專利名稱：新生大鼠嗅球嗅鞘細胞的分離方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種新生大鼠嗅球鞘細胞的分離方法，其應(yīng)用于嗅球鞘細胞的純化過程。
背景技術(shù)：
近年來嗅鞘細胞(olfactory ensheat hing cells，OECs)已成為脊髓損傷 (spinal cord injury，SCI)修復(fù)理論及應(yīng)用基礎(chǔ)研究領(lǐng)域的熱點，被認為是在組織細胞移植修復(fù)SCI研究中極具應(yīng)用前景的移植材料。0 ECs作為移植材料，其需求量大，純度、活性要求高，因此必須通過體外培養(yǎng)、純化獲得。用于0 ECs純化細胞的方法較多，各有優(yōu)缺點， 在OECs細胞移植修復(fù)SCI的研究中，究竟采取何種純化方法目前尚無定論，同時關(guān)于純化效率比較的研究文獻不多。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明探討新生大鼠嗅球嗅鞘細胞(OECs)的分離方法，其應(yīng)用于嗅球嗅鞘細胞的體外培養(yǎng)和純化過程，以為研究脊髓損傷后神經(jīng)再生獲得豐富OECs來源奠定基礎(chǔ)。所述的新生大鼠嗅球嗅鞘細胞(0 ECs)的純化方法如下Sl :0ECs的取材選用新生1 2d的SD大鼠12只，用75%的酒精搽洗口鼻，浸入 75%的酒精中aiiin以消毒皮膚，在超凈臺內(nèi)顯露兩側(cè)嗅球，并將之取下(盡量保持其完整性)，置于盛有PBS平衡鹽溶液的4°C冰浴的培養(yǎng)皿中，在手術(shù)顯微鏡下用顯微外科剪仔細去除嗅球表面的毛細血管和軟腦膜。S2 =OECs的分離將位于嗅球最外層的嗅神經(jīng)層的嗅小球?qū)右约吧倭窟B接的嗅神經(jīng)輕輕剝下，用PBS液沖洗2遍，剪碎組織塊，用濃度為0. 125%的胰蛋白酶消化液在37°C 下消化15min，經(jīng)胰酶消化的組織小塊移入生長培養(yǎng)液(20%小牛血清的DM EM/F212)中， 靜置lOmin，以中和胰酶作用。離心(800r/min，3min)去除上清液，吸取管底的組織小塊，生長培養(yǎng)液清洗2次(動作要輕，盡量不使粘連的組織小塊分開)。將組織小塊移入2ml的生長培養(yǎng)液中，再用火焰拋光后的Pasteur移液管反復(fù)吹打組織塊15 20次，使之形成細胞懸液。取一滴細胞懸液滴于細胞計數(shù)板計數(shù)，用生長培養(yǎng)液調(diào)整細胞濃度為5X105/ml。S3 三種OECs純化方法的比較研究12只大鼠取材后均分為正常對照組、免疫吸附組、化學(xué)藥物組和差速貼壁組。S4 形態(tài)學(xué)觀察將不同培養(yǎng)時間的OECs于倒置相差顯微鏡(Olympus CK40型) 下進行形態(tài)觀察，觀察其形態(tài)及結(jié)構(gòu)的變化，并進行比較。S5 =OECs純度檢測各組OECs培養(yǎng)14d后進行的純度檢測。采用GFAP免疫酶細胞染色DAB顯色，蘇木素復(fù)染，倒置顯微鏡下觀察，隨機選10個視野(0. 45mm2)并計數(shù)GFA P陽性細胞的百分率。本發(fā)明通過不同的的新生大鼠嗅球嗅鞘細胞(OECs)的純化方法實驗，結(jié)果顯示體外培養(yǎng)的新生大鼠嗅球OECs主要為雙極或三級細胞，其突起細長。未經(jīng)純化的OECs則成纖維細胞生長迅速而占優(yōu)勢，三種純化方法均能使接種14d后的OECs純度均值大于75%。 P75抗體吸附法和阿糖胞苷抑制法的純化率均值略高于差速貼壁法。故新生大鼠嗅球OECS 的原代培養(yǎng)中細胞純化是必要的；在脊髓損傷再生研究中，較之P75抗體吸附法和阿糖胞苷抑制法，差速貼壁法是一種簡單、經(jīng)濟、實用的OECs純化方法。


通過下面結(jié)合附圖的詳細描述，本發(fā)明前述的和其他的目的、特征和優(yōu)點將變得顯而易見。其中圖1所示為本發(fā)明的新生大鼠嗅球嗅鞘細胞(OECs)的純化方法的一個實施例的步驟流程圖；圖2所示為本發(fā)明的新生大鼠嗅球嗅鞘細胞(OECs)的分離方法的步驟流程圖。
具體實施例方式如圖1所示的本發(fā)明的新生大鼠嗅球嗅鞘細胞(OECs)的純化方法的一個實施例的步驟流程圖，所述實施例中所使用的材料如下新生1 2d的SD大鼠，購于蘇州大學(xué)醫(yī)學(xué)院實驗動物中心；DM EM/F212培養(yǎng)基購于In2vit rogen公司，胰蛋白酶、i^rskolin、牛垂體提取液(B PE)、阿糖胞苷(Ara C)、 多聚賴氨酸購于Sigma公司，小牛血清購于杭州四季青公司。膠質(zhì)原纖維酸性蛋白GFA P 抗體、低親和性神經(jīng)營養(yǎng)因子受體P75抗體、生物素化山羊抗兔IgG，偶聯(lián)辣根過氧化物酶 (HRP)的SABC購于武漢博士德公司。所述的新生大鼠嗅球嗅鞘細胞(OECs)的純化方法如下Sl :0ECs的取材選用新生1 2d的SD大鼠12只，用75%的酒精搽洗口鼻，浸入 75%的酒精中aiiin以消毒皮膚，在超凈臺內(nèi)顯露兩側(cè)嗅球，并將之取下(盡量保持其完整性)，置于盛有PBS平衡鹽溶液的4°C冰浴的培養(yǎng)皿中，在手術(shù)顯微鏡下用顯微外科剪仔細去除嗅球表面的毛細血管和軟腦膜。S2 :0ECs的分離(步驟如圖2所示)將位于嗅球最外層的嗅神經(jīng)層的嗅小球?qū)右约吧倭窟B接的嗅神經(jīng)輕輕剝下，用PBS液沖洗2遍，剪碎組織塊，用濃度為0. 125%的胰蛋白酶消化液在37°C下消化15min，經(jīng)胰酶消化的組織小塊移入生長培養(yǎng)液(20%小牛血清的 DM EM/F212)中，靜置lOmin，以中和胰酶作用。離心(800r/min, 3min)去除上清液，吸取管底的組織小塊，生長培養(yǎng)液清洗2次(動作要輕，盡量不使粘連的組織小塊分開)。將組織小塊移入2ml的生長培養(yǎng)液中，再用火焰拋光后的Pasteur移液管反復(fù)吹打組織塊15 20 次，使之形成細胞懸液。取一滴細胞懸液滴于細胞計數(shù)板計數(shù)，用生長培養(yǎng)液調(diào)整細胞濃度為 5X105/ml。S3 三種OECs純化方法的比較研究12只大鼠取材后均分為正常對照組、免疫吸附組、化學(xué)藥物組和差速貼壁組。(1)正常對照組將0 ECs細胞懸液接種于預(yù)先包被多聚賴氨酸(50yg/ml，室溫下Ih)的M孔細胞培養(yǎng)板內(nèi)，37°C、體積分數(shù)為5%的C02培養(yǎng)箱(Heto 2000型)中， 培養(yǎng)2d后換維持培養(yǎng)液(10%小牛血清的DMEM/F212+20 μ mol/LForskolin+20 μ g/ml BPE+10%雙抗液)，每3天換液1次。此組未經(jīng)任何純化處理。
(2)免疫吸附組將OECs細胞懸液接種于預(yù)先包被p75抗體(1 μ g/ml，室溫下lh) 的25cm2玻璃培養(yǎng)瓶內(nèi)培養(yǎng)15min，去除含未吸附細胞的培養(yǎng)基，用生長培養(yǎng)液洗滌5次， 0. 125%的胰蛋白酶消化，生長培養(yǎng)液調(diào)整細胞濃度為5X105/ml后重新種植于預(yù)先包被多聚賴氨酸(50 μ g/ml，室溫下Ih)的M孔細胞培養(yǎng)板內(nèi)，余同他組。(3)化學(xué)藥物組將0 ECs細胞懸液接種于預(yù)先包被多聚賴氨酸(50 μ g/ml，室溫下Ih)的M孔細胞培養(yǎng)板內(nèi)培養(yǎng)3d后加入作用濃度為10 μ mol/L的阿糖胞苷(Ara2C)以抑制成纖維細胞等分裂迅速的細胞，4 后用培養(yǎng)液間隔15min洗3次，以去除Ara2C，余同他組。(4)差速貼壁組將OECs細胞懸液接種于無包被處理的25cm2玻璃瓶內(nèi)培養(yǎng)1 后將懸液細胞液吸出，移入另一個無包被處理的25cm2玻璃培養(yǎng)瓶內(nèi)培養(yǎng)36h;重新種植于預(yù)先包被多聚賴氨酸(50yg/ml，室溫下Ih)的M孔培養(yǎng)板內(nèi)培養(yǎng)2天，余同他組。S4 形態(tài)學(xué)觀察將不同培養(yǎng)時間的OECs于倒置相差顯微鏡(Olympus CK40型) 下進行形態(tài)觀察，觀察其形態(tài)及結(jié)構(gòu)的變化，并進行比較。S5 =OECs純度檢測各組OECs培養(yǎng)14d后進行的純度檢測。采用GFA P免疫酶細胞染色DAB顯色，蘇木素復(fù)染，倒置顯微鏡下觀察，隨機選10個視野(0. 45mm2)并計數(shù)GFA P陽性細胞的百分率。實驗結(jié)果分析如下正常對照組在接種后Ih時就開始出現(xiàn)細胞貼壁，呈球形，周圍有云狀物質(zhì)分布， 很難辨認細胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)。3 時懸浮細胞大多貼壁，細胞形態(tài)雖基本可辨，視野內(nèi)主要有以下兩種細胞一些為扁平多角形細胞，胞體發(fā)暗，有幾個偽足樣結(jié)構(gòu)，可能為早期的成纖維細胞；另一些為雙極或三極細胞。但此時尚難以準(zhǔn)確區(qū)分細胞類型。3d后細胞繼續(xù)生長， 兩種細胞形態(tài)差別逐漸增大，成纖維細胞形態(tài)不規(guī)則，折光性差而暗，分裂迅速；而0 ECs 則973輪廓清晰，立體感強，其突起為雙極或三極，其中以對稱突起的雙極細胞為主，其胞體呈長梭形，細胞核位于中央亦呈梭形，三極細胞有三個突起，胞體呈三角形，細胞核位于中央亦呈圓形，兩者共同的明顯特點是突起細長。GFAP免疫細胞化學(xué)染色結(jié)果進一步證明了以上結(jié)論。5d時OECs細胞密度增加，胞體較亮，突起變長；背底有許多成纖維細胞存在， 胞體較大、扁平，其立體感、折光性較差，呈地毯狀平鋪于底壁。多次培養(yǎng)中偶然可見中樞其他種類的細胞，如小膠質(zhì)細胞和纖維型星形膠質(zhì)細胞，但其含量極少。7d時視野內(nèi)成纖維細胞已達到60%以上，至14d成纖維細胞已完全長滿，部分形成多層，OECs消失。而經(jīng)過純化處理的其他3組情況則不同，細胞類型始終以O(shè)ECs為多數(shù)。接種14d后視野內(nèi)的OECs 純度均值都在75%以上，其中免疫吸附組為84. 3% 士4. 2%，化學(xué)藥物組平均為80. 3% 士4. 7%，差速貼壁組平均為75. 6% 士4.9%。體外培養(yǎng)的新生大鼠嗅球OECs主要為雙極或三級細胞，其突起細長。未經(jīng)純化的 OECs則成纖維細胞生長迅速而占優(yōu)勢，三種純化方法均能使接種14d后的OECs純度均值大于75%。p75抗體吸附法和阿糖胞苷抑制法的純化率均值略高于差速貼壁法。故新生大鼠嗅球OECS的原代培養(yǎng)中細胞純化是必要的；在脊髓損傷再生研究中，較之p75抗體吸附法和阿糖胞苷抑制法，差速貼壁法是一種簡單、經(jīng)濟、實用的OECs純化方法。本發(fā)明并不局限于所述的實施例，本領(lǐng)域的技術(shù)人員在不脫離本發(fā)明的精神即公開范圍內(nèi)，仍可作一些修正或改變，故本發(fā)明的權(quán)利保護范圍以權(quán)利要求書限定的范圍為準(zhǔn)。
權(quán)利要求
1. 一種新生大鼠嗅球嗅鞘細胞的分離方法，其應(yīng)用于嗅球嗅鞘細胞的純化過程，所述純化過程的步驟包括OECs的取材；OECs的分離0ECs分組純化；形態(tài)學(xué)觀察以及OECs純度檢測；其中所述OECs的分離方法包括將位于嗅球最外層的嗅神經(jīng)層的嗅小球?qū)右约吧倭窟B接的嗅神經(jīng)輕輕剝下，用PBS液沖洗2遍，剪碎組織塊，用濃度為0. 125%的胰蛋白酶消化液在37°C下消化15min，經(jīng)胰酶消化的組織小塊移入生長培養(yǎng)液(20%小牛血清的DMEM/F212)中，靜置lOmin，以中和胰酶作用；離心(800r/min，3min)去除上清液，吸取管底的組織小塊，生長培養(yǎng)液清洗2次； 將組織小塊移入2ml的生長培養(yǎng)液中，再用火焰拋光后的I^steur移液管反復(fù)吹打組織塊15 20次，使之形成細胞懸液；以及取一滴細胞懸液滴于細胞計數(shù)板計數(shù)，用生長培養(yǎng)液調(diào)整細胞濃度為5X 105/ml。
全文摘要
本發(fā)明提出一種新生大鼠嗅球嗅鞘細胞(OECs)的分離方法，其應(yīng)用于OECs的純化過程，所述純化過程包括OECs的取材；OECs的分離OECs分組純化及比較；形態(tài)學(xué)觀察以及OECs純度檢測。本發(fā)明通過不同的新生大鼠嗅球嗅鞘細胞(OECs)的純化方法實驗，結(jié)果顯示體外培養(yǎng)的新生大鼠嗅球OECs主要為雙極或三級細胞，其突起細長。未經(jīng)純化的OECs則成纖維細胞生長迅速而占優(yōu)勢，三種純化方法均能使接種14d后的OECs純度均值大于75％。p75抗體吸附法和阿糖胞苷抑制法的純化率均值略高于差速貼壁法。故新生大鼠嗅球OECS的原代培養(yǎng)中細胞純化是必要的；在脊髓損傷再生研究中，較之p75抗體吸附法和阿糖胞苷抑制法，差速貼壁法是一種簡單、經(jīng)濟、實用的OECs純化方法。
文檔編號C12N5/079GK102559594SQ201110447659
公開日2012年7月11日 申請日期2011年12月27日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月27日
發(fā)明者吳衛(wèi)江 申請人:吳衛(wèi)江