專利名稱：一種制備胰島素分泌細胞的方法及其專用培養(yǎng)基組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種制備胰島素分泌細胞的方法及其專用培養(yǎng)基組合物。
背景技術(shù)：
"糖尿病"是一種血液中的葡萄糖容易堆積過多的疾病。國外給它的別名叫"沉默的殺手"(Silent Killer)，特別是"成人型糖尿病"，四十歲以上的中年人染患率特別高，在日本，四十歲以上的人口中占10%，即十人當(dāng)中就有一位"糖尿病"患者。一旦患上"糖尿病"，將減少壽命十年之多，且可能發(fā)生的并發(fā)癥遍及全身。多年來，醫(yī)學(xué)界一直致力于對糖尿病的研究。這是因為一旦患上“糖尿病”，人體的麻煩隨其而至，因為免疫功能減弱，容易感染由感冒、肺炎、肺結(jié)核所引起的各種感染疾病，而且不易治愈。并且選擇性地破壞細胞，吞噬細胞?？拱┘毎姆烙鶛C能會大大減弱，至使癌細胞活躍、聚集。難怪有這樣的說法，一旦得了“糖尿病”，壽命減去十多年。因此許多人對糖尿病談之而色變，千方百計的治療。糖尿病(Diabetes)分I型糖尿病、2型糖尿病、妊娠糖尿病及其他特殊類型的糖尿病。在糖尿病患者中，2型糖尿病所占的比例約為95 %。胰島素是人體胰腺B細胞分泌的身體內(nèi)唯一的降血糖激素。胰島素是由胰島3細胞受內(nèi)源性或外源性物質(zhì)如葡萄糖、乳糖、核糖、精氨酸、胰高血糖素等的刺激而分泌的一種蛋白質(zhì)激素。胰島素是機體內(nèi)唯一降低血糖的激素，同時促進糖原、脂肪、蛋白質(zhì)合成。外源性胰島素主要用來糖尿病治療，糖尿病患者早期使用胰島素和超強抗氧化劑如(注射用硫辛酸、口服蝦青素等)有望出現(xiàn)較長時間的蜜月期，胰島素注射不會有成癮和依賴性。干細胞是一種具有自我更新能力和多系分化潛能的原始細胞，是細胞移植的理想細胞。在個體發(fā)育過程中 ，存在各種形式的干細胞，如胚胎干細胞，多能干細胞以及各種組織中的定向干細胞如造血干細胞、神經(jīng)干細胞等。但在實際應(yīng)用上卻面臨倫理的挑戰(zhàn)或取材的限制。間充質(zhì)干細胞(MSC)是存在于人體組織中具有多系分化潛能的一種亞全能干細胞群，因其在特定環(huán)境下可誘導(dǎo)分化為多種組織細胞，且具有免疫源性低，移植后能形成穩(wěn)定嵌合等特點，故可作為一種理想的供異基因移植的細胞。因為MSC亞全能干細胞可獲得向內(nèi)胚層組織分化的潛在能力，容易取材，來源更為豐富且不受倫理限制及沒有成瘤危險，所以使用間充質(zhì)干細胞體外誘導(dǎo)獲得胰島素分泌細胞在臨床上具有更高的應(yīng)用價值。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種制備胰島素分泌細胞的方法及其專用培養(yǎng)基組合物。本發(fā)明提供了一種將間充質(zhì)干細胞誘導(dǎo)為胰島素分泌細胞的培養(yǎng)基組合物(培養(yǎng)基組合物甲)，由培養(yǎng)基A、培養(yǎng)基B和培養(yǎng)基C組成；所述培養(yǎng)基A由動物細胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基和溶質(zhì)組成；所述溶質(zhì)及其在所述培養(yǎng)基A中的濃度如下-A.75ml/L-5.25ml/L 胎牛血清和 4.75ng/mL_5.25ng/mL activin A ；所述培養(yǎng)基B由動物細胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基和溶質(zhì)組成；所述溶質(zhì)及其在所述培養(yǎng)基B 中的濃度如下:0.95 X 10 5mol/L_l.05 X 10 5mol/L 維甲酸、19ng/ml_21ng/ml EGF> 19ng/ml-21ng/ml bFGF、l.9mmol/L-2.lmmol/L 谷氨酸胺、體積濃度為 0.95 % -1.05% 的非必需氨基酸和體積濃度為1.9% -2.1%的B27 ；所述培養(yǎng)基C由動物細胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基和溶質(zhì)組成；所述溶質(zhì)及其在所述培養(yǎng)基 C 中的濃度如下-A.5ml/L-5.5ml/L 月臺牛血清、19ng/ml_21ng/ml exendin_4、9.5ng/ml-10.5ng/ml activin A、9.5mmoI /1,-10.5mmol/L 尼克酸胺、體積濃度為 1.9% -2.1 的B27和體積濃度為0.95% -1.05%的N2。所述動物 細胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基為高糖DMEM培養(yǎng)基或DMEM/F12培養(yǎng)基。所述培養(yǎng)基A由高糖DMEM培養(yǎng)基和溶質(zhì)組成；所述溶質(zhì)及其在培養(yǎng)基A中的濃度如下:5ml/L胎牛血清和5ng/mL activin A。所述培養(yǎng)基B由DMEM/F12培養(yǎng)基和溶質(zhì)組成；所述溶質(zhì)及其在培養(yǎng)基B中的濃度如下:lCT5mol/L維甲酸、20ng/ml EGF、20ng/ml bFGF、2mmol/L谷氨酰胺、體積濃度為I %的非必需氨基酸和體積濃度為2%的B27。所述培養(yǎng)基C由高糖DMEM培養(yǎng)基和溶質(zhì)組成；所述溶質(zhì)及其在培養(yǎng)基C中的濃度如下:5ml/L 胎牛血清、20ng/ml exendin-4、10ng/ml activin A、lOmmol/L 尼克酰胺、體積濃度為2 %的B27和體積濃度為I %的N2。所述B27為購自GIBCO公司，產(chǎn)品目錄號為17504-044的產(chǎn)品。所述N2為購自GIBCO公司，產(chǎn)品目錄號為17502-048的產(chǎn)品。所述非必需氨基酸為GIBCO公司，產(chǎn)品目錄號為11140的產(chǎn)品。維甲酸購自Sigma公司，產(chǎn)品目錄號為R2625。人活化素A(Activin A):英國PeproTech公司，產(chǎn)品目錄號為120-14。EGF(epidermal growth factor,表皮細胞生長因子):Pepro Tech 公司，產(chǎn)品目錄號為 100-15。bFGF(basic fibroblast growth factor,喊性成纖維細胞生長因子):Sigma公司，產(chǎn)品目錄號為F0291。exendin-4:Sigma公司，產(chǎn)品目錄號為E7144。本發(fā)明還提供了一種將間充質(zhì)干細胞誘導(dǎo)為胰島素分泌細胞方法，是將間充質(zhì)干細胞依次用所述培養(yǎng)基A、所述培養(yǎng)基B和所述培養(yǎng)基C進行培養(yǎng)，得到胰島素分泌細胞。所述方法可包括如下步驟:(I)將間充質(zhì)干細胞接種于所述培養(yǎng)基A中，培養(yǎng)4-6天(具體可為5天)；(2)將完成步驟⑴的細胞轉(zhuǎn)接于所述培養(yǎng)基B中，培養(yǎng)6-8天；(3)將完成步驟(2)的細胞轉(zhuǎn)接于所述培養(yǎng)基C中，培養(yǎng)7-10天(具體可為8天)，得到胰島素分泌細胞。所述步驟(I)中，所述間充質(zhì)干細胞在所述培養(yǎng)基A中的初始濃度可為2 X IO5個/ml-1 X IO6 個 /ml (具體可為 5 X IO5 個 /ml)。所述方法中，整個培養(yǎng)過程的培養(yǎng)條件可為:在37°C、50ml/L CO2、空氣相對濕度為95%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。所述培養(yǎng)基組合物甲在將間充質(zhì)干細胞誘導(dǎo)為胰島素分泌細胞中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護范圍。本發(fā)明還保護一種將限定性內(nèi)胚層細胞誘導(dǎo)為胰腺干細胞和/或胰腺祖細胞的培養(yǎng)基，為以上任一所述培養(yǎng)基B。所述培養(yǎng)基在將限定性內(nèi)胚層細胞誘導(dǎo)為胰腺干細胞和/或胰腺祖細胞中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護范圍。本發(fā)明還保護一種將間充質(zhì)干細胞誘導(dǎo)為胰腺干細胞和/或胰腺祖細胞的培養(yǎng)基組合物(培養(yǎng)基組合物乙)，由以上任一所述培養(yǎng)基A和以上任一所述培養(yǎng)基B組成。所述培養(yǎng)基組合物乙在將間充質(zhì)干細胞誘導(dǎo)為胰腺干細胞和/或胰腺祖細胞中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護范圍。本發(fā)明還保護一種將限定性內(nèi)胚層細胞誘導(dǎo)為胰島素分泌細胞的培養(yǎng)基組合物(培養(yǎng)基組合物丙)，由以上任一所述培養(yǎng)基B和以上任一所述培養(yǎng)基C組成。所述培養(yǎng)基組合物丙在將限定性內(nèi)胚層細胞誘導(dǎo)為胰島素分泌細胞中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護范圍。以上任一所述的間充質(zhì)干細胞具體可為臍帶來源的間充質(zhì)干細胞。以上任一所述的間充質(zhì)干細胞具體可為人間充質(zhì)干細胞。以上任一所述的間充質(zhì)干細胞具體可為第3代間充質(zhì)干細胞。所述間充質(zhì)干細胞為細胞因子⑶29、⑶44、⑶73、⑶90、⑶105、Flk-1和HLA-ABC均為陽性，細胞因子⑶34、⑶106、⑶117和HLA-DR均為陰性的細胞。所述限定性內(nèi)胚層細胞為Foxa2和Soxl7表達量高于所述間充質(zhì)干細胞的細胞。所述胰腺干細胞和/或胰腺祖細胞為Pdxl、Ngn3和Pax4表達量高于所述間充質(zhì)干細胞的細胞。所述胰島素分泌細胞為Insulin、C-peptide和Glut_2表達量高于所述間充質(zhì)干細胞的細胞。`間充質(zhì)干細胞經(jīng)過三步誘導(dǎo)法可在體外一次獲得限定性內(nèi)胚層細胞，胰腺干/祖細胞及胰島素分泌細胞，各階段細胞可表達相應(yīng)的特異性基因，并且最后獲得的胰島素分泌細胞具有胰島素分泌功能及對葡萄糖的反應(yīng)性。本發(fā)明的誘導(dǎo)培養(yǎng)方法，適合于各種組織來源的間充質(zhì)干細胞，該誘導(dǎo)培養(yǎng)方法無病毒導(dǎo)入、易操作、效率高。首先培養(yǎng)得到的限定性內(nèi)胚層細胞表達限定性內(nèi)胚層標志Foxa2, Soxl7,獲得效率能夠達到90%以上；隨后培養(yǎng)得到的胰腺干/祖細胞表達胰腺干/祖細胞標志Pdxl，Ngn3，Pax4，獲得效率能夠達到70%以上；最后培養(yǎng)得到的胰島素分泌細胞(表達B細胞標志胰島素，C-肽)，獲得效率能夠達到95%以上，并且獲得的細胞在體外具有胰島素分泌功能及對葡萄糖的應(yīng)答功能。本發(fā)明方法得到的胰島素分泌細胞可應(yīng)用于體內(nèi)治療糖尿病導(dǎo)致的胰腺損傷，重建胰島功能，為治療糖尿病提供了實驗依據(jù)和臨床研究證據(jù)，為細胞移植治療提供了新的途徑。


圖1為人間充質(zhì)干細胞(胰島素分泌細胞的種子細胞)的形態(tài)。圖2為人間充質(zhì)干細胞(胰島素分泌細胞的種子細胞)的免疫表型檢測結(jié)果。圖3為人間充質(zhì)干細胞體外分化得到的限定性內(nèi)胚層細胞的形態(tài)。圖4為人間充質(zhì)干細胞體外分化得到的限定性內(nèi)胚層細胞的免疫細胞熒光染色檢測結(jié)果。圖5為人間充質(zhì)干細胞體外分化得到的限定性內(nèi)胚層細胞的實時定量PCR檢測結(jié)果。
圖6為限定性內(nèi)胚層細胞體外分化得到的胰腺干細胞/胰腺祖細胞的形態(tài)。圖7為限定性內(nèi)胚層細胞體外分化得到的胰腺干細胞/胰腺祖細胞的免疫細胞熒光檢測結(jié)果。圖8為限定性內(nèi)胚層細胞體外分化得到的胰腺干細胞/胰腺祖細胞實時定量PCR檢測結(jié)果。圖9為胰腺干細胞/胰腺祖細胞體外分化得到的胰島素分泌細胞的形態(tài)。圖10為胰腺干細胞/胰腺祖細胞體外分化得到的胰島素分泌細胞的免疫細胞熒光染色檢測結(jié)果。圖11為胰腺干細胞/胰腺祖細胞體外分化得到的胰島素分泌細胞的實時定量PCR檢測結(jié)果。圖12為胰腺干細胞/胰腺祖細胞體外分化得到的胰島素分泌細胞的胰島素分泌總量檢測結(jié)果。圖13為胰腺干細 胞/胰腺祖細胞體外分化得到的胰島素分泌細胞的胰島素釋放情況檢測結(jié)果。
具體實施例方式
以下的實施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為自常規(guī)生化試劑商店購買得到的。以下實施例中的定量試驗，均設(shè)置三次重復(fù)實驗，結(jié)果取平均值。青霉素、鏈霉素和胰蛋白酶-EDTA購自GIBCO公司。Trizol購自美國Invitrogen公司，Oligo dT、M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶、Taq DNA聚合酶、dNTP和RNA酶抑制劑購自日本Takara公司。小鼠抗人foxa2單克隆抗體、小鼠抗人Insulin單克隆抗體購自美國Santa Cruz公司。山羊抗人Soxl7單克隆抗體、小鼠抗人pdxl單克隆抗體、小鼠抗人ngn3單克隆抗體購自美國R&D公司。兔抗人C-肽多克隆抗體購自英國ABcam公司。異硫氰酸標記的山羊抗小鼠IgG、羅丹明標記的山羊抗小鼠IgG、羅丹明標記的山羊抗兔IgG購自北京中杉金橋公司。羅丹明標記的小鼠抗山羊IgG:購自北京中杉金橋公司。KRBH緩沖液:120mM NaCl、5mM KC1、2.5mM CaCl2U.1mM MgCl2,25mM NaHC03、0.1%(質(zhì)量百分含量)BSA，其余為IOmM HEPES緩沖液。實施例1、培養(yǎng)基的制備DMEM/F12培養(yǎng)基(又稱DF12培養(yǎng)基)和高糖DMEM培養(yǎng)基購自GIBCO公司。胎牛血清(FCS)購自GIBCO公司。尼克酰胺均購自Sigma公司。谷氨酰胺:GIBC0公司，產(chǎn)品目錄號為25030-081。維甲酸購自Sigma公司，產(chǎn)品目錄號為R2625。人活化素A (Activin
A):英國 Pepro Tech 公司，產(chǎn)品目錄號為 120-14。EGF(epidermal growth factor,表皮細胞生長因子):Pepro Tech 公司，產(chǎn)品目錄號為 100-15。bFGF(basic fibroblast growthfactor,堿性成纖維細胞生長因子):Sigma公司，產(chǎn)品目錄號為F0291。exendin-4:Sigma公司，產(chǎn)品目錄號為E7144。B27:GIBC0公司，產(chǎn)品目錄號為17504-044。N2:GIBC0公司，產(chǎn)品目錄號為17502-048。非必需氨基酸:GIBC0公司，產(chǎn)品目錄號為11140。
培養(yǎng)基由高糖DMEM培養(yǎng)基和溶質(zhì)組成；所述溶質(zhì)及其在培養(yǎng)基A中的濃度如下:5ml/L 胎牛血清和 5ng/mL activin A。培養(yǎng)基B由DMEM/F12培養(yǎng)基和溶質(zhì)組成；所述溶質(zhì)及其在培養(yǎng)基B中的濃度如下:lCT5mol/L維甲酸、20ng/ml EGF、20ng/ml bFGF、2mmol/L谷氨酰胺、體積濃度為I %的非必需氨基酸和體積濃度為2%的B27。培養(yǎng)基C由高糖DMEM培養(yǎng)基和溶質(zhì)組成；所述溶質(zhì)及其在培養(yǎng)基C中的濃度如下:5ml/L 胎牛血清、20ng/ml exendin-4、10ng/ml activin A、lOmmol/L 尼克酸胺、體積濃度為2 %的B27和體積濃度為I %的N2。實施例2、人胰島素分泌細胞的序貫誘導(dǎo)培養(yǎng)(培養(yǎng)基組合甲的應(yīng)用)一、制備第3代間充質(zhì)干細胞1、無菌收集離體臍帶(來源為人)，在生物安全柜中剪取約IOcm長的臍帶，用細胞洗滌液清洗血污；用解剖刀去除外被羊膜、2條臍靜脈和I條臍動脈，得到華爾通氏膠(動靜脈之間的胚胎粘液樣結(jié)締組織)。2、將華爾通氏膠剪碎成肉糜狀，轉(zhuǎn)移到離心管中，用0.75g/LII型膠原酶消化2_3小時，用100目篩網(wǎng)過濾并收集濾液，室溫1200rpm離心10分鐘，收集細胞。3、將步驟2的細胞在37°C、50ml/L CO2、空氣相對濕度為95%的培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，當(dāng)細胞達70% -80%匯合時，用lg/L胰蛋白酶(Gibco公司)常規(guī)消化，細胞按照1: 3進行傳代，得到第I代間充質(zhì)細胞。4、將第I代間充質(zhì)細 胞在37°C、50ml/L CO2、空氣相對濕度為95%的培養(yǎng)箱中國進行培養(yǎng)，達70%-80%匯合，用D-Hank’s液洗2遍，用lg/L胰蛋白酶(Gibco公司)常規(guī)消化，細胞按照1: 3進行傳代，得到第2代間充質(zhì)細胞。5、將第2代間充質(zhì)細胞在37°C、50ml/L CO2、空氣相對濕度為95%的培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，達70% -80%匯合，用D-Hank’s液洗2遍，然后用lg/L的胰蛋白酶(Gibco公司)常規(guī)消化，室溫1200rpm離心6分鐘，收集細胞。6、將步驟5的細胞在37°C、50ml/L CO2、空氣相對濕度為95%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4_6小時，待細胞貼壁后棄除培養(yǎng)基，用D-Hank’ s洗2遍，記作第3代間充質(zhì)干細胞。二、采用培養(yǎng)基組合甲進行誘導(dǎo)培養(yǎng)1、第一階段的培養(yǎng)(I)在6孔板中加入培養(yǎng)基A，每孔2000微升。(2)在步驟(I)的6孔板中接種第3代間充質(zhì)干細胞(使其在培養(yǎng)基中的濃度為5父105個/!111)，在371:、501111/1 CO2、空氣相對濕度為95%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5天(每2天吸棄上清并加入2000微升新的培養(yǎng)基A)。2、第二階段的培養(yǎng)吸棄步驟I的6孔板中的上清，加入培養(yǎng)基B，每孔2000微升，在37°C、50ml/LC02、空氣相對濕度為95%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6天(每2天吸棄上清并加入2000微升新的培養(yǎng)基B)。3、第三階段的培養(yǎng)吸棄步驟2的6孔板中的上清，加入培養(yǎng)基C，每孔2000微升，在37°C、50ml/LC02、空氣相對濕度為95%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)8天(每2天吸棄上清并加入2000微升新的培養(yǎng)基C)，室溫1200rpm離心6分鐘，收集細胞(沉淀)。三、誘導(dǎo)效果的鑒定1、第3代間充質(zhì)干細胞的免疫表型測定步驟一得到的第3代間充質(zhì)干細胞的細胞形態(tài)見圖1。用間接免疫熒光法檢測第3代間充質(zhì)干細胞的表型，用異硫氰酸熒光素(FITC)標記的小鼠抗人 CD29、CD34、CD44、CD73、CD90、CD105、CD106, CDl 17、Flk-1、HLA-ABC 和HLA-DR抗體(抗體均購自BD公司)標記后進行流式檢測，流式細胞儀為ACXURI C6 (BectonDickinson)。結(jié)果見圖2，橫坐標表示細胞熒光強度，縱坐標表示細胞數(shù)；P2表示所選細胞群體。表型結(jié)果顯示，第3代間充質(zhì)干細胞的⑶29、⑶44、CD73、⑶90、⑶105、Flk-l和HLA-ABC均為陽性，⑶34、⑶106、⑶117和HLA-DR分子均為陰性。2、人間充質(zhì)干細胞誘導(dǎo)分化為限定性內(nèi)胚層細胞的鑒定(I)形態(tài)鑒定在培養(yǎng)基A中培養(yǎng)6天后細胞達80% -90%匯合，培養(yǎng)過程中細胞的形態(tài)變化如下:培養(yǎng)1-2天，細胞基本為梭形，少數(shù)呈鵝卵石樣上皮細胞形態(tài)，梭形細胞的百分比大于90% ;培養(yǎng)4-6天后，細胞體積明顯增大，排列緊密，梭形細胞比例減少，多數(shù)細胞呈現(xiàn)鵝卵石樣上皮細胞形態(tài)，鵝卵石樣細胞的百分比大于90%，在培養(yǎng)基A中培養(yǎng)4天的細胞見圖3。

(2)免疫熒光染色鑒定將步驟二的I中培養(yǎng)5天的細胞(將第3代間充質(zhì)干細胞作為對照)進行免疫熒光染色，檢測限定性內(nèi)胚層標志Foxa2和Soxl7的表達情況。檢測Foxa2的具體方法如下:細胞以80%冰乙醇固定，PBS清洗后以含1% BSA的PBST緩沖液封閉；然后用小鼠抗人Foxa2單克隆抗體(工作濃度為1: 50稀釋)作為一抗室溫孵育I小時；用PBS緩沖液清洗后，再以異硫氰酸(綠色熒光)標記的山羊抗小鼠IgG作為二抗室溫孵育30分鐘；用PBS緩沖液清洗后用Hoechst 33342染色液(Sigma)復(fù)染細胞核(蘭色熒光)，在熒光顯微鏡下觀察(Olympus)。第3代間充質(zhì)干細胞均不顯示綠色熒光，為陰性結(jié)果。采用培養(yǎng)基A誘導(dǎo)培養(yǎng)后的細胞90%以上顯示綠色熒光。檢測Soxl7的具體方法同F(xiàn)oxa2的具體方法，差別僅在于采用山羊抗人Soxl7單克隆抗體(工作濃度為1: 100稀釋)作為一抗，采用羅丹明(紅色熒光)標記的小鼠抗山羊IgG作為二抗。第3代間充質(zhì)干細胞均不顯示紅色熒光，為陰性結(jié)果。采用培養(yǎng)基A誘導(dǎo)培養(yǎng)后的細胞90%以上顯示紅色熒光。結(jié)果見圖4 (A為采用培養(yǎng)基A誘導(dǎo)培養(yǎng)后的細胞，B為第3代間充質(zhì)干細胞)。結(jié)果表明，采用培養(yǎng)基A誘導(dǎo)培養(yǎng)后大部分細胞為Foxa2和Soxl7陽性。(3)實時定量PCR分析取步驟二的I中培養(yǎng)5天的細胞(將第3代間充質(zhì)干細胞作為對照)，提取總RNA并反轉(zhuǎn)錄為cDNA，通過實時定量PCR鑒定Foxa2基因和Soxl7基因的表達情況。采用人GAPDH作為各基因的對照，所用的引物如下:用于擴增Foxa2基因的引物為:上游引物:5’-CTGAGCGAGATCTACCAGTGGA-3，；
下游引物:5’ -CAGTCGTTGAAGGAGAGCGAGT-3 ’。用于擴增Soxl7基因的引物為:上游引物:5，-GCATGACTCCGGTGTGAATCT-3，；下游引物:5，-TCACACGTCAGGATAGTTGCAGT-3，。用于擴增GAPDH的引物為:上游引物:5，-GGTCACCAGGGCTGCTTTTA-3，；下游引物:5’ -GAGGGATCTCGCTCCTGGA-3 ’。采用Λ ,CT法計算各基因的相對表達量。以第3代間充質(zhì)干細胞的foxa2基因(或soxl7基因)的表達量為1，計算采用培養(yǎng)基A誘導(dǎo)培養(yǎng)后的細胞中各個基因的相對表達量。采用培養(yǎng)基A誘導(dǎo)培·養(yǎng)后的細胞中，foxa2基因的相對表達量為10.80，soxl7基因的相對表達量為4.77。結(jié)果見圖5。以上鑒定結(jié)果表明，采用培養(yǎng)基A誘導(dǎo)培養(yǎng)后的細胞主要為人限定性內(nèi)胚層細胞(表達限定性內(nèi)胚層細胞的特異性標志基因，并顯示限定性內(nèi)胚層細胞的形態(tài))。3、限定性內(nèi)胚層細胞分化為胰腺干細胞、胰腺祖細胞和β前體細胞的鑒定(I)形態(tài)鑒定在培養(yǎng)基B中培養(yǎng)6天，培養(yǎng)過程中細胞的形態(tài)變化如下:細胞逐漸變小并呈團狀聚集狀態(tài)。在培養(yǎng)基B中培養(yǎng)6天的細胞見圖6。(2)免疫熒光染色鑒定將步驟二的2中培養(yǎng)6天的細胞(將第3代間充質(zhì)干細胞作為對照)進行免疫熒光染色，分別檢測胰腺干細胞標志Pdxl和胰腺內(nèi)分泌祖細胞標志Ngn3的表達情況。檢測Pdxl的具體方法同F(xiàn)oxa2的具體方法，差別僅在于采用小鼠抗人Pdxl單克隆抗體(工作濃度為1: 100稀釋)作為一抗。第3代間充質(zhì)干細胞均不顯示綠色熒光，為陰性結(jié)果。采用培養(yǎng)基B誘導(dǎo)培養(yǎng)后的細胞70%以上顯示綠色熒光。檢測Ngn3的具體方法同F(xiàn)oxa2的具體方法，差別僅在于采用小鼠抗人Ngn3單克隆抗體(工作濃度為1: 100稀釋)作為一抗。第3代間充質(zhì)干細胞均不顯示綠色熒光，為陰性結(jié)果。采用培養(yǎng)基B誘導(dǎo)培養(yǎng)后的細胞70%以上顯示綠色熒光。結(jié)果見圖7 (A為采用培養(yǎng)基B誘導(dǎo)培養(yǎng)后的細胞，B為第3代間充質(zhì)干細胞)。結(jié)果表明，采用培養(yǎng)基B誘導(dǎo)培養(yǎng)后大部分細胞為Pdxl和Ngn3陽性。(3)實時定量PCR分析取步驟二的2中培養(yǎng)6天的細胞(將第3代間充質(zhì)干細胞作為對照)，提取總RNA并反轉(zhuǎn)錄為cDNA，通過實時定量PCR分別鑒定Pdxl基因、Ngn3基因和Pax4基因(胰腺內(nèi)分泌祖細胞標志)的表達情況。采用人GAPDH作為各基因的對照，所用的引物如下:用于擴增Pdxl的引物為:上游引物:5’ -TACTGGATTGGCGTTGTTTGTGGC-3，；下游引物:5’ -AGGGAGCCTTCCAATGTGTATGGT-3 ’。用于擴增Ngn3的引物為:上游引物:5’ -TAAGAGCGAGTTGGCACTGAGCAA-3 ’ ；下游引物:5’ -TTTGAGTCAGCGCCCAGATGTAGT-3，。用于擴增Pax4的引物為:
上游引物:5’-AATTCCCTGGACTCAGGACTGCTT-3’ ；下游引物:5，-TTCCAAGCCATACAGTAGTGGGCA-3，。 用于擴增GAPDH的引物為:上游引物:5’-GGTCACCAGGGCTGCTTTTA-3’ ；下游引物:5’ -GAGGGATCTCGCTCCTGGA-3，。采用“CT法計算各基因的相對表達量。以第3代間充質(zhì)干細胞的Pdxl基因(或Ngn3基因或Pax4基因)的表達量為1，計算采用培養(yǎng)基B誘導(dǎo)培養(yǎng)后的細胞中各個基因的相對表達量。采用培養(yǎng)基B誘導(dǎo)培養(yǎng)后的細胞中，pdxl基因的相對表達量為10.72，ngn3基因的相對表達量為14.07，pax4基因的相對表達量為5.18。結(jié)果見圖8。結(jié)果表明，采用培養(yǎng)基B培養(yǎng)后，人間充質(zhì)干細胞來源的限定性內(nèi)胚層細胞表達胰腺干細胞基因Pdxl、胰腺內(nèi)分泌祖細胞基因Ngn3和胰腺內(nèi)分泌祖細胞基因Pax4。以上鑒定結(jié)果表明，采用培養(yǎng)基B誘導(dǎo)培養(yǎng)后呈團狀聚集狀態(tài)的細胞即為胰腺干細胞/胰腺祖細胞(該細胞表達胰腺干細胞/胰腺祖細胞特異性標志基因，并顯示出團狀聚集狀態(tài)，且該細胞進一步誘導(dǎo)可獲得胰島素分泌細胞)。4、胰腺干細胞和胰腺祖細胞體外分化為胰島素分泌細胞的鑒定(I)形態(tài)鑒定在培養(yǎng)基C中培養(yǎng)8天后細胞呈團狀聚集狀態(tài)更加明顯，見圖9。(2)免疫熒光染色鑒定

將步驟二的3中培養(yǎng)8天的細胞(將第3代間充質(zhì)干細胞作為對照)進行免疫熒光染色，檢測胰島素分泌細胞標志Insulin和C-peptide的表達情況。檢測Insulin的具體方法同F(xiàn)oxa2的具體方法，差別僅在于采用小鼠抗人Insulin單克隆抗體(工作濃度為1: 50稀釋)作為一抗，采用羅丹明(紅色熒光)標記的山羊抗小鼠IgG作為二抗。第3代間充質(zhì)干細胞均不顯示紅色熒光，為陰性結(jié)果。采用培養(yǎng)基C誘導(dǎo)培養(yǎng)后的細胞95%以上顯示紅色熒光。 檢測C-peptide的具體方法同F(xiàn)oxa2的具體方法，差別僅在于采用兔抗人C-p印tide多克隆抗體(工作濃度為1: 100稀釋)作為一抗，采用羅丹明(紅色熒光)標記的山羊抗兔IgG作為二抗。第3代間充質(zhì)干細胞均不顯示紅色熒光，為陰性結(jié)果。采用培養(yǎng)基C誘導(dǎo)培養(yǎng)后的細胞95%以上顯示紅色熒光。結(jié)果見圖10 (A為采用培養(yǎng)基C誘導(dǎo)培養(yǎng)后的細胞，B為第3代間充質(zhì)干細胞)。結(jié)果表明，采用培養(yǎng)基C誘導(dǎo)培養(yǎng)后大部分細胞為Insulin和C-peptide陽性。(3)實時定量PCR分析取步驟二的3中培養(yǎng)8天的細胞(將第3代間充質(zhì)干細胞作為對照)，提取總RNA并反轉(zhuǎn)錄為cDNA，通過實時定量PCR鑒定Insulin基因和Glut-2基因的表達情況。采用人GAPDH作為各基因的對照，所用的引物如下:用于擴增Insulin基因的引物為:上游引物:5’-AGAGGCCATCAAGCAGATCACTGT-3’ ；下游引物:5，-CACAGGTGTTGGTTCACAAAGGCT-3，。用于擴增Glut-2基因的引物為:上游引物:5，-AGCTGCATTCAGCAATTGGACCTG-3，；
下游引物:5，-ATGTGAACAGGGTAAAGGCCAGGA-3，。 用于擴增GAPDH的引物為:上游引物:5’-GGTCACCAGGGCTGCTTTTA-3’ ；下游引物:5’ -GAGGGATCTCGCTCCTGGA-3，。采用“CT法計算各基因的相對表達量。以第3代間充質(zhì)干細胞的Insulin基因(或Glut-2基因)的表達量為1，計算采用培養(yǎng)基C誘導(dǎo)培養(yǎng)后的細胞中各個基因的相對表達量。采用培養(yǎng)基C誘導(dǎo)培養(yǎng)后的細胞中，insulin基因的相對表達量為6.31，Glut-2基因的相對表達量為7.80。結(jié)果見圖11。結(jié)果表明，采用培養(yǎng)基C培養(yǎng)后，脂肪間充質(zhì)干細胞來源的胰腺干/祖細胞表達胰腺內(nèi)分泌功能細胞相關(guān)基因Insulin和Glut-2。(4)胰島素分泌功能檢測①胰島素測定將步驟二的3中培養(yǎng)8天的細胞(將第3代間充質(zhì)干細胞作為對照)進行如下實驗:針對每個細胞孔，取所有培養(yǎng)上清，并對該孔內(nèi)的細胞進行計數(shù)。將培養(yǎng)上清2000rpm離心lOmin，取上清液并用胰島素ELISA檢測試劑盒(EZHIASF_14K，MILLIP0RE)檢測胰島素含量(具體操作按照試劑盒說明書進行)。每5X IO5個采用培養(yǎng)基C誘導(dǎo)后的細胞分泌得到的胰島素總量為(346.3739 ±32.51489) μ U/ml,第3代間充質(zhì)干細胞分泌得到的胰島素總量為(17.69± 1.462954) μ U/ml (P < 0.01)。結(jié)果見圖12 (A為采用培養(yǎng)基C-1誘導(dǎo)培養(yǎng)后的細胞，B為第3代間充質(zhì)干細 胞)。②細胞C-肽分泌功能測定將步驟二的3中培養(yǎng)8天的細胞進行如下實驗:將5X IO5個細胞用PBS緩沖液洗滌3遍后，在ImL KRBH緩沖液中孵育6小時(3-6小時均可)，然后將細胞置于ImL含5.5mM葡萄糖的KRBH緩沖液中孵育I小時，收集上清液(溶液甲)，再然后將細胞置于ImL含22mM葡萄糖的KRBH緩沖液中孵育I小時，收集上清液(上清液乙)。使用C-肽ELISA試劑盒(EZHCP-20K，MILLIPORE)分別檢測溶液甲和溶液乙中C-肽的含量(具體測定方法參考試劑盒說明書)。上清液甲中C-肽釋放水平為(195.10±8.88)pmol/L/h(P<0.01)，該水平代表胰島素從頭合成量。上清液乙中C-肽釋放水平達到(340.99±7.91)pmol/L/h(P < 0.01)。結(jié)果見圖13。結(jié)果表明，采用培養(yǎng)基C-1誘導(dǎo)后的細胞在體外具有對葡萄糖應(yīng)答的胰島素分泌功能。結(jié)果表明，采用培養(yǎng)基C-1誘導(dǎo)培養(yǎng)后的細胞為胰島素分泌細胞(該細胞表達胰島素分泌細胞特異性標志基因，并顯示出體外分泌胰島素的能力及對葡萄糖的反應(yīng)性)。
權(quán)利要求
1.將間充質(zhì)干細胞誘導(dǎo)為胰島素分泌細胞的培養(yǎng)基組合物，由培養(yǎng)基A、培養(yǎng)基B和培養(yǎng)基C組成； 所述培養(yǎng)基A由動物細胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基和溶質(zhì)組成；所述溶質(zhì)及其在所述培養(yǎng)基A中的濃度如下-A- 75ml/L-5.25ml/L 胎牛血清和 4.75ng/mL_5.25ng/mL activin A ； 所述培養(yǎng)基B由動物細胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基和溶質(zhì)組成；所述溶質(zhì)及其在所述培養(yǎng)基B中的濃度如下:0.95 X 10 5mol/L_l.05 X 10 5mol/L 維甲酸、19ng/ml_21ng/ml EGF、19ng/ml-21ng/ml bFGF、l.9mmol/L-2.lmmol/L 谷氨酸胺、體積濃度為 0.95 % -1.05% 的非必需氨基酸和體積濃度為1.9% -2.1%的B27 ； 所述培養(yǎng)基C由動物細胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基和溶質(zhì)組成；所述溶質(zhì)及其在所述培養(yǎng)基C中的濃度如下:4.5ml/L-5.5ml/L胎牛血清、19ng/ml_21ng/ml exendin_4、9.5ng/ml_10.5ng/mlactivin A、9.5mmol/L-10.5mmol/L尼克酸胺、體積濃度為1.9% -2.1%的B27和體積濃度為 0.95% -1.05%的 N2。
2.如權(quán)利要求1所述的培養(yǎng)基組合物，其特征在于: 所述培養(yǎng)基A由高糖DMEM培養(yǎng)基和溶質(zhì)組成；所述溶質(zhì)及其在培養(yǎng)基A中的濃度如下:5ml/L 胎牛血清和 5ng/mL activin A ； 所述培養(yǎng)基B由DMEM/F12培養(yǎng)基和溶質(zhì)組成；所述溶質(zhì)及其在培養(yǎng)基B中的濃度如下:lCT5mol/L維甲酸、20ng/ml EGF、20ng/ml bFGF、2mmol/L谷氨酰胺、體積濃度為I %的非必需氨基酸和體積濃度為2%的B27 ； 所述培養(yǎng)基C由高糖DMEM培養(yǎng)基和溶質(zhì)組成；所述溶質(zhì)及其在培養(yǎng)基C中的濃度如下:5ml/L 胎牛血清、20ng/ml exendin-4、10ng/ml activin A、lOmmol/L 尼克酸胺、體積濃度為2 %的B27和體積濃度為I %的N2。
3.將間充質(zhì)干細胞誘導(dǎo)為胰島素分泌細胞方法，是將間充質(zhì)干細胞依次用權(quán)利要求1或2所述的培養(yǎng)基組合物中的所述培養(yǎng)基A、所述培養(yǎng)基B和所述培養(yǎng)基C進行培養(yǎng)，得到胰島素分泌細胞。
4.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于:所述方法包括如下步驟: (1)將間充質(zhì)干細胞接種于所述培養(yǎng)基A中，培養(yǎng)4-6天； (2)將完成步驟(I)的細胞轉(zhuǎn)接于所述培養(yǎng)基B中，培養(yǎng)6-8天； (3)將完成步驟(2)的細胞轉(zhuǎn)接于所述培養(yǎng)基C中，培養(yǎng)7-10天，得到胰島素分泌細胞。
5.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于:所述步驟(I)中，所述間充質(zhì)干細胞在所述培養(yǎng)基A中的初始濃度為2 X IO5個/ml-1 X IO6個/ml。
6.權(quán)利要求1或2所述的培養(yǎng)基組合物在將間充質(zhì)干細胞誘導(dǎo)為胰島素分泌細胞中的應(yīng)用。
7.將限定性內(nèi)胚層細胞誘導(dǎo)為胰腺干細胞和/或胰腺祖細胞的培養(yǎng)基，為培養(yǎng)基B;所述培養(yǎng)基B由動物細胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基和溶質(zhì)組成；所述溶質(zhì)及其在所述培養(yǎng)基B中的濃度如下:0.95X lCT5mol/L-l.05X lCT5mol/L 維甲酸、19ng/ml_21ng/ml EGF> 19ng/ml_21ng/mlbFGF、l.9mmol/L-2.lmmol/L谷氨酰胺、 體積濃度為0.95% -1.05%的非必需氨基酸和體積濃度為 1.9% -2.1% 的 B27。
8.將間充質(zhì)干細胞誘導(dǎo)為胰腺干細胞和/或胰腺祖細胞的培養(yǎng)基組合物，由培養(yǎng)基A和培養(yǎng)基B組成； 所述培養(yǎng)基A由動物細胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基和溶質(zhì)組成；所述溶質(zhì)及其在所述培養(yǎng)基A中的濃度如下-A- 75ml/L-5.25ml/L 胎牛血清和 4.75ng/mL_5.25ng/mL activin A ； 所述培養(yǎng)基B由動物細胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基和溶質(zhì)組成；所述溶質(zhì)及其在所述培養(yǎng)基B中的濃度如下:0.95 X 10 5mol/L_l.05 X 10 5mol/L 維甲酸、19ng/ml_21ng/ml EGF、19ng/ml-21ng/ml bFGF、l.9mmol/L-2.lmmol/L 谷氨酸胺、體積濃度為 0.95 % -1.05% 的非必需氨基酸和體積濃度為1.9% -2.1%的B27。
9.將限定性內(nèi)胚層細胞誘導(dǎo)為胰島素分泌細胞的培養(yǎng)基組合物，由培養(yǎng)基B和培養(yǎng)基C組成； 所述培養(yǎng)基B由動物細胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基和溶質(zhì)組成；所述溶質(zhì)及其在所述培養(yǎng)基B中的濃度如下:0.95 X 10 5mol/L_l.05 X 10 5mol/L 維甲酸、19ng/ml_21ng/ml EGF、19ng/ml-21ng/ml bFGF、l.9mmol/L-2.lmmol/L 谷氨酸胺、體積濃度為 0.95 % -1.05% 的非必需氨基酸和體積濃度為1.9% -2.1%的B27 ； 所述培養(yǎng)基C由動物細胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基和溶質(zhì)組成；所述溶質(zhì)及其在所述培養(yǎng)基C中的濃度如下:4.5ml/L-5.5ml/L胎牛血清、19ng/ml_21ng/ml exendin_4、9.5ng/ml_10.5ng/mlactivin A、9.5mmol/L-10.5mmol/L尼克酸胺、體積濃度為1.9% -2.1%的B27和體積濃度為 0.95% -1.05%的 N2。
10.權(quán)利要求7所述培養(yǎng)基在將限定性內(nèi)胚層細胞誘導(dǎo)為胰腺干細胞和/或胰腺祖細胞中的應(yīng)用，或，權(quán)利要求8所述培養(yǎng)基組合物在將間充質(zhì)干細胞誘導(dǎo)為胰腺干細胞和/或胰腺祖細胞中的應(yīng)用，或 ，權(quán)利要求9所述培養(yǎng)基組合物在將限定性內(nèi)胚層細胞誘導(dǎo)為胰島素分泌細胞中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種將間充質(zhì)干細胞誘導(dǎo)為胰島素分泌細胞的培養(yǎng)基組合物，由培養(yǎng)基A、B和C組成；培養(yǎng)基A的溶質(zhì)及其濃度如下4.75-5.25ml/L胎牛血清和4.75-5.25ng/mL activin A；培養(yǎng)基B的溶質(zhì)及其濃度如下0.95×10-5-1.05×10-5mol/L維甲酸、19-21ng/ml EGF、19-21ng/ml bFGF、1.9-2.1mmol/L谷氨酰胺、0.95-1.05％非必需氨基酸和1.9-2.1％B27；培養(yǎng)基C的溶質(zhì)及其濃度如下4.5-5.5ml/L胎牛血清、19-21ng/ml exendin-4、9.5-10.5ng/ml activin A、9.5-10.5mmol/L尼克酰胺、1.9-2.1％B27和0.95-1.05％N2。本發(fā)明的誘導(dǎo)培養(yǎng)方法，適合于各種組織來源的間充質(zhì)干細胞，該誘導(dǎo)培養(yǎng)方法無病毒導(dǎo)入、易操作、效率高。
文檔編號C12N5/074GK103184186SQ20111044674
公開日2013年7月3日 申請日期2011年12月28日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月28日
發(fā)明者趙春華, 李晶 申請人:中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所