專利名稱：一種雞馬立克氏病火雞皰疹病毒活疫苗毒價的測定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種生物制品的免疫原含量的測定技術(shù)，具體地說，是通過蝕斑形成實驗測定雞馬立克氏病火雞皰疹病毒活疫苗的毒價，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
雞馬立克氏病(Marek，s Disease, MD)是由皰疹病毒科的馬立克氏病病毒(MDV) 引起的雞的一種高度接觸性淋巴組織增生性疾病，該病目前還沒有有效的治療方法，給全世界養(yǎng)雞業(yè)帶來了巨大損失。雞馬立克氏病是第一個能用疫苗預(yù)防的腫瘤性疾病，雞馬立克氏病火雞皰疹病毒活疫苗是目前應(yīng)用最普遍的防治雞馬立克氏病的有效手段。50年代初，Dulbecco依據(jù)噬菌體感染細(xì)菌而產(chǎn)生噬斑原理，用培養(yǎng)細(xì)胞單層建立了病毒蝕斑技術(shù)，該技術(shù)能計數(shù)細(xì)胞培養(yǎng)適應(yīng)病毒、細(xì)胞病變陽性的病毒蝕斑數(shù)，是目前人和動物病毒精確定量的常用方法，已成為病毒學(xué)研究和活病毒生物制品質(zhì)量監(jiān)測的重要方法。目前，雞馬立克氏病火雞皰疹病毒活疫苗的毒價測定是通過蝕斑計數(shù)完成的?！吨腥A人民共和國獸藥典》(三部，2010年版)(以下簡稱《中國獸藥典》)測定方法為疫苗樣品用SPG稀釋，取適當(dāng)稀釋度，每個稀釋度接種3個已長成良好單層的雞胚成纖維細(xì)胞瓶，每瓶0. anl，置37°C吸附60分鐘，加入含1牛血清的M-199營養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)M小時，棄去培養(yǎng)液，覆蓋含5%牛血清的EMEM或M-199瓊脂(糖)培養(yǎng)基，待凝固后，將瓶倒置，繼續(xù)培養(yǎng) 5^7日，進(jìn)行蝕斑計數(shù)。蝕斑應(yīng)典型、清晰，形態(tài)不規(guī)則，邊緣不整齊，呈乳白色，與同時設(shè)立的參照品蝕斑一致。計數(shù)時，計算同一稀釋度3瓶細(xì)胞的平均蝕斑數(shù)，再計算每瓶疫苗所含蝕斑數(shù)?！吨袊F藥典》所載測定方法需要在細(xì)胞單層上覆蓋瓊脂(糖)培養(yǎng)基，不但操作繁瑣，且瓊脂的毒性作用及覆蓋溫度等均會影響計數(shù)結(jié)果。在多篇文獻(xiàn)中有報道，應(yīng)用該方法，同一組樣品重復(fù)檢驗的結(jié)果差別很大，有的相差廣2倍，甚至出現(xiàn)產(chǎn)品保存半年后測得的蝕斑數(shù)比生產(chǎn)時還高。測定結(jié)果不準(zhǔn)確，成品疫苗的抗原實際含量可能會低于標(biāo)準(zhǔn)，免疫雞機(jī)體產(chǎn)生的保護(hù)力達(dá)不到預(yù)期，會直接導(dǎo)致雞群的免疫失敗。而且雞馬立克氏病火雞皰疹病毒活疫苗毒價的測定是一個涉及多環(huán)節(jié)多因素的操作系統(tǒng)，任何一個環(huán)節(jié)的誤差都會造成最終測定結(jié)果差異的擴(kuò)大；有必要對影響病毒蝕斑計數(shù)的各個因素進(jìn)行優(yōu)化，并保持一貫性，以減小測定結(jié)果批間誤差。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是克服現(xiàn)有技術(shù)之缺陷、提供一種改進(jìn)的雞馬立克氏病火雞皰疹病毒活疫苗毒價的測定方法，它可以提高疫苗毒價測定精度，保證疫苗的質(zhì)量。本發(fā)明所述技術(shù)問題是由以下技術(shù)方案實現(xiàn)的。一種雞馬立克氏病火雞皰疹病毒活疫苗毒價的測定方法，包括以下步驟
⑴制備雞胚成纖維細(xì)胞懸液使用胰酶連續(xù)消化法將9日齡SPF雞胚制成雞胚成纖維細(xì)胞懸液，備用；
⑵細(xì)胞培養(yǎng)用細(xì)胞生長液將步驟⑴所得雞胚成纖維細(xì)胞懸液稀釋使細(xì)胞密度為 0.9X106個/ml 1. IXlO6個/ml，并接種于細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔加入Iml稀釋后的細(xì)胞懸液，置CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，至長滿細(xì)胞單層，備用；
(3)稀釋病毒液采用旋渦混懸器混勻方法，用細(xì)胞維持液1X104、5X104倍稀釋待測定的病毒液，得到梯度濃度的病毒液；
(4)病毒接種及培養(yǎng)棄去步驟⑵細(xì)胞培養(yǎng)板中細(xì)胞生長液，并按0.2ml/孔加入步驟 ⑶所得稀釋病毒液，每個稀釋度接5個孔，置CO2培養(yǎng)箱中吸附lh，接毒孔再加入細(xì)胞維持液1. 5ml/孔；同時將細(xì)胞培養(yǎng)板未接毒孔中加入細(xì)胞維持液，1. 5ml/孔，每個稀釋度對應(yīng)1 孔，設(shè)置為陰性對照；細(xì)胞培養(yǎng)板置(X)2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；
(5)蝕斑計數(shù)病毒接種后培養(yǎng)4飛天，待病毒蝕斑充分生長時，在倒置顯微鏡下對細(xì)胞培養(yǎng)板中相應(yīng)的蝕斑進(jìn)行計數(shù)；
(6)毒價計算陰性對照培養(yǎng)孔無蝕斑出現(xiàn)的細(xì)胞培養(yǎng)板為有效板，根據(jù)有效板的各培養(yǎng)孔的蝕斑數(shù)、接種的待測定的病毒液的用量及稀釋倍數(shù)計算出待測定的病毒液的毒價。上述測定方法，所述細(xì)胞生長液配方為體積百分含量909Γ92%的Μ-199營養(yǎng)液， 8°/Γ Ο%新生牛血清，用NaHC03調(diào)整pH值為7. 2 . 5。上述測定方法，所述細(xì)胞培養(yǎng)板為M孔細(xì)胞培養(yǎng)板。 上述測定方法，所述(X)2培養(yǎng)箱中(X)2體積含量為4%飛％，優(yōu)選體積含量為5% ；培養(yǎng)溫度為37°C 38°C，優(yōu)選培養(yǎng)溫度為38°C。上述測定方法，使用旋渦混懸器混勻病毒液，采用轉(zhuǎn)速300rpm，混勻時間l(T20s。上述測定方法，所述細(xì)胞維持液配方為體積百分含量979Γ98%的Μ-199營養(yǎng)液， 29Γ3%新生牛血清，調(diào)整pH值為7. 2^7. 5。上述測定方法，所述蝕斑判定方法為在顯微鏡下，視野中可見一個或多個細(xì)胞圓縮、堆積成簇的病變區(qū)域，病變細(xì)胞具有折光性，病變區(qū)域邊緣不整齊、整體呈菜花樣，一個病變區(qū)域即為一個蝕斑。上述測定方法，病毒蝕斑計數(shù)時機(jī)的確定，根據(jù)火雞皰疹病毒在雞胚成纖維細(xì)胞上的生長特性，一般在接毒后第4天計數(shù)，如果蝕斑偏小(眼觀如針尖大小)，可在接毒后第 5天計數(shù)。上述測定方法，待測定病毒液毒價的計算方法毒價以Iml病毒液中所含有的蝕斑形成單位的數(shù)目來表示，計算公式為A=BXC/V，其中A 毒價；B 最適稀釋倍數(shù)各孔蝕斑的算術(shù)平均數(shù)；C 最適稀釋倍數(shù)；V 每孔接種病毒液體積。上述測定方法，所述的最適稀釋倍數(shù)為蝕斑清晰，無融合重疊，蝕斑數(shù)在1(Γ30個范圍的稀釋倍數(shù)。本發(fā)明的基本原理是雞馬立克氏病火雞皰疹病毒感染細(xì)胞后，通過形成合胞體從一個細(xì)胞核進(jìn)入另一個細(xì)胞核，病毒由最初感染的細(xì)胞向周邊細(xì)胞擴(kuò)展感染，經(jīng)過幾個增殖周期，便形成一個局限性病變細(xì)胞區(qū)，即病毒蝕斑。從理論上講，一個蝕斑是由最初感染細(xì)胞的一個病毒顆粒形成的。此外，在病毒感染細(xì)胞72h以后，病毒還會通過細(xì)胞膜上的微絨毛釋放到細(xì)胞外，產(chǎn)生游離病毒而形成第二次感染，經(jīng)幾個增殖周期，到第7天時蝕斑數(shù)量會突然增加，但在6天內(nèi)蝕斑數(shù)量比較穩(wěn)定，不受游離病毒影響。因此雞馬立克氏病火雞皰疹病毒毒價通過蝕斑計數(shù)來測定，在一定周期內(nèi)，不必使用瓊脂等固體介質(zhì)蓋在細(xì)胞上。本發(fā)明方法基于雞馬立克氏病火雞皰疹病毒的感染模式，不使用瓊脂覆蓋，且于接毒后4飛天進(jìn)行蝕斑計數(shù)，可以避免接毒后第二次病毒釋放造成的影響，能夠準(zhǔn)確測定出雞馬立克氏病火雞皰疹病毒活疫苗的原始病毒毒價。由于采用如上所述的技術(shù)方案，本發(fā)明具有如下優(yōu)越性
(1)本方法使用胰酶連續(xù)消化法制備雞胚成纖維細(xì)胞，與傳統(tǒng)玻璃珠分散方法相比較， 制備的雞胚成纖維細(xì)胞更易貼壁，細(xì)胞活力好，死細(xì)胞少，提高雞胚利用率，降低成本；
⑵使用M孔細(xì)胞培養(yǎng)板進(jìn)行空斑計數(shù)，1塊M孔細(xì)胞培養(yǎng)板測定量等同于12個細(xì)胞培養(yǎng)瓶測定量，操作和計數(shù)更簡便，成本更低；
(3)使用的病毒稀釋液能夠有效保護(hù)火雞皰疹病毒，減小在疫苗效價測定過程中，由于稀釋液不能有效保護(hù)病毒所帶來的測定誤差；
⑷本方法測定周期為5-6天，相比常規(guī)方法測定周期7-9天，測定周期大大縮短；
(5)使用旋渦混懸器梯度稀釋病毒液，限定轉(zhuǎn)速和混懸時間，既不損傷病毒，又可充分混勻病毒液，與傳統(tǒng)移液器吹打混勻方法相比，準(zhǔn)確性更強(qiáng)；
(6)本發(fā)明省略了覆蓋瓊脂(糖)培養(yǎng)基步驟，避免了瓊脂的毒性作用及覆蓋溫度對細(xì)胞和病毒的影響，操作更簡單；且對技術(shù)方案的進(jìn)行多方面優(yōu)化，使得測定條件均一，可控性強(qiáng)，批間誤差小。


圖1為蝕斑眼觀狀態(tài)；
圖2為顯微鏡下觀察到的2個蝕斑狀態(tài)。
具體實施例方式下面結(jié)合實施例對本發(fā)明做進(jìn)一步的描述。實施例1雞胚成纖維細(xì)胞的制備
⑴選用生長良好的9日齡梅里亞SPF雞胚，嚴(yán)格消毒雞胚表面，用鑷子敲除氣室部位的蛋殼，用彎頭眼科鑷子小心夾住雞胚并取出放在滅菌的平皿內(nèi)；
(2)除去雞胚的眼、腦和內(nèi)臟，用0.OlM PBS pH7. 2洗液沖洗胚體三次；
(3)按每個胚體IOml的比例加入38°C預(yù)熱的質(zhì)量濃度為0.25%的胰酶溶液，在磁力攪拌下進(jìn)行消化，每次lOmin，每次消化結(jié)束后，細(xì)胞液經(jīng)2層紗布過濾到提前加入胰酶溶液總體積m的胎牛血清的容器內(nèi)；本步驟重復(fù)操作3、次；
⑷細(xì)胞液進(jìn)行離心，采用2500rpm lOmin，將上清液體棄去，按照每個胚體IOml的比例加入細(xì)胞生長液(體積百分含量90% M-199細(xì)胞營養(yǎng)液、10%新生牛血清，？!1值7.2)，用吹打管吹打?qū)⒓?xì)胞混懸起來。(5)細(xì)胞液經(jīng)4層紗布過濾，收集濾液；
(6)計數(shù)取0.5ml細(xì)胞懸液與4. 5ml的0. OlM PBS pH7. 2液混勻后，取0. 2ml混合液與0. 6ml臺盼蘭染液混勻后用細(xì)胞計數(shù)板進(jìn)行計數(shù)；
(7)使用細(xì)胞生長液將細(xì)胞懸液稀釋至0.9X IO6個/ml，混勻后接入M孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔接入1ml，放入38°C、5% CO2的培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)；
(8)觀察細(xì)胞雞胚成纖維細(xì)胞生長24h后長成均勻致密的細(xì)胞單層。實施例2雞馬立克氏病火雞皰疹病毒接入雞胚成纖維細(xì)胞單層
⑴稀釋病毒選取1個雞馬立克氏病火雞皰疹病毒活疫苗樣品(瑞普(保定)生物藥業(yè)有限公司產(chǎn)品，市場有售)，使用細(xì)胞維持液(體積百分含量98% M-199細(xì)胞營養(yǎng)液、洲新生牛血清，PH值7. 4)對其進(jìn)行IX IO4和5X IO4倍稀釋，稀釋過程使用旋渦混懸器對病毒液進(jìn)行混勻，轉(zhuǎn)速300rpm，混勻時間l(T20s，以保證病毒細(xì)胞液完全混勻；
⑵病毒接種將M孔細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)的細(xì)胞生長液棄去，將稀釋好的病毒液加入孔中， 2個稀釋度分別接5個孔；
(3)加入病毒液后放入38°C培養(yǎng)箱中吸附Ih；
(4)吸附完畢，向每個接毒孔中加入細(xì)胞維持液1.5ml,同時將2個稀釋度同行未接毒孔各加入細(xì)胞維持液1. 5ml，設(shè)置為陰性對照，將M孔細(xì)胞培養(yǎng)板放入5% CO2培養(yǎng)箱中繼
續(xù)培養(yǎng)。實施例3病毒蝕斑的計數(shù)及毒價計算
在接入病毒后第4天對蝕斑進(jìn)行計數(shù)，陰性對照的培養(yǎng)孔無蝕斑出現(xiàn)，實驗成立，在顯微鏡下對細(xì)胞孔內(nèi)的蝕斑計數(shù)，從左到右、從上到下一條龍地觀察每一個細(xì)胞孔中的蝕斑 (有些蝕斑可能融合在一起，需要區(qū)分出蝕斑的生發(fā)中心)，根據(jù)各培養(yǎng)孔的蝕斑數(shù)、接種的待測定的病毒液的體積及稀釋倍數(shù)計算出待測定的病毒液的毒價。毒價=mimmm^\Mmmmmm^ χ Jii舌稀釋倍數(shù)
每孔接種病毒液體積
注最適稀釋倍數(shù)為蝕斑數(shù)在1(Γ30個范圍的稀釋倍數(shù)。圖1和圖2中箭頭所示分別為眼觀和顯微鏡下觀察的病毒蝕斑，蝕斑計數(shù)應(yīng)在顯微鏡下進(jìn)行，圖1為半塊M孔細(xì)胞培養(yǎng)板。圖1中M孔細(xì)胞板上Al Α5孔對應(yīng)的是5Χ IO4稀釋度，Bl Β5孔對應(yīng)的是 1 X IO4稀釋度，Α6、Β6孔為陰性對照。Α6、Β6兩陰性對照孔無蝕斑，細(xì)胞培養(yǎng)板有效。Bl Β5孔內(nèi)蝕斑數(shù)均超過30個，1 X IO4稀釋度不是最適稀釋倍數(shù)。Al Α5孔蝕斑數(shù)分別是21、20、26、12、22，蝕斑數(shù)均在10 30個范圍內(nèi)，5 X IO4為最適稀釋倍數(shù)，如前所述，每孔接種的毒液量為0. 2 ml，根據(jù)公式計算得到
該疫苗樣品毒價(蝕斑形成單位)= 1+20+26+12+22)/5X5X 104/0. 2=5. 05X IO6 (個/ 毫升)
實施例4批件誤差比較實驗
批間誤差的計算方法是將同一待檢的病毒液小量分裝，低溫保存，分5次實驗來測定這一待檢毒樣，5次測定的結(jié)果取對數(shù)，并計算5個樣本總體的標(biāo)準(zhǔn)偏差后得到的數(shù)值。選取3個雞馬立克氏病火雞皰疹病毒活疫苗樣品(瑞普(保定)生物藥業(yè)有限公司產(chǎn)品，市場有售)，每個樣品均進(jìn)行小量分裝，分別使用本發(fā)明測定方法和《中國獸藥典》測定方法測定同一個樣品，每種方法重復(fù)測定5次，比較兩種測定方法的樣本標(biāo)準(zhǔn)偏差(結(jié)果見表1)。表1雞馬立克氏病火雞皰疹病毒活疫苗毒價測定結(jié)果比較
權(quán)利要求
1.一種雞馬立克氏病火雞皰疹病毒活疫苗毒價的測定方法，其特征是，它包括以下步驟⑴制備雞胚成纖維細(xì)胞懸液使用胰酶連續(xù)消化法將9日齡SPF雞胚制成雞胚成纖維細(xì)胞懸液；⑵細(xì)胞培養(yǎng)用細(xì)胞生長液將雞胚成纖維細(xì)胞懸液稀釋成細(xì)胞密度0.9X IO6個/ml 1. IX IO6個/ml，接種于細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔加入Iml細(xì)胞懸液，置CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，至長滿細(xì)胞單層，備用；(3)稀釋病毒液采用旋渦混懸器混勻方法，用細(xì)胞維持液1X104、5X104倍稀釋待測定的病毒液，得到梯度濃度的病毒液；(4)病毒接種及培養(yǎng)棄去步驟⑵細(xì)胞培養(yǎng)板中細(xì)胞生長液，并按0.2ml/孔加入步驟 ⑶所得稀釋病毒液，每個稀釋度接5個孔，置CO2培養(yǎng)箱中吸附lh，接毒孔再加入細(xì)胞維持液1. 5ml/孔；同時將細(xì)胞培養(yǎng)板未接毒孔中加入細(xì)胞維持液，1. 5ml/孔，每個稀釋度對應(yīng)1 孔，設(shè)置為陰性對照；細(xì)胞培養(yǎng)板置(X)2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；(5)蝕斑計數(shù)病毒接種后培養(yǎng)4飛天，待病毒蝕斑充分生長時，在倒置顯微鏡下對細(xì)胞培養(yǎng)板中相應(yīng)的蝕斑進(jìn)行計數(shù)；(6)毒價計算陰性對照培養(yǎng)孔無蝕斑出現(xiàn)的細(xì)胞培養(yǎng)板為有效板，根據(jù)有效板的各培養(yǎng)孔的蝕斑數(shù)、接種的待測定的病毒液的用量及稀釋倍數(shù)計算出待測定的病毒液的毒價。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的雞馬立克氏病火雞皰疹病毒活疫苗毒價的測定方法，其特征是在步驟⑵中，使用的細(xì)胞生長液配方為體積百分含量909Γ92%的Μ-199營養(yǎng)液， 8°/Γ Ο%新生牛血清，用NaHC03調(diào)整pH值為7. 2 . 5。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的雞馬立克氏病火雞皰疹病毒活疫苗毒價的測定方法，其特征是所述細(xì)胞培養(yǎng)板為M孔細(xì)胞培養(yǎng)板。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的雞馬立克氏病火雞皰疹病毒活疫苗毒價的測定方法，其特征是在步驟⑵、⑷中，所述CO2培養(yǎng)箱中(X)2體積含量為4%飛％、溫度設(shè)定為37°C 38°C。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的雞馬立克氏病火雞皰疹病毒活疫苗毒價的測定方法，其特征是在步驟⑶中，使用旋渦混懸器混勻病毒液，所述旋渦混懸器轉(zhuǎn)速300rpm，混勻時間 IOs 20s。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的雞馬立克氏病火雞皰疹病毒活疫苗毒價的測定方法，其特征是在步驟⑶、⑷中，所述細(xì)胞維持液配方為體積百分含量979Γ98%的Μ-199營養(yǎng)液， 29Γ3%新生牛血清，調(diào)整pH值為7. 2^7. 5。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的雞馬立克氏病火雞皰疹病毒活疫苗毒價的測定方法，其特征是在步驟ω中，所述蝕斑判定方法為在顯微鏡下，視野中可見一個或多個細(xì)胞圓縮、堆積成簇的病變區(qū)域，病變細(xì)胞具有折光性，病變區(qū)域邊緣不整齊、整體呈菜花樣，一個病變區(qū)域即為一個蝕斑。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的雞馬立克氏病火雞皰疹病毒活疫苗毒價的測定方法，其特征是在步驟ω中，病毒蝕斑計數(shù)時機(jī)的確定，一般在接毒后第4天計數(shù)，如果蝕斑偏小(眼觀如針尖大小)，可在接毒后第5天計數(shù)。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的雞馬立克氏病火雞皰疹病毒活疫苗毒價的測定方法，其特征是在步驟(6)中，待測定的病毒液的毒價的計算方法毒價以Iml病毒液中所含有的蝕斑形成單位的數(shù)目來表示，計算公式為毒價=χ 敲舌每孔接種病毒液體積。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的雞馬立克氏病火雞皰疹病毒活疫苗毒價的測定方法，其特征是所述最適稀釋倍數(shù)判定標(biāo)準(zhǔn)為在該病毒液稀釋倍數(shù)下，生成的蝕斑清晰、無融合重疊、蝕斑數(shù)在10 30個范圍，判定為最適稀釋倍數(shù)。
全文摘要
一種雞馬立克氏病火雞皰疹病毒活疫苗毒價的測定方法，它包括以下步驟⑴制備雞胚成纖維細(xì)胞懸液；⑵細(xì)胞培養(yǎng)；⑶稀釋待測定的病毒液；⑷病毒接種及培養(yǎng)；⑸蝕斑計數(shù)；⑹毒價計算。本發(fā)明操作簡單，測定條件均一，可控性強(qiáng)，批間誤差小，縮短了雞馬立克氏病火雞皰疹病毒活疫苗毒價的測定周期。
文檔編號C12R1/93GK102399911SQ20111044736
公開日2012年4月4日 申請日期2011年12月28日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月28日
發(fā)明者劉濤, 李漢秋, 楊保收, 郁宏偉, 馬明 申請人:瑞普(保定)生物藥業(yè)有限公司