專利名稱：一種快速檢測(cè)支原體的固體培養(yǎng)基及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種支原體培養(yǎng)基及其制備方法，特別是一種快速檢測(cè)支原體的固體培養(yǎng)基及其制備方法。
背景技術(shù)：
解脲脲原體(UU)和人型支原體(MH)引起的泌尿生殖道感染占泌尿生殖道感染的 1/3以上，解脲脲原體和人型支原體的檢測(cè)在臨床上具有重要的意義。檢測(cè)解脲脲原體和人型支原體的方法有特異性抗體檢測(cè)法、PCR法、Southern Blot法和分離培養(yǎng)法等。免疫學(xué)檢測(cè)方法容易出現(xiàn)交叉反應(yīng)，PCR法容易出現(xiàn)假陰性和假陽性，而Southern Blot法對(duì)實(shí)驗(yàn)技術(shù)要求較高，不適合在醫(yī)院內(nèi)使用。臨床上常用的檢測(cè)方法是分離培養(yǎng)法。國內(nèi)有關(guān)泌尿生殖道支原體培養(yǎng)的實(shí)際應(yīng)用和研究顯示，支原體的鑒定主要采用液體培養(yǎng)法。雖然液體培養(yǎng)法使用方便、快捷、容易判斷，但是這種方法只能從液體顏色的改變來推斷支原體是否存在，假陽性率高，準(zhǔn)確性不高。而固體培養(yǎng)法則可以通過顯微鏡觀察到人型支原體和解脲脲原體的菌落，從而確證支原體的存在，較好地解決臨床標(biāo)本假陽性率高的問題。但是固體培養(yǎng)法判讀結(jié)果的時(shí)間較長，因而需要時(shí)間較長才能對(duì)UU和MH引起的泌尿道生殖道感染進(jìn)行確診，不利于疾病的診斷和治療。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種快速檢測(cè)支原體的固體培養(yǎng)基及其制備方法。本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是一種快速檢測(cè)支原體的固體培養(yǎng)基，其配方如下
3瓊脂粉9g~12g蛋白胨18g~25gHEPES緩沖齊丨Jlg~3gL-半胱氨酸0.1g~0.5g精氨酸1.5g~2.5g脲1.5g~2.5g硫酸錳0.2g~0.5g葡萄糖lg~3g馬血清150ml~300ml抗生素400,000IU-600,OOOIU酵母提取物2. 5g~7.5g
RPMI1640細(xì)胞培養(yǎng)基 3g~5g
蒸餾水300ml~600ml。優(yōu)選地，上述培養(yǎng)基中的蛋白胨為大豆蛋白胨和酪蛋白胨。優(yōu)選地，上述培養(yǎng)基中的抗生素為兩性霉素B、多粘菌素B和青霉素鈉的混合抗生
ο優(yōu)選地，上述培養(yǎng)基還添加有磷酸二氫鉀。優(yōu)選地，上述培養(yǎng)基中磷酸二氫鉀的添加量為2g 6g/L蒸餾水。一種制備上述快速檢測(cè)支原體的固體培養(yǎng)基的方法，包括以下步驟(1)將瓊脂粉溶解于蒸餾水中，經(jīng)高壓滅菌后置于溫水中，備用；(2)將特殊胨和葡萄糖加入水中，加熱溶解后，冷卻至室溫，加入HEPES緩沖劑、 L-半胱氨酸、精氨酸、脲和RPMI1640細(xì)胞培養(yǎng)基，混勻，待溶解后，過濾雜質(zhì)；(3)將上述溶液的PH值調(diào)至6. 0 士0. 2，過濾除菌，備用；(4)將馬血清加入上述已除菌的溶液中，混勻，放入溫水中復(fù)溫；(5)將上述溶液與已滅菌的瓊脂混合，加入硫酸錳和抗生素，搖勻，傾注于無菌平皿中，待其凝固。本發(fā)明的有益效果是使用本發(fā)明的固體培養(yǎng)基可選擇性地培養(yǎng)解脲脲原體和人型支原體，通過菌落的形成確證支原體的存在，并能從菌落形態(tài)判斷支原體的類型，因此，相對(duì)于液體培養(yǎng)基常出現(xiàn)假陽性的情況，本發(fā)明的固體培養(yǎng)基在診斷泌尿生殖道感染方面的準(zhǔn)確性大大提高。使用本發(fā)明的固體培養(yǎng)基還可以通過菌落計(jì)數(shù)直接推斷出標(biāo)本中支原體的真實(shí)含量，從定量的角度準(zhǔn)確判斷出標(biāo)本是處于帶菌狀態(tài)還是已經(jīng)達(dá)到了致病濃度，而使用液體培養(yǎng)基只能定性地判斷支原體的存在，因而本發(fā)明檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性進(jìn)一步得到提高。除此以外，在支原體菌落形成時(shí)間上，目前固體培養(yǎng)基的結(jié)果判讀時(shí)間為M小時(shí)，而使用本發(fā)明的支原體培養(yǎng)基判讀結(jié)果只需要18小時(shí)，大大縮短了檢測(cè)時(shí)間，實(shí)現(xiàn)了解脲脲原體和人型支原體的快速檢測(cè)，并且所形成的菌落比在市售培養(yǎng)基上形成的菌落要大得多，為醫(yī)生制訂合理的治療方案提供了快速可靠的檢驗(yàn)結(jié)果。


圖1是解脲脲原體在本發(fā)明固體培養(yǎng)基培養(yǎng)上形成的菌落(放大400倍)；圖2是人型支原體在本發(fā)明固體培養(yǎng)基上形成的菌落(放大400倍)；圖3是解脲脲原體和人型支原體在本發(fā)明固體培養(yǎng)基上形成的菌落(放大400 倍)；圖4是實(shí)施例5中解脲脲原體在市售培養(yǎng)基上形成的菌落(放大400倍)。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明提供了一種支原體培養(yǎng)基及其制備方法，該培養(yǎng)基能夠快速、準(zhǔn)確地檢測(cè)出解脲脲原體和人型支原體。一種快速檢測(cè)支原體的固體培養(yǎng)基，其配方如下
5瓊脂粉9g~12g蛋白胨18g~25gHEPES緩沖齊丨Jlg~3gL-半胱氨酸0.1g~0.5g精氨酸1.5g~2.5g脲1.5g~2.5g硫酸錳0.2g~0.5g葡萄糖lg~3g馬血清150ml~300ml抗生素400,OOOIU 600,OOOIU
酵母提取物 2.5g-7Jg RPMI1640細(xì)胞培養(yǎng)基 3g~5g
蒸餾水300ml~600ml優(yōu)選地，該培養(yǎng)基中的蛋白胨為大豆蛋白胨和酪蛋白胨。優(yōu)選地，該培養(yǎng)基中的抗生素為兩性霉素B、多粘菌素B和青霉素鈉的混合抗生
ο優(yōu)選地，該培養(yǎng)基還添加有磷酸二氫鉀。優(yōu)選地，該培養(yǎng)基中磷酸二氫鉀的添加量為2g 6g/L蒸餾水。國內(nèi)常用的檢測(cè)支原體的方法為液體培養(yǎng)，只能從液體顏色的改變來推斷支原體存在與否，假陽性率高，準(zhǔn)確性不高。本發(fā)明支原體固體培養(yǎng)基能選擇性地培養(yǎng)解脲脲原體和人型支原體，用于診斷泌尿生殖道感染，準(zhǔn)確性高。通過顯微鏡可以觀察到固體培養(yǎng)基上解脲脲原體的棕黑色海膽狀菌落(如圖1所示)和人型支原體的煎蛋狀菌落(如圖2所示)，從而確證支原體的存在。另外，該培養(yǎng)基含有豐富的營養(yǎng)物質(zhì)、混合抗生素和顯色劑。 解脲脲原體會(huì)令培養(yǎng)基內(nèi)的硫酸錳氧化，從而使其菌落顏色變成咖啡至黑色；而人型支原體則不會(huì)使硫酸錳氧化，因而其菌落不顯色。通過菌落形態(tài)和顏色的不同(如圖3所示)， 可以準(zhǔn)確清晰地鑒別支原體類型。同時(shí)，通過菌落計(jì)數(shù)可以推斷出標(biāo)本中支原體的真實(shí)含量(CFU)，準(zhǔn)確判斷標(biāo)本是帶菌狀態(tài)還是已達(dá)到了致病濃度。該培養(yǎng)基解決了臨床標(biāo)本假陽性率高的問題，也從以前的定性檢測(cè)升級(jí)成為定量檢測(cè)。同時(shí)，檢測(cè)時(shí)間也大大縮短，一般來說，使用固體培養(yǎng)基的判讀時(shí)間為M小時(shí)，而使用本發(fā)明的支原體培養(yǎng)基判讀結(jié)果只需要18小時(shí)。因此，本發(fā)明的固體培養(yǎng)基具有快速檢測(cè)和結(jié)果準(zhǔn)確可靠的特點(diǎn)。
一種制備上述快速檢測(cè)支原體的固體培養(yǎng)基的方法，包括以下步驟(1)將瓊脂粉溶解于蒸餾水中，經(jīng)高壓滅菌后置于溫水中，備用；(2)將蛋白胨和葡萄糖加入營養(yǎng)液中，加熱溶解后，冷卻至室溫，加入HEPES緩沖劑、L-半胱氨酸、精氨酸、脲和RPMI1640細(xì)胞培養(yǎng)基，混勻，待溶解后，過濾雜質(zhì)；(3)將上述溶液的PH值調(diào)至6. 0 士0. 2，過濾除菌，備用；(4)將馬血清加入上述已除菌的溶液中，混勻，放入溫水中復(fù)溫；(5)將上述溶液與已滅菌的瓊脂混合，加入硫酸錳和抗生素，搖勻，傾注于無菌平皿中，待其凝固。以下結(jié)合實(shí)施例進(jìn)一步說明本發(fā)明實(shí)施例1一種快速檢測(cè)支原體的固體培養(yǎng)基，其組分如下
瓊脂粉IOg
蛋白胨(含大豆蛋白胨、酪蛋白胨)21g
磷酸二氫鉀 2g
HEPES緩沖劑祁
L-半胱氨酸 0.2g
精氨酸祁
脲招
硫酸錳04g
葡萄糖祁
馬血清200ml
混合抗生素(兩性霉素B、多粘菌素B、青霉素鈉) 500,000IU 酵母提取物 2.5g RPMI1640細(xì)胞培養(yǎng)基 4g 蒸餾水500ml。實(shí)施例2一種快速檢測(cè)支原體的固體培養(yǎng)基，其組分如下瓊脂粉9g
蛋白胨(含大豆蛋白胨、酪蛋白胨)18g
HEPES緩沖劑 Ig
L-半胱氨酸 O.lg
精氨酸1.5g
脲1.5g
硫酸錳0.2g
葡萄糖Ig
馬血清150ml
混合抗生素(兩性霉素B、多粘菌素B、青霉素鈉) 400,000IU 酵母提取物 2.5g RPMI1640細(xì)胞培養(yǎng)基 3g
蒸餾水300ml。實(shí)施例3一種快速檢測(cè)支原體的固體培養(yǎng)基，其組分如下
瓊脂粉1
蛋白胨(含大豆蛋白胨、酪蛋白胨)25g
磷酸二氫鉀 2.5g HEPES緩沖劑相L-半胱氨酸 0.5g 精氨酸2.5g
脲
硫酸錳0.
葡萄糖相
馬血清300ml
混合抗生素(兩性霉素B、多粘菌素B、青霉素鈉) 600,000IU 酵母提取物 7. RPMI1640細(xì)胞培養(yǎng)基 5g
蒸餾水600ml。實(shí)施例4一種制備實(shí)施例1的固體培養(yǎng)基的方法，包括以下步驟(1)將瓊脂粉溶解于蒸餾水中，經(jīng)高壓蒸汽121°C滅菌15min，降溫后保持在50°C 的溫水中，備用；(2)將蛋白胨、葡萄糖和磷酸二氫鉀加入水中，加熱溶解后，冷卻至室溫，加入 HEPES緩沖劑、L-半胱氨酸、精氨酸、脲和RPMI1640細(xì)胞培養(yǎng)基，混勻，待溶解后，用濾紙過濾雜質(zhì)；(3)將上述溶液的PH值調(diào)至6. 0，經(jīng)0. 22 μ m過濾除菌，備用；(4)在無菌操作條件下將血清加入上述已除菌的溶液中，混勻，放入50°C的溫水中復(fù)溫；(5)待溶液復(fù)溫至50°C后，將所述溶液與已滅菌的瓊脂在無菌條件下混合在一起，加入硫酸錳和混合抗生素，搖勻，傾注于無菌平皿中，待其凝固；(6)凝固后放置4°C冷藏保存?zhèn)溆谩?shí)施例5將相同濃度的陽性標(biāo)本接種在實(shí)施例4中制得的固體培養(yǎng)基和市售培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)和觀察，結(jié)果如下表所示
權(quán)利要求
1. 一種快速檢測(cè)支原體的固體培養(yǎng)基，其特征在于其配方如下瓊脂粉9g~12g蛋白胨18g~25gHEPES緩沖齊丨Jlg~3gL-半胱氨酸0.1g~0.5g精氨酸1.5g~2.5g脲1.5g~2.5g硫酸錳0.2g~0.5g葡萄糖lg~3g馬血清150ml~300ml抗生素400,000IU-600,OOOIU酵母提取物2.5g~7.5gRPMI1640細(xì)胞培養(yǎng)基 3g~5g蒸餾水300ml~600ml。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種快速檢測(cè)支原體的固體培養(yǎng)基，其特征在于所述蛋白胨為大豆蛋白胨和酪蛋白胨。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種快速檢測(cè)支原體的固體培養(yǎng)基，其特征在于所述抗生素為兩性霉素B、多粘菌素B和青霉素鈉的混合抗生素。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種快速檢測(cè)支原體的固體培養(yǎng)基，其特征在于所述培養(yǎng)基還添加有磷酸二氫鉀。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種快速檢測(cè)支原體的固體培養(yǎng)基，其特征在于所述磷酸二氫鉀的添加量為2g 6g/L蒸餾水。
6.一種制備權(quán)利要求1快速檢測(cè)支原體的固體培養(yǎng)基的方法，包括以下步驟(1)將瓊脂粉溶解于蒸餾水中，經(jīng)高壓滅菌后置于溫水中，備用；(2)將蛋白胨和葡萄糖加入水中，加熱溶解后，冷卻至室溫，加入HEPES緩沖劑、L-半胱氨酸、精氨酸、脲和RPMI1640細(xì)胞培養(yǎng)基，混勻，待溶解后，過濾雜質(zhì)；(3)將上述溶液的PH值調(diào)至6.0士0.2，過濾除菌，備用；(4)將馬血清加入上述已除菌的溶液中，混勻，放入溫水中復(fù)溫；(5)將上述溶液與已滅菌的瓊脂混合，加入硫酸錳和抗生素，搖勻，傾注于無菌平皿中， 待其凝固。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種快速檢測(cè)支原體的固體培養(yǎng)基及其制備方法。使用本發(fā)明的固體培養(yǎng)基能夠準(zhǔn)確地檢測(cè)解脲脲原體和人型支原體的存在，并通過菌落計(jì)數(shù)定量推斷支原體的含量，大大提高了準(zhǔn)確度和可靠性。同時(shí)，使用本發(fā)明的培養(yǎng)基檢測(cè)支原體僅需18h即可判讀結(jié)果，實(shí)現(xiàn)了支原體檢測(cè)的快速化，對(duì)解脲脲原體和人型支原體引起的泌尿生殖道感染進(jìn)行最終確診。
文檔編號(hào)C12Q1/04GK102409076SQ20111042907
公開日2012年4月11日 申請(qǐng)日期2011年12月16日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月16日
發(fā)明者王立超 申請(qǐng)人:江門市凱林貿(mào)易有限公司