專利名稱：一株具有高產(chǎn)γ-氨基丁酸能力的菌株的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一株具有產(chǎn)Y-氨基丁酸能力的菌株。
背景技術(shù)：
乳酸菌指發(fā)酵糖類主要產(chǎn)物為乳酸的一類無芽孢、革蘭氏染色陽性細菌的總稱。 絕大部分乳酸菌都是人體內(nèi)必不可少的且具有重要生理功能的菌群，其廣泛存在于人體的腸道中。目前已被國內(nèi)外生物學(xué)家所證實，腸內(nèi)乳酸菌與健康長壽有著非常密切的直接關(guān)系。植物乳桿菌是乳酸菌的一種，屬于乳桿菌屬，有很強的發(fā)酵碳水化合物的能力，較耐鹽，與其它乳酸菌有協(xié)同作用，具有免疫調(diào)節(jié)、拮抗致病菌、抗突變和防癌等益生性質(zhì)，其代謝產(chǎn)生的有機酸、過氧化氫、雙乙酰、細菌素等物質(zhì)能夠抑制病原菌的生長和粘附，調(diào)節(jié)宿主腸道、陰道、尿道的微生態(tài)平衡、預(yù)防和治療由于微生態(tài)失衡而造成的腹瀉、感染；植物乳桿菌是厭氧細菌(兼性好氧)，能夠降低血清膽固醇。在繁殖過程中能產(chǎn)出特有的乳酸桿菌素，乳酸桿菌素是一種生物型的防腐劑。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一株具有高產(chǎn)Y-氨基丁酸(GABA)能力的菌株。一株具有高產(chǎn)Y-氨基丁酸能力的菌株，它為植物乳桿菌(LactcAacillus ρlantarum)NDC 75017，屬于乳桿菌屬(LactcAacillus)，已在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，保藏地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，保藏編號為 CGMCC NO :5448，保藏日期為2011年11月08日；它為革蘭氏陽性菌，呈短桿狀、兩端呈圓形，長為1. 0 μ m 1. 7 μ m，寬為0. 4 μ m 0. 9 μ m，無芽孢，無鞭毛；在MRS培養(yǎng)基上形成白色的圓形菌落、直徑為0. 5 2mm、菌落邊緣整齊、細致有光澤、中央有凸起。本發(fā)明中一株具有高產(chǎn)Y-氨基丁酸能力的菌株，它為植物乳桿菌 (Lactobacillus ρ lantarum) NDC 75017，該菌株能夠利用核糖、半乳糖、葡萄糖、果糖、甘露糖、甘露醇、α -甲基-D-甘露糖甙、N-乙酰-葡糖胺、苦杏仁甙、熊果甙、七葉靈、柳醇、纖維二糖、麥芽糖、乳糖、蜜二糖、蔗糖、海藻糖、松叁糖、棉子糖、攏牛兒糖、D-阿拉伯糖醇和葡萄糖酸鹽發(fā)酵產(chǎn)酸；該菌株不能利用甘油、赤癬醇、D-阿拉伯糖、L-阿拉伯糖、D-木糖、 L-木糖、阿東醇、β -甲基-D-木糖甙半乳糖、山梨糖、鼠李糖、衛(wèi)茅醇、肌醇、山梨醇、α -甲基-D-甘露糖甙、菊糖、淀粉、糖原、木糖醇、D-來蘇糖、D-塔格糖、D-巖糖、L-巖糖、L-阿拉伯糖醇、2-酮基-葡萄糖酸鹽和5-酮基-葡萄糖酸鹽發(fā)酵產(chǎn)酸；該菌株過氧化氫酶實驗呈陰性、明膠液化實驗呈陰性、硝酸鹽還原實驗呈陰性、硫化氫實驗呈陰性、吲哚實驗呈陰性、 動力實驗為不運動；該菌株的最適生長溫度為30 35°C，10°C能生長，45°C不生長，生長ρΗ 為4. 5 9. 5，最適合生長ρΗ為5. 8。本發(fā)明中一株具有高產(chǎn)Y-氨基丁酸能力的菌株，它為植物乳桿菌 (Lactobacillus ρ lantarum) NDC 75017，經(jīng) 16S rDNA 序列測序，結(jié)果在 NCBI 上進行同源個生比罾，Iiftt NDC 75017 % Lactobacillus ρlantarum JDMU Lactobacillus ρlantarum subsp. plantarum ST-II I、Lactobacillus ρ lantarum WCFSl 的親緣關(guān)系最近，同源性達 99.8%。經(jīng)IGS(intergenic spacer)序列測序，將IGS測序結(jié)果的785個堿基在NCBI 上進行同源性比較，菌株 NDC75017 與 Lactobacillus plantarum WCFSU Lactobacillus plantarum subsp. plantarum ST-III 的親緣關(guān)系最近，同源性達 99. 5%。本發(fā)明中一株具有高產(chǎn)Y-氨基丁酸能力的菌株，它為植物乳桿菌 (Lactobacillus plantarum)NDC 75017，屬于乳桿菌屬(Lactobacillus)，已在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，保藏地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號， 保藏編號為CGMCC NO :5448，保藏日期為2011年11月08日。本發(fā)明中一株具有高產(chǎn)Y-氨基丁酸能力的菌株，它為植物乳桿菌 (Lactobacillus plantarum)NDC 75017，該菌具有高產(chǎn)Y -氨基丁酸的能力，經(jīng)高效液相色譜檢測其產(chǎn)量高達138mg/L ； γ -氨基丁酸是一種重要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，它參與多種代謝活動，具有很高的生理活性，已報道的生理活性有調(diào)節(jié)血壓、促使精神安定、促進腦部血流、增進腦活力、營養(yǎng)神經(jīng)細胞、增加生長激素分泌、健肝利腎、預(yù)防肥胖、促進乙醇代謝 (醒酒)、改善更年期綜合癥等多種功效，也可與各種各樣的食品組合，制造成各種各樣富含Y-氨基丁酸的功能食品。


圖1為具體實施方式
一中植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)NDC 個菌的電鏡圖；圖2為具體實施方式
一中植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)NDC 個菌的電鏡圖；圖3為具體實施方式
一中植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)NDC 16SrDNA的系統(tǒng)發(fā)育樹；圖4為具體實施方式
一中植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)NDC IGS的系統(tǒng)發(fā)育樹。
具體實施例方式具體實施方式
一本實施方式一株具有高產(chǎn)Y-氨基丁酸能力的菌株，它為植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum) NDC 75017，屬于乳桿菌屬(Lactobacillus)，已在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，保藏地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，保藏編號為CGMCC N0:5448，保藏日期為2011年11月08日；它為革蘭氏陽性菌， 呈短桿狀、兩端呈圓形，長為1. 0 μ m 1. 7 μ m，寬為0. 4 μ m 0. 9 μ m，無芽孢，無鞭毛；在 MRS培養(yǎng)基上形成白色的圓形菌落、直徑為0. 5 2mm、菌落邊緣整齊、細致有光澤、中央有凸起。本實施方式中植物乳桿菌(LactcAacillus plantarum)NDC 75017的最適生長溫度為30 35°C，10°C能生長，45°C不生長，生長pH為4. 5 9. 5，最適合生長pH為5. 8。本實施方式一株具有高產(chǎn)Y -氨基丁酸能力的菌株，它從內(nèi)蒙古傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品中分離得到，篩選方法按以下步驟實現(xiàn)
75017 單 75017 多 75017 的 75017 的
4
一、樣品的采集采集樣品時雙手戴上無菌的一次性乳膠手套，用一次性無菌注射器吸取內(nèi)蒙古通遼地區(qū)牧民家庭中自制的傳統(tǒng)酸奶樣品，放入事先已經(jīng)滅菌的器皿中，用記號筆在器皿上標注樣品編號并封好放入冰盒內(nèi)，將冰盒放入含有冰袋的保溫箱；測定采集樣品的PH值與溫度，并記錄采集地點到調(diào)查采樣表中，同時用相機采集樣品的圖片資料；采集后的樣品帶回實驗室于4°C冰箱中保存?zhèn)溆谩６?、乳酸菌的分離與純化用滅菌移液器取ImL酸奶樣品，接種于滅菌的生理鹽水中，進行梯度稀釋；在滅菌培養(yǎng)皿中倒入滅菌、冷卻至50°C的含有0. 75% CaCO3的MRS固體培養(yǎng)基，冷卻至凝固后，將稀釋的樣品接入MRS固體培養(yǎng)基中，放入恒溫厭氧培養(yǎng)箱，37°C培養(yǎng)48 72h。觀察并記錄菌落特征。從平板上長出的菌落中挑選出周圍形成透明圈的單個菌落，進行革蘭氏染色，將 G+菌株繼續(xù)劃線于MRS固體培養(yǎng)基，直至確定為純菌；將純化的菌株再進行革蘭氏染色并做H2A酶試驗，凡革蘭氏染色陽性、H2O2酶試驗陰性的菌株可初步確定為乳酸菌；三、乳酸菌分離株的保存將純化菌株接種到MRS斜面培養(yǎng)基中，經(jīng)培養(yǎng)后置4°C冰箱中保存?zhèn)溆茫瑫r將分離菌株的純培養(yǎng)物接種于MRS液體培養(yǎng)基中，37°C厭氧培養(yǎng)16h，連續(xù)傳代培養(yǎng)3次，將培養(yǎng)液與30%滅菌甘油以1 1的比例混合均勻，置于-80°C冰箱冷凍保存；其中所述MRS固體培養(yǎng)基(IOOOmL)由5g的蛋白胨、5g的牛肉膏、5g的酵母粉和 IOg的胰蛋白胨、1. OmL的Tween-80、20g的葡萄糖、各10毫升的5種鹽溶液和余量的蒸餾水組成，調(diào)PH至5. 8，121°C高壓滅菌15min ；其中5種鹽溶液:20g K2HPO4 · 3H20+IOOmL蒸餾水，20g檸檬酸氫二銨+IOOmL蒸餾水，50g乙酸鈉+IOOmL蒸餾水，5. 8gMgS04 ·7Η20+IOOmL 蒸餾水，2. 5g MnSO4 · H2O+IOOmL 蒸餾水。本實施方式篩選所得菌的電鏡圖見圖1和2。對篩選所得菌進行生理生化試驗依據(jù)《伯杰氏細菌學(xué)鑒定手冊》(第八版)和《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》對其進行常規(guī)生理生化鑒定，實驗結(jié)果為該菌株能夠利用核糖、半乳糖、葡萄糖、果糖、甘露糖、甘露醇、α -甲基-D-甘露糖甙、N-乙酰-葡糖胺、苦杏仁甙、熊果甙、七葉靈、柳醇、纖維二糖、麥芽糖、乳糖、蜜二糖、蔗糖、海藻糖、松叁糖、棉子糖、攏牛兒糖、D-阿拉伯糖醇和葡萄糖酸鹽發(fā)酵產(chǎn)酸；該菌株不能利用甘油、赤癬醇、D-阿拉伯糖、L-阿拉伯糖、D-木糖、L-木糖、阿東醇、β -甲基-D-木糖甙半乳糖、山梨糖、鼠李糖、衛(wèi)茅醇、肌醇、山梨醇、α -甲基-D-甘露糖甙、菊糖、淀粉、糖原、木糖醇、D-來蘇糖、D-塔格糖、D-巖糖、L-巖糖、L-阿拉伯糖醇、2-酮基-葡萄糖酸鹽和5-酮基-葡萄糖酸鹽發(fā)酵產(chǎn)酸；該菌株過氧化氫酶實驗呈陰性、明膠液化實驗呈陰性、硝酸鹽還原實驗呈陰性、硫化氫實驗呈陰性、吲哚實驗呈陰性、動力實驗為不運動。分子生物學(xué)鑒定對篩選所得菌經(jīng)16S rDNA序列測序，結(jié)果在NCBI上進行同源性比較，菌 ^ NDC75017 與 Lactobacillus ρlantarum JDM1> Lactobacillus ρlantarum subsp. ρ lantarum ST-III, Lactobacillus ρ lantarum WCFSl 的親緣關(guān)系最近，同源性達 99. 8%
5(如圖3所示)。經(jīng)IGS(intergenic spacer)序列測序，將IGS測序結(jié)果的785個堿基在 NCBI 上進行同源性比較，菌株 NDC 75017 與 Lactobacillus ρlantarum WCFSU Lactobacillus ρ lantarum subsp. plantarum ST-III 的親緣關(guān)系最近，同源性達 99. 5 % (如圖4所示)。結(jié)合菌株NDC 75017形態(tài)學(xué)觀察、生理生化試驗鑒定結(jié)果，確定菌株NDC 75017為乳桿菌屬(Lactobacillus)的一個新菌株，命名為植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)NDC 75017。 本實施方式篩選所得植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)NDC 75017，通過高效液相色譜檢測對其進行產(chǎn)Y-氨基丁酸的能力的測試，結(jié)果為138mg/L。
權(quán)利要求
1. 一株具有高產(chǎn)Y-氨基丁酸能力的菌株，其特征在于它為植物乳桿菌 (Lactobacillus plantarum)NDC 75017，屬于乳桿菌屬(Lactobacillus)，已在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，保藏地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號， 保藏編號為CGMCC NO :5448，保藏日期為2011年11月08日。
全文摘要
一株具有高產(chǎn)γ-氨基丁酸能力的菌株，它涉及具有產(chǎn)γ-氨基丁酸能力的菌株。它為植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)NDC 75017，屬于乳桿菌屬，已在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，保藏地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，保藏編號為CGMCC NO5448，保藏日期為2011年11月08日。本發(fā)明中菌株NDC 75017具有高產(chǎn)γ-氨基丁酸的能力，經(jīng)高效液相色譜檢測其產(chǎn)量高達138mg/L；γ-氨基丁酸是一種重要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，具有很高的生理活性，有調(diào)節(jié)血壓、促使精神安定、促進腦部血流、營養(yǎng)神經(jīng)細胞、增加生長激素分泌、改善更年期綜合癥等多種功效。
文檔編號C12R1/25GK102424807SQ20111043969
公開日2012年4月25日 申請日期2011年12月23日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月23日
發(fā)明者單藝, 周艷秋, 姜毓君, 張光輝, 楊士芹, 滿朝新, 王今雨, 董鑫悅, 薛玉清, 遲濤, 郎友, 郭穎 申請人:黑龍江省乳品工業(yè)技術(shù)開發(fā)中心