分離得到了兩組脂月太類化合物 arylomycins,包括 arylomycins A 和 arylomycins B (Schimana, Gebhardt etal.2002)。它們都屬于六肽化合物，含有相同肽鏈(D-Me-Ser-D-Ala-Gly-L-Me-Hpg-L-Ala-L-Tyr),不同的是，arylomycins B中的Tyr含有-NO2取代基。本發(fā)明的申請人通過自然篩選的方法獲得了一株小鏈霉菌(Streptomycesparvus)，于2010年7月20日在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心正式保藏，保藏單位地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號，保藏號為:CGMCCN0.4027。目前對其次級代謝產(chǎn)物的研究較少。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的申請人在對小鏈霉菌(Streptomyces parvus)CGMCC N0.4027的代謝產(chǎn)物的研究過程中，分離得到了兩種化合物，經(jīng)結構鑒定為arylomycin A2和arylomycin A4。因此，本發(fā)明的目的在于，提供一種小鏈霉菌(Streptomyces parvus)CGMCCN0.4027 的應用，用于通過發(fā)酵制備 arylomycin A2 和 arylomycin A4。根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選實施例，所述發(fā)酵的種子培養(yǎng)條件為:培養(yǎng)溫度為28 30°C，培養(yǎng)時間為46 50h ；種子培養(yǎng)基組成:葡萄糖2%，可溶性淀粉8%，黃豆餅粉5%，磷酸氫二鉀0.02%，pH 7.0 7.5。根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選實施例，所述發(fā)酵的搖瓶發(fā)酵條件為:發(fā)酵溫度為28 30°C，發(fā)酵時間為4 6天； 發(fā)酵培養(yǎng)基組成:黃豆餅粉2.4%，糊精3.2%，葡萄糖0.6%，磷酸氫二鉀0.02%，氯化鈉 0.15%, pH 7.0 7.5。根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選實施例，所述發(fā)酵的發(fā)酵罐發(fā)酵條件為:發(fā)酵溫度為28 30°C，發(fā)酵時間為4 6天；發(fā)酵培養(yǎng)基組成:糊精6%，黃豆餅粉2%，磷酸氫二鉀0.02%，氯化鈉0.15%, pH7.0 7.5。根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選實施例，所述arylomycin A2和arylomycin A4的制備還包括將發(fā)酵液經(jīng)大孔樹脂吸附和制備型HPLC分離的步驟。本發(fā)明的小鏈霉菌(Streptom yces parvus) CGMCC N0.4027可以發(fā)酵生產(chǎn)arylomycinA2 和 arylomycinA4,為 arylomycins 的制備開辟了一條新途徑。


圖1為arylomycins的結構示意圖。圖2為制備液相色譜圖。圖3為化合物I的高分辨質(zhì)譜圖。圖4為化合物2的高分辨質(zhì)譜圖。圖5為化合物I的氨基酸分析圖。圖6為化合物2的氨基酸分析圖。圖7為化合物I的MS /MS譜圖。圖8為化合物2的MS/MS譜圖。圖9為化合物I的氫譜圖。圖10為化合物I的碳譜圖。圖11為化合物I的二維譜譜圖，其中(a)為cosy譜圖，(b)為cbpt譜圖，(C)為HMBC譜圖，(d)為HMQC譜圖，(e)為TOCSY譜圖。圖12為化合物2的氫譜圖。圖13為化合物2的碳譜圖。
具體實施例方式以下通過具體實施例，對本發(fā)明做進一步詳細說明。應理解，以下實施例僅用于說明本發(fā)明而非用于限定本發(fā)明的范圍。本發(fā)明所用的菌種為小鏈霉菌(Streptomyces parvus),已于2010年7月20日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，保藏號CGMCC N0.4027。以下實施例中所使用的培養(yǎng)基的配方(w/v)如下:斜面培養(yǎng)基:可溶性淀粉2%，硝酸鉀0.1%，磷酸氫二鉀0.05%，氯化鈉0.05%，瓊脂 2%，pH 7.2 7.4。種子培養(yǎng)基:葡萄糖2%，可溶性淀粉8%，黃豆餅粉5%，磷酸氫二鉀0.02%，pH
7.0 7.5。搖瓶用發(fā)酵培養(yǎng)基:黃豆餅粉2.4%，糊精3.2%，葡萄糖0.6%，磷酸氫二鉀0.02%，氯化鈉 0.15%, pH 7.0 7.5。發(fā)酵罐用發(fā)酵培養(yǎng)基:糊精6%，黃豆餅粉2 %，磷酸氫二鉀0.02%,氯化鈉
0.15%, pH 7.0 7.5。以上培養(yǎng)基均以蒸餾水配制，經(jīng)121°C飽和蒸汽滅菌30min后使用。實施例1、化合物的制備1.1 發(fā)酵將小鏈霉菌(Streptomyces parvus) CGMCC N0.4027菌種從凍干管中接種到斜面培養(yǎng)基上，于28°C 30°C培養(yǎng)四天后，轉入裝有種子培養(yǎng)基的三角瓶中，置于搖床進行種子培養(yǎng)，其中，搖床轉速為200 230rpm，溫度為28 30°C，培養(yǎng)時間為46 50h。種子培養(yǎng)結束后，按4%轉種量轉入裝有發(fā)酵培養(yǎng)基的三角瓶內(nèi)，進行搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)，搖床轉速為150 300rpm，溫度28 30°C，培養(yǎng)6天后，發(fā)酵結束。經(jīng)種子培養(yǎng)后也可按4%轉種量轉入裝有發(fā)酵培養(yǎng)基的5L玻璃發(fā)酵罐內(nèi)，進行發(fā)酵，攪拌轉速為300 500rpm，溫度控制在28 30°C，通氣量為7 9L/min，培養(yǎng)4 6天
后結束發(fā)酵。1.2樣品分離純化將1.1中獲得的發(fā)酵液置于4°C冰箱中過夜，沉淀蛋白。之后將發(fā)酵液于4°C、4000rpm離心30min。棄下層沉淀，上清液用大孔吸附樹脂吸附，大孔吸附樹脂可以采用XAD-1600，SP850，或JD-1，于靜態(tài)或動態(tài)進行吸附皆可，吸附時間不少于3小時。吸附后用兩倍柱體積的純水、10 %、30 %、50 %、75 %、100 %乙醇依次洗脫，粗品集中在75 %乙醇洗脫液中。粗品液用旋轉蒸發(fā)儀于40°C減壓濃縮，再采用中壓層析系統(tǒng)進行粗制。條件如下:粗品濃縮液用45%·乙腈稀釋10倍，12000rpm離心lOmin，上清為進樣樣品。上樣量為15 25ml，采用中壓柱(型號:Biotage Si 25+M 1603-2，USA)進行分離，柱溫自然，流動相為45%乙腈500ml,等度洗脫。流速約3 5ml/min,樣品集中于300 500ml的洗脫液中。洗脫液用旋轉蒸發(fā)儀于40°C減壓濃縮后采用D10NEXP680雙元泵制備液相系統(tǒng)進行制備，收集到的制備液于40°C旋蒸濃縮至干獲得目標化合物純品。液相制備條件如下:制備柱:YMCCombiPreP ODS-A 5μπι 20X250mm柱溫:自然檢測器:DAD(210nm, 223nm, 254nm, 280nm)流速:8ml/min進樣量:60 700 μ I洗脫液配方如下:0.2% (w/v)的醋酸銨加0.12% (v/v)的冰醋酸配成pH 4.69的緩沖液，再用緩沖液與乙腈配成50% (v/v)乙腈的流動相，等度洗脫。液相制備結果如圖2所示。截取保留時間為18.3min和15.4min的物質(zhì)，分別命名為化合物1、化合物2，兩物質(zhì)均為白色粉末，易溶于甲醇、乙醇、水、乙腈。實施例2、化合物的結構鑒定將實施例1中獲得的樣品經(jīng)高分辨質(zhì)譜檢測，圖譜如圖3、圖4所示，化合物I的精確分子量為838.4603，化合物2的精確分子量為824.4437。經(jīng)Masslynx軟件中分子式的推算功能,化合物I的分子式推測為C43H62N6O11,化合物2的分子式推測為C42H6tlN6O11。結合氨基酸分析(結果如圖5、圖6所示)和MS/MS檢測(結果如圖7、圖8所示)，可知化合物I和化合物2為具有相同的肽鏈部分，差別僅在于側鏈上的亞甲基-CH2，初步判斷其氨基酸殘基含有Gly，Ala，相似的MS/MS圖譜表明兩化合物為結構同系物。綜合以上信息，以此兩個分子式在化合物庫DNP以及Scifinder中進行檢索，推斷化合物I和2分別為 Arylomycin A4 和 Arylomycin A2 物質(zhì)。進一步，結合化合物I的氫譜(圖9)、碳譜(圖10)及二維譜(圖11)、及核磁數(shù)據(jù)(表I)對其結構進行分析。表I化合物I的NMR核磁數(shù)據(jù)
權利要求
1.小鏈霉菌(Streptomycesparvus)CGMCC N0.4027的應用，其特征在于,用于通過發(fā)酵制備 arylomycins,其中，所述 arylomycins 包括 arylomycin A2 和 arylomycin A4。
2.如權利要求1所述的應用，其特征在于，所述發(fā)酵的種子培養(yǎng)條件為: 培養(yǎng)溫度為28 30°C，培養(yǎng)時間為46 50h ； 種子培養(yǎng)基組成:葡萄糖2 %，可溶性淀粉8 %，黃豆餅粉5 %，磷酸氫二鉀0.02%，pH7.0 7.5。
3.如權利要求1所述的應用，其特征在于，所述發(fā)酵的搖瓶發(fā)酵條件為: 發(fā)酵溫度為28 30°C，發(fā)酵時間為4 6天； 發(fā)酵培養(yǎng)基組成:黃豆餅粉2.4%，糊精3.2%，葡萄糖0.6%，磷酸氫二鉀0.02%，氯化鈉 0.15%, pH 7.0 7.5。
4.如權利要求1所述的應用，其特征在于，所述發(fā)酵的發(fā)酵罐發(fā)酵條件為: 發(fā)酵溫度為28 30°C，發(fā)酵時間為4 6天； 發(fā)酵培養(yǎng)基組成:糊精6%，黃豆餅粉2%，磷酸氫二鉀0.02%，氯化鈉0.15%, pH7.0 7.5。
5.如權利要求1 4中任一項所述的應用,其特征在于，所述制備arylomycins還包括將發(fā)酵液經(jīng)大孔樹脂吸附和制備型HPLC分離的步驟。
全文摘要
本發(fā)明公開了小鏈霉菌(Streptomyces parvus)CGMCC No.4027的應用，用于通過發(fā)酵制備arylomycin A2和arylomycin A4。本發(fā)明為arylomycins的制備提供了一條新途徑。
文檔編號C12P21/02GK103160556SQ20111042104
公開日2013年6月19日 申請日期2011年12月15日 優(yōu)先權日2011年12月15日
發(fā)明者饒敏, 羅敏玉, 靳旭, 阮麗軍, 戈梅, 夏興, 潘志梁, 廖靈巧 申請人:上海來益生物藥物研究開發(fā)中心有限責任公司, 浙江醫(yī)藥股份有限公司新昌制藥廠