專利名稱：一種細(xì)胞分離介質(zhì)及細(xì)胞分離方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種復(fù)方細(xì)胞分離介質(zhì)及細(xì)胞分離方法。
背景技術(shù)：
細(xì)胞治療技術(shù)如免疫細(xì)胞治療、干細(xì)胞治療極大的推動(dòng)了現(xiàn)代醫(yī)學(xué)技術(shù)的發(fā)展。 在細(xì)胞治療過程中，目標(biāo)細(xì)胞的采集與分離是的一個(gè)重要步驟。高純度目標(biāo)細(xì)胞的獲取是得到優(yōu)良質(zhì)量的細(xì)胞終產(chǎn)品即效應(yīng)細(xì)胞的前提。在細(xì)胞治療過程中，除了需要用到治療用的效應(yīng)細(xì)胞外，還有一類為獲取效應(yīng)細(xì)胞而用到的輔助產(chǎn)品即細(xì)胞治療輔料，用于效應(yīng)細(xì)胞的分離、生長(zhǎng)、存儲(chǔ)、運(yùn)輸及輸注等諸多環(huán)節(jié)，由于不在細(xì)胞治療的終產(chǎn)品中出現(xiàn)，其重要性通常被忽略。密度梯度離心法(Density Gradient Centrifugation)作為一種傳統(tǒng)的分離技術(shù)，用于細(xì)胞分離已經(jīng)存在了半個(gè)世紀(jì)?；诿芏忍荻入x心法的細(xì)胞分離介質(zhì)產(chǎn)品即細(xì)胞治療輔料，例如GE公司的Ficoll-PaquePLUS，已成為利用密度梯度離心法進(jìn)行細(xì)胞分離的常規(guī)介質(zhì)，特別是用于淋巴細(xì)胞的分離，其說明書推薦的相應(yīng)操作步驟也已成為本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的操作步驟。一般步驟包括在離心管中加入一定體積的淋巴細(xì)胞分離介質(zhì)，待分離的血液樣品平鋪于分離介質(zhì)上，接著對(duì)其在恒定溫度下進(jìn)行低速離心。樣品中各細(xì)胞群將由于密度差異分布在離心管的不同部位，例如，如果分離介質(zhì)具有與目標(biāo)細(xì)胞群相同的密度，目標(biāo)細(xì)胞將富集在分離介質(zhì)層與樣本層的交界面，用吸管將該層細(xì)胞吸出就達(dá)到了對(duì)目標(biāo)細(xì)胞群的分離。由于Ficoll-Paque PLUS本身并不在終產(chǎn)物中出現(xiàn)，其屬于一種典型的細(xì)胞治療輔料。淋巴細(xì)胞作為一種效應(yīng)細(xì)胞，廣泛存在于人外周血液、骨髓或人臍帶血中。高純度的淋巴細(xì)胞的獲取對(duì)于疾病的細(xì)胞學(xué)診斷、成分輸血、治療用細(xì)胞產(chǎn)品的制備等具有非常重要的意義。淋巴細(xì)胞分離介質(zhì)是具有恒定密度、滲透壓及PH值的混合體系。國(guó)際上傳統(tǒng)的分離介質(zhì)包括 GE Healthcare 公司的產(chǎn)品 Ficol 1-Paque PLUS、Ficol 1-Paque PREMIUM ；Axis-Shield 公司的產(chǎn)品 Lymphopi^p ；Sigma 公司的產(chǎn)品 Histopaque 1077 ;以及Mediatech 公司的產(chǎn)品Cellgro Lymphocyte Separation Medium(LSM)等。上述商品化的淋巴細(xì)胞分離介質(zhì)以Ficoll 400(聚蔗糖400)和泛影酸鈉為主要成分，密度在1. 073g/ cm3 和 1. 084g/cm3 之間，滲透壓在 ^OmOsmol/kg 和 3IOmOsmol/kg 之間，pH 在 6 和 9 之間。 為了提高產(chǎn)品的技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)以適應(yīng)細(xì)胞治療特殊行業(yè)要求，GE Healthcare公司在2005年推出的產(chǎn)品Ficoll-Paque PREMIUM不僅依據(jù)IS013485 :2003將生產(chǎn)在受到嚴(yán)格控制的環(huán)境中進(jìn)行，更是根據(jù)歐洲GMP附件1中“無(wú)菌醫(yī)藥產(chǎn)品的制造”和美國(guó)藥典USP<1043>關(guān)于細(xì)胞治療輔料的建議，將內(nèi)毒素控制在了 0. 12EU/ml的范圍內(nèi)，這個(gè)標(biāo)準(zhǔn)符合了靜脈注射用藥物對(duì)內(nèi)毒素含量的要求。盡管如此，截至目前全球仍沒有一種分離介質(zhì)宣稱可以用于臨床治療用途；上述產(chǎn)品的包裝說明書和使用指導(dǎo)中均明確指出該產(chǎn)品的適用范圍為研究而非體外診斷和治療用途。除法規(guī)因素外，產(chǎn)品特性不明確是限制其臨床使用的另一個(gè)重要因素。在淋巴細(xì)胞的工業(yè)化生產(chǎn)過程中，細(xì)胞分離介質(zhì)是僅次于培養(yǎng)基外，與細(xì)胞接觸時(shí)間最久的外源物質(zhì)。在標(biāo)準(zhǔn)的分離過程中，細(xì)胞必須與分離液接觸15-45分鐘的時(shí)間，以達(dá)到最佳分離效果。在這段時(shí)間內(nèi)，分離液中各組分可能通過被動(dòng)擴(kuò)散、細(xì)胞的主動(dòng)運(yùn)輸、胞吞/胞飲作用、表面黏附等途徑，在細(xì)胞內(nèi)部蓄積，且此部分蓄積成分，很難通過常規(guī)的洗滌從分離得到的目標(biāo)細(xì)胞(例如淋巴細(xì)胞)中完全去除。盡管常規(guī)理化指標(biāo)及菌落、內(nèi)毒素等生化指標(biāo)外已達(dá)到較高標(biāo)準(zhǔn)，但原料組分的不確定性給細(xì)胞分離介質(zhì)的臨床應(yīng)用帶來(lái)了極大的障礙。例如，F(xiàn)icoll-Paque 是一套密度為1. 077g/cm3的均質(zhì)混合體系，每IOOml混合液中含有5. 7g 聚蔗糖 400 (Polysaccharide 400，即 Ficoll400)、9g 泛影酸鈉(sodium diatrizoate)、0· 0231g EDTA(calcium disodium ethylenediamintetraacetic)。體系中的泛影酸鈉和EDTA分別被用于血管造影及治療血鉛中毒，其藥學(xué)相關(guān)數(shù)據(jù)已被闡明，安全性得到了保證。然而，F(xiàn)icoll-Paque 臨床應(yīng)用的最大障礙源于體系中的主體成分聚蔗糖 400 (Ficoll 400), Ficoll 400并無(wú)臨床應(yīng)用，其毒理學(xué)、藥物代謝動(dòng)力學(xué)特性均沒有相關(guān)數(shù)據(jù)支撐。密度梯度離心法分離淋巴細(xì)胞已成為生物醫(yī)學(xué)諸多領(lǐng)域中不可缺少的試驗(yàn)技術(shù)之一，而分離介質(zhì)的配方選擇是密度梯度離心法中的技術(shù)核心。早在1968年B0yum等人逐步建立了以Ficoll 400和甲泛影鈉(2，4，6-三碘-3-乙酰氨基-4-(N-甲乙酰氨基) 苯甲酸鈉)為主配方的混合分離體系(B0yum,A. Scand J Clin Lab Invest 21Suppl， 1968,97 :77-89 ； B0yum, A. Scand J Clin Lab Invest 21Suppl，1968，97 :31-50 ; B0yum,A. Scand J Clin Lab Invest 21Suppl，1976，5 :9-15 ；)，同時(shí)開發(fā)了密度梯度離心這一簡(jiǎn)單快速的純化細(xì)胞的方法，并成功將它們用于分離人血液樣本中的白細(xì)胞。基于 B0yum等人的先驅(qū)工作成果，許多研究者將Ficoll 400-碘化密度梯度介質(zhì)的混合體系進(jìn)一步完善并最終該確立了利用泛影酸鈉(2，4，6_三碘-3，5-二乙酰氨基苯甲酸鈉)替代甲泛影鈉組成Ficoll 400-泛影酸鈉優(yōu)化體系，該分離介質(zhì)配方在世界范圍內(nèi)廣泛得以應(yīng)用。Ficoll 400和泛影酸鈉的選擇并不是偶然的。Ficoll 400是由蔗糖和環(huán)氧氯丙烷通過化學(xué)合成而得到的高分子量聚合物，可溶于水，其化學(xué)結(jié)構(gòu)高度分支化形成球型，斯托克斯半徑為5nm左右。其化學(xué)結(jié)構(gòu)決定了 Ficoll 400具有分離介質(zhì)適宜的特性，比如相對(duì)密度和特性粘度。Ficoll 400最大水溶液密度可達(dá)1. 23g/cm3(陳培剛，實(shí)驗(yàn)室儀器， 1990,4:9-15)，這已大于血細(xì)胞中密度最大的紅細(xì)胞，因此分離譜廣泛；而特性粘度則較低，為17ml/g，使分離過程更加高效。泛影酸鈉則是一種適宜與Ficoll 400形成低粘度高密度溶液的化合物，在醫(yī)學(xué)上用作X光造影劑。在典型的分離淋巴細(xì)胞的操作中，采用等量的平衡鹽溶液對(duì)抗凝劑(比如肝素、 枸櫞酸鈉)處理過的血樣進(jìn)行稀釋，然后將其小心鋪在裝入離心管的分離介質(zhì)層上，維持界面清晰。在室溫下進(jìn)行短時(shí)低速離心(比如400g，30-40min)后，密度為1. 077g/cm3的淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞由于無(wú)法穿透密度更高的分離介質(zhì)層而在血漿與分離介質(zhì)層交界面處富集，而紅細(xì)胞和粒細(xì)胞則由于密度較大而沉降在離心管底部。因此，淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞將在血漿層和分離介質(zhì)層交界面的細(xì)胞條帶處收獲，繼而通過對(duì)收獲的細(xì)胞洗滌和離心， 以除去少量的血小板、血漿和分離介質(zhì)本身，得到高純度的淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞。在此過程中，F(xiàn)icoll 400還將起到另外的關(guān)鍵性作用，即對(duì)紅細(xì)胞的凝集作用。紅細(xì)胞凝集的分子基礎(chǔ)為紅細(xì)胞的表面電荷。紅細(xì)胞表面分布的唾液酸(Sialic Acid)水解呈負(fù)電性，使紅細(xì)胞表面帶有負(fù)電荷，因此在等滲溶液中，紅細(xì)胞膜周圍會(huì)屏蔽一層帶相反電荷的離子層(雙電層)，并產(chǎn)生細(xì)胞間的靜電斥力。當(dāng)雙電層被大分子的吸附作用所破壞時(shí)，這種靜電斥力也會(huì)被降低從而促使紅細(xì)胞凝集。(李萍，魏巖山，徐維家，等.，中國(guó)檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)與臨床，2001,8(4) :175-176.)紅細(xì)胞對(duì)懸液體系中的大分子有吸附作用，吸附量與大分子的種類和濃度都密切相關(guān)，當(dāng)溶液中含有合適的大小、電荷分布的大分子時(shí)，相鄰紅細(xì)胞將破壞紅細(xì)胞間固有的靜電斥力而出現(xiàn)凝集現(xiàn)象，凝集會(huì)隨著大分子濃度升高而增多，并會(huì)出現(xiàn)飽和現(xiàn)象。一般而言，分子量越大，凝集現(xiàn)象越顯著(盛佳，曾衍鈞，莊逢源，力學(xué)進(jìn)展，1999，四(1) :105-111)，綜上可知Ficoll 400具有較強(qiáng)的這種凝集作用。由于在全血樣品中，紅細(xì)胞比白細(xì)胞的數(shù)量高約1000倍，淋巴細(xì)胞純度和產(chǎn)量在很大程度上依賴于對(duì)紅細(xì)胞去除的有效性，例如，紅細(xì)胞沉降速度過快，一些淋巴細(xì)胞將被非特異性地捕獲進(jìn)入紅細(xì)胞的凝塊之中，導(dǎo)致淋巴細(xì)胞收率降低；而紅細(xì)胞沉降速度過慢，將導(dǎo)致淋巴細(xì)胞產(chǎn)品中的紅細(xì)胞污染，或進(jìn)而通過繼續(xù)延長(zhǎng)的離心操作而導(dǎo)致白細(xì)胞收率降低。因此，高分子-泛影酸鈉分離介質(zhì)體系中的高分子種類選擇是至關(guān)重要的，特別地，其應(yīng)該具有合適的凝集紅細(xì)胞的作用，這種凝集作用必須是使紅細(xì)胞凝集速度適宜的。Ficoll 400用于構(gòu)建整個(gè)體系的密度。Ficoll是一種中性的、高分支化合成蔗糖聚合物，具有高密度、低滲透壓等特點(diǎn)，配制Ficoll-Paque 所使用的Ficoll —般分子量在400kD左右，即Ficoll 400。Ficoll 400在分離中不表現(xiàn)出對(duì)細(xì)胞的毒性，但化學(xué)品安全說明書(MSDQ中的數(shù)據(jù)顯示，慢毒試驗(yàn)中Ficoll 400表現(xiàn)出一定毒性，包括惡心、嘔吐、頭痛甚至昏迷，皮膚嚴(yán)重紅腫、水腫等。更重要是高分子量聚合物通常會(huì)引起血流動(dòng)力學(xué)禾口血液流變學(xué)性質(zhì)的改變(Nadia Antonova,Zdravko Lazarov,Clinical Hemorheology and Microcirculation，2004，30 (3-4) :381-390 ；李福龍，劉艷凱，牛春麗等，中國(guó)臨床康復(fù)，2006，1(K24) :91-93.等)。此外，高分子量聚合物還可能起致敏反應(yīng)，并且分子量越大， 抗原性越強(qiáng)。Ficoll 400還作為半抗原載體，以增強(qiáng)小鼠對(duì)弱抗原的免疫應(yīng)答反應(yīng)，例如 McMasters, P. R. B.等，Immunochemistry, 1977,14 189. ；Inman, J. K. , J. Immunol, 1975, 114 :704. ；Xue, B.等，J. Exp. Med.，1984，159 :103-113. ；DeHeer, D. H.，Edgington, R. S.， Mol. Immunol.，1980，，17 :1231-1236.等。最重要地，由于Ficoll 400本身并非藥用分子， 其藥學(xué)相關(guān)數(shù)據(jù)，尤其是毒理學(xué)、藥物代謝動(dòng)力學(xué)等數(shù)據(jù)尚無(wú)文獻(xiàn)報(bào)道。上述潛在的風(fēng)險(xiǎn)和未知因素的存在導(dǎo)致Ficoll 400必需受到最嚴(yán)格的控制以防進(jìn)入人體。由于分離介質(zhì)不可避免的會(huì)存在最終細(xì)胞產(chǎn)品中，必須有嚴(yán)格的洗脫步驟及殘留量檢測(cè)以證明Ficoll 400降到足夠低的水平；這些步驟提高了成本、拉長(zhǎng)了生產(chǎn)周期， 提高了工業(yè)化細(xì)胞生產(chǎn)的復(fù)雜度。美國(guó)藥典USP<1043>關(guān)于細(xì)胞、基因和組織工程產(chǎn)品輔料的描述中明確將此類缺乏臨床醫(yī)用經(jīng)歷的物料劃分為中等風(fēng)險(xiǎn)(Moderate Risk)范疇， 而將符合治療用藥物和生物制品的物料劃分為低風(fēng)險(xiǎn)(Low Risk)范疇。在細(xì)胞生產(chǎn)過程中，低風(fēng)險(xiǎn)的材料使用具有最高優(yōu)先級(jí)。如果能應(yīng)對(duì)Ficoll 400生物安全性不足的問題， 尋找新的替代，建設(shè)出一套符合USP<1043>要求的低風(fēng)險(xiǎn)的分離體系，將大大提高細(xì)胞治療產(chǎn)業(yè)中細(xì)胞分離這一步驟的安全性和規(guī)范度
發(fā)明內(nèi)容
為了尋求安全性更高，分離效果更優(yōu)的配方，本發(fā)明的一個(gè)主要方面是提供了一種用于單個(gè)核細(xì)胞分離的組合物，由分子量大于40kD的右旋糖酐、藥學(xué)上可接受的羥乙基淀粉與泛影酸鈉或泛影葡胺組成。以分子量大于40kD的右旋糖酐和藥學(xué)上可接受的羥乙基淀粉以組合形式替代淋巴細(xì)胞分離介質(zhì)中高分子Ficoll 400的選擇，而本發(fā)明中分離介質(zhì)的另一種主要原料則為泛影酸鈉或泛影葡胺。這種替代的原因在于，常規(guī)分離介質(zhì)配方中的另一種組分Ficoll 400沒有任何臨床應(yīng)用，原料不確定性大，安全性低，因此常規(guī)分離介質(zhì)難以真正用于臨床并得到法律法規(guī)的認(rèn)可。例如，以細(xì)胞治療為代表的多種臨床應(yīng)用均對(duì)淋巴細(xì)胞分離介質(zhì)有較大的依賴性。作為優(yōu)選，所述分子量大于40kD的右旋糖酐為Dextran 70或Dextran 40。更優(yōu)選地，所述羥乙基淀粉為羥乙基淀粉200/0. 5或羥乙基淀粉130/0. 4。右旋糖酐(Dextran)是一種分支化的葡聚糖，其通過一些乳酸菌合成，典型地包括串珠菌和變形鏈球菌。Dextran分支度大約為5%，其長(zhǎng)度在3 2000kD間變化，分支長(zhǎng)度大約為1 2個(gè)葡萄糖單位長(zhǎng)度。Dextran主鏈通過α _1，6糖苷鍵連接葡萄糖分子，而支鏈則通過α -1，3糖苷鍵相連。斯托克斯半徑在2 27nm之間。Dextran70的斯托克斯半徑為5. 8nm,臨床常用的制劑為6%中分子右旋糖酐含 0. 9%氯化鈉制劑，平均分子量為70kD(60kD IOOkD)，分子量最接近血漿蛋白的重量。其分子的大小范圍較廣，排出復(fù)雜，在血管內(nèi)半衰期約6 他。它能從組織中吸收水分，適用于補(bǔ)充血容量，6%右旋糖酐500ml可增加血漿容量450 500ml，其擴(kuò)容作用可持續(xù) 4h(5 幾)。臨床上主要用于防治低血容量性休克，失血量在總血容量20%以內(nèi)者可全部用右旋糖酐作補(bǔ)充，不需輸血。羥乙基淀粉200/0. 5由高分支支鏈淀粉經(jīng)酸水解、羥乙基化后制得，屬中分子量低取代度羥乙基淀粉，是一種電中性球狀分子。C2位置上的羥乙基基團(tuán)對(duì)血清淀粉酶的降解具有特別強(qiáng)的抵抗力。分子結(jié)構(gòu)與糖原相似，平均分子量(MW = 200kD)，能引起紅細(xì)胞聚集。羥乙基淀粉200/0. 5可增加血漿容量，從而改善心排血量和氧輸送值，可改善低血容量和休克患者的血液動(dòng)力學(xué)和氧輸送；并能夠降低紅細(xì)胞壓積，降低血液和血漿粘滯度，同時(shí)羥乙基淀粉200/0. 5還具有減少受損毛細(xì)血管中的血漿滲漏和水腫的獨(dú)特藥理作用，這有利于將發(fā)生或已發(fā)生器官衰竭的危重患者。它具有起效快而強(qiáng)的擴(kuò)容作用，能維持中等強(qiáng)度的擴(kuò)容作用達(dá)4小時(shí)，能較完全地從腎臟清除，在血漿和組織中的蓄積較少。羥乙基淀粉200/0. 5 (HES200/0. 5)注射液是歐洲目前最常用的血漿代用品，為治療和預(yù)防低血容量和休克的首選藥物。羥乙基淀粉200/0. 5對(duì)小鼠的半數(shù)致死量(LD50)超過6g/kg，相當(dāng)于將420g的羥乙基淀粉用于體重為70kg的患者，此劑量遠(yuǎn)超過臨床常用劑量。狗的慢性及亞急性毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，按體重每日4g/kg的羥乙基淀粉用量，除引起臟器重量增加及組織病理顯示暫時(shí)性網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)空泡樣變性外，對(duì)肝、脾、肺、淋巴結(jié)沒有不可逆性的毒副作用，其沒有致畸性。本發(fā)明用特定比例的兩種功能分子提供了適宜的紅細(xì)胞凝集速度，也因此實(shí)現(xiàn)了良好的淋巴細(xì)胞純度和淋巴細(xì)胞回收率。這種適宜的紅細(xì)胞凝集速度是兩種分子中單一的某一種分子所無(wú)法實(shí)現(xiàn)的，即，Dextran 70對(duì)紅細(xì)胞幾乎沒有凝集作用，這將導(dǎo)致細(xì)胞產(chǎn)品中大量紅細(xì)胞的污染；而羥乙基淀粉200/0. 5有很強(qiáng)的紅細(xì)胞凝集作用，這將導(dǎo)致紅細(xì)胞沉降速度過快，一些淋巴細(xì)胞將被非特異性地捕獲進(jìn)入紅細(xì)胞的凝塊之中，導(dǎo)致淋巴細(xì)胞收率降低。單個(gè)核細(xì)胞包括淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞。用本發(fā)明所述單個(gè)核細(xì)胞分離的組合物配成生理溶液狀態(tài)的分離介質(zhì)，對(duì)血樣樣品進(jìn)行離心處理后，淋巴細(xì)胞與單核細(xì)胞將在分離介質(zhì)和血漿的交界面形成比較明顯的云霧狀細(xì)胞條帶，而紅細(xì)胞、粒細(xì)胞等其它細(xì)胞將主要分布在離心管底和分離介質(zhì)層。在本發(fā)明的具體實(shí)施方式
中提供的用于淋巴細(xì)胞分離的組合物Dextran 70、羥乙基淀粉200/0. 5的質(zhì)量比為1 1、2 1或3 1。在本發(fā)明的另一個(gè)具體實(shí)施方式
中提供的用于淋巴細(xì)胞分離的組合物Dextran 70、羥乙基淀粉130/0. 4的質(zhì)量比為1:1。在本發(fā)明的另一個(gè)具體實(shí)施方式
中提供的用于淋巴細(xì)胞分離的組合物Dextran 40、羥乙基淀粉200/0. 5的質(zhì)量比為1:1。在本發(fā)明的一方面提供了一種復(fù)方淋巴細(xì)胞分離介質(zhì)，用于通過密度梯度離心法分離多種樣本(人臍帶血、外周血、骨髓等)中的淋巴細(xì)胞，其特點(diǎn)在于全部原料均符合臨床醫(yī)用靜注級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，具有極小的生物學(xué)毒性，并且安全性較含F(xiàn)icoll 400的傳統(tǒng)淋巴細(xì)胞分離介質(zhì)有顯著的提高，具有潛在的臨床應(yīng)用價(jià)值。本發(fā)明提供的復(fù)方淋巴細(xì)胞分離介質(zhì)，含有分子量大于40kD的右旋糖酐、藥學(xué)上接受的羥乙基淀粉與泛影酸鈉或泛影葡胺，該分離介質(zhì)為生理溶液，其密度在1.060g/cm3 和1. 090g/cm3之間，滲透壓在^OmOsmol/kg和3IOmOsmol/kg之間，pH在6和9之間，黏度為3. 0-5. Ocp0本發(fā)明由上述原料以任意比例混合，并通過攪拌和過濾除菌后而得，使其保持生理溶液狀態(tài)，即密度在1. 060g/cm3和1. 090g/cm3之間，滲透壓在^0m0smol/kg和 3IOmOsmol/kg之間，pH在6和9之間。作為優(yōu)選，本發(fā)明所述復(fù)方淋巴細(xì)胞分離介質(zhì)的配方為含有0-6% (w/w)的右旋糖酐70、0-10% (w/w)的泛影酸鈉、0-6% (w/w)的羥乙基淀粉200/0. 5。更優(yōu)選地，其含有1-3% (w/w)的右旋糖酐70、5-10% (w/w)的泛影酸鈉、1-3% (w/w)的羥乙基淀粉(200/0. 5)。在本發(fā)明的具體實(shí)施方式
中提供的用于淋巴細(xì)胞分離的復(fù)方淋巴細(xì)胞分離介質(zhì)中Dextran 70、羥乙基淀粉200/0. 5、泛影酸鈉的質(zhì)量百分比為2. 25%、2. 25%、9. 0%或 3. 0 %、1. 5 %、9. 0 % 或 2. 45 %、2. 45 %、9. 0 % 或 3. 6 %、1. 3 %、9. 0 % 或 2. 85 %、2. 85 %、 9. 0%，形成澄清透明的無(wú)色或微黃色水溶液，該溶液在20°C條件下為生理溶液狀態(tài)，該混合水溶液的主要特征密度在1. 060g/cm3和1. 090g/cm3之間，滲透壓在^0m0smol/kg和 3IOmOsmol/kg之間，pH在6和9之間。在本發(fā)明的另一個(gè)具體實(shí)施方式
中提供的用于淋巴細(xì)胞分離的復(fù)方淋巴細(xì)胞分離介質(zhì)中Dextran 40、羥乙基淀粉200/0. 5、泛影酸鈉的質(zhì)量百分比分別為2.45%、 2.45%、9.0%。在本發(fā)明的另一個(gè)具體實(shí)施方式
中提供的用于淋巴細(xì)胞分離的復(fù)方淋巴細(xì)胞分離介質(zhì)中Dextran 70、羥乙基淀粉130/0. 4、泛影酸鈉的質(zhì)量百分比分別為2. 45%, 2. 45%,9. 0%。作為優(yōu)選，還含有0-0. 9% (w/w)的NaCl。作為優(yōu)選，其為無(wú)菌狀態(tài)，內(nèi)毒素含量< 0. 5EU/ml。本發(fā)明所述復(fù)方淋巴細(xì)胞分離介質(zhì)回收的淋巴細(xì)胞純度及淋巴細(xì)胞回收率與Ficoll-Paque Premium 對(duì)照組無(wú)顯著性差異；經(jīng)分離得到的淋巴細(xì)胞，在經(jīng)過典型的CIK 細(xì)胞培養(yǎng)后，在增殖、形態(tài)學(xué)、表面標(biāo)記物CD3+CD56+及對(duì)A549細(xì)胞的殺瘤活性測(cè)試四項(xiàng)指標(biāo)中均與Ficoll-Paque Premium 對(duì)照組有相當(dāng)?shù)男Ч?，說明其安全、有效。在本發(fā)明的另一方面還提供了所述復(fù)方淋巴細(xì)胞分離介質(zhì)分離樣本細(xì)胞的方法， 其特征在于，包括以下步驟步驟1 將O-SOml所述淋巴細(xì)胞分離介質(zhì)加入離心管；步驟2 再將利用抗凝劑處理過的平衡鹽溶液或無(wú)血清培養(yǎng)基稀釋后的樣品鋪在淋巴細(xì)胞分離介質(zhì)上，在溫度為4°C -30°C進(jìn)行離心。作為優(yōu)選，步驟1為15ml離心管中裝入3-5ml分離介質(zhì)，或50ml離心管中裝入 20-30ml分離介質(zhì)。作為優(yōu)選，步驟2所述稀釋的稀釋比例為1 2-2 1，優(yōu)選為1 1_1 1. 5 ； 步驟2所述離心的溫度為20-25°C，在IOO-SOOg的條件下進(jìn)行離心；優(yōu)選的離心條件為 300-500g，離心時(shí)間為 15-30min。更優(yōu)選地，所述樣品選自外周血、臍帶血或骨髓。淋巴細(xì)胞將在分離介質(zhì)和血漿的交界面形成比較明顯的云霧狀細(xì)胞條帶，而紅細(xì)胞、粒細(xì)胞等其它細(xì)胞將主要分布在離心管底和分離介質(zhì)層。任選地，淋巴細(xì)胞通過一定方式(比如利用移液管或其它移液器吸取)取出，并任選地經(jīng)過0-2次平衡鹽溶液或無(wú)血清培養(yǎng)基的洗滌和離心，優(yōu)選地經(jīng)過1次無(wú)血清培養(yǎng)基洗滌和離心；最終獲得純度較高的淋巴細(xì)胞懸液。分離收獲的淋巴細(xì)胞可通過進(jìn)一步處理達(dá)到其它目的，例如通過典型的CIK 細(xì)胞培養(yǎng)流程進(jìn)行培養(yǎng)，并最終用于對(duì)抗腫瘤的細(xì)胞治療。本發(fā)明還提供復(fù)方淋巴細(xì)胞分離介質(zhì)在疾病的細(xì)胞學(xué)診斷、成分輸血、細(xì)胞治療、 細(xì)胞產(chǎn)品的制備等現(xiàn)代生物技術(shù)領(lǐng)域和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的用途。典型地，本發(fā)明尤其適用于CIK 細(xì)胞的培養(yǎng)和相關(guān)的細(xì)胞培養(yǎng)和相關(guān)的細(xì)胞治療，優(yōu)選地，本發(fā)明適用于用于腫瘤治療的 CIK細(xì)胞培養(yǎng)前的淋巴細(xì)胞富集。本發(fā)明配方中的全部原料均有符合靜注級(jí)原料藥可以購(gòu)得，原料不確定性小，安全性高，且分離效果與常規(guī)分離介質(zhì)沒有顯著性差異。因此，本發(fā)明為臨床醫(yī)用級(jí)淋巴細(xì)胞分離介質(zhì)的誕生起到了巨大的推動(dòng)作用。術(shù)語(yǔ)與定義如在本說明書中所用的，無(wú)論在過渡性短語(yǔ)或權(quán)利要求書的主體中，術(shù)語(yǔ)“包含” 被解釋為不定額的意義。S卩，術(shù)語(yǔ)被解釋為與短語(yǔ)“具有至少”或“包括至少”同義。當(dāng)用于方法，術(shù)語(yǔ)“包含”意思是該方法包括至少列舉出的步驟，但還可包括另外的步驟。當(dāng)用于化合物或組合物，術(shù)語(yǔ)“包含”意思是化合物或組合物包括列舉出的特征或組分，但還可包括另外的特征或組分。本文所用的術(shù)語(yǔ)“任選”或“任選地”意思是隨后描述的事件或狀況可能，但不必需發(fā)生，該描述包括事件或狀況發(fā)生的情況或不發(fā)生的情況。本文所用的，對(duì)于變量的數(shù)值范圍的列舉是為了表達(dá)本發(fā)明可實(shí)行變量等于在該范圍內(nèi)的任何值。因此，對(duì)于本質(zhì)上是非連續(xù)的變量，變量可以等于數(shù)值范圍的任何整數(shù)值，包括范圍的終點(diǎn)。同樣地，對(duì)于本質(zhì)上是連續(xù)的變量，變量可以等于數(shù)值范圍的任何實(shí)際值，包括范圍的終點(diǎn)。舉例來(lái)說，所述的值在0和2之間的變量，對(duì)于本質(zhì)上是非連續(xù)的變量可以是0、1或2，對(duì)于本質(zhì)上是連續(xù)的變量可以是0.0、0. 1,0. 01,0. 001或任何實(shí)際值。細(xì)胞治療是指應(yīng)用人的自體、同種異體或異種的成體或胚胎細(xì)胞經(jīng)體外操作后回輸人體的治療方法。密度梯度離心法在密度梯度離心法中，需要將一種具有特定密度的分離介質(zhì)預(yù)先鋪在離心管底，然后將待分離的樣本小心鋪在該介質(zhì)上，隨后將離心管在一定離心條件下離心一段時(shí)間并取出，樣品中各細(xì)胞群將由于密度差異分布在離心管的不同部位，例如， 如果分離介質(zhì)具有與目標(biāo)細(xì)胞群相同的密度，目標(biāo)細(xì)胞將富集在分離介質(zhì)層與樣本層的交界面，用吸管將該層細(xì)胞吸出就達(dá)到了對(duì)目標(biāo)細(xì)胞群的分離。淋巴細(xì)胞分離介質(zhì)在上述描述中，用于分離淋巴細(xì)胞的分離介質(zhì)稱為淋巴細(xì)胞分離介質(zhì)。靜注級(jí)原料藥原料藥由化學(xué)合成、植物提取或者生物技術(shù)所制備的各種用來(lái)作為藥用的粉末、結(jié)晶、浸膏等，用于生產(chǎn)各類制劑的原料藥物，是制劑中的有效成分，但病人無(wú)法直接服用的物質(zhì)。靜注級(jí)原料藥指用于制備靜注制劑的有效成分。CIK細(xì)胞全稱為Cytokine Induced Killer cells，即細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞， 其由供體分離而得到的單個(gè)核細(xì)胞(MNC)在體外用多種細(xì)胞因子共同培養(yǎng)一段時(shí)間獲得的一群異質(zhì)細(xì)胞，其主要效應(yīng)細(xì)胞是CD3+CD56+雙陽(yáng)性細(xì)胞，具有較強(qiáng)的對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用。


圖1顯示實(shí)施例1-7制備的復(fù)方分離介質(zhì)的密度；圖2顯示實(shí)施例1-7制備的復(fù)方分離介質(zhì)的滲透壓；圖3顯示本發(fā)明所述復(fù)方分離介質(zhì)用離心管分離人臍帶血的細(xì)胞分層；圖4顯示實(shí)施例1-7制備的復(fù)方分離介質(zhì)分離人臍帶血的淋巴細(xì)胞回收率；圖5顯示實(shí)施例1-7制備的復(fù)方分離介質(zhì)分離人臍帶血的淋巴細(xì)胞純度；圖6顯示實(shí)施例4-5制備的復(fù)方分離介質(zhì)分離人外周血的淋巴細(xì)胞回收率；圖7顯示實(shí)施例4-5制備的復(fù)方分離介質(zhì)分離人外周血的淋巴細(xì)胞純度；圖8顯示實(shí)施例4配制的分離介質(zhì)分離人臍帶血中的淋巴細(xì)胞的增殖曲線；圖9顯示實(shí)施例4配制的分離介質(zhì)分離人臍帶血中的淋巴細(xì)胞對(duì)A549細(xì)胞在效靶比為10 1條件下的殺傷率。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明公開了一種復(fù)方淋巴細(xì)胞分離介質(zhì)及其應(yīng)用，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以借鑒本文內(nèi)容，適當(dāng)改進(jìn)工藝參數(shù)實(shí)現(xiàn)。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動(dòng)對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說是顯而易見的，它們都被視為包括在本發(fā)明。本發(fā)明的復(fù)方淋巴細(xì)胞分離介質(zhì)及應(yīng)用已經(jīng)通過較佳實(shí)施例進(jìn)行了描述，相關(guān)人員明顯能在不脫離本發(fā)明內(nèi)容、精神和范圍內(nèi)對(duì)本文所述的方法和應(yīng)用進(jìn)行改動(dòng)或適當(dāng)變更與組合，來(lái)實(shí)現(xiàn)和應(yīng)用本發(fā)明技術(shù)。為了使本領(lǐng)域的技術(shù)人員更好地理解本發(fā)明的技術(shù)方案，下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)說明。實(shí)施例1、配方A分離介質(zhì)的配制
在具備局部百級(jí)層流凈化條件的環(huán)境中，在20°C下，經(jīng)過無(wú)菌技術(shù)培訓(xùn)的本領(lǐng)域技術(shù)人員使用常規(guī)方法分別將符合藥用標(biāo)準(zhǔn)的、質(zhì)量比為1 IDextran 70、羥乙基淀粉 (200/0. 5)與一定量的泛影酸鈉充分溶解于滅菌注射用水，形成澄清透明的無(wú)色或微黃色水溶液，三種物質(zhì)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為2. 25%,2. 25%,9. 0%，再經(jīng)過0. 22 μ m濾膜過濾至一支無(wú)菌、無(wú)內(nèi)毒素的容器內(nèi)。在20°C條件下，該混合水溶液的主要特征參數(shù)包括(1)密度為1. 074g/cm3 (見圖 1，參照方法<1>) ； (2)滲透壓為生理滲透壓(見圖2，285m0sm/kg至310m0sm/kg之間)(參照方法<2 ； (3)pH在6. 0至9. 0之間；(4)黏度為3. 0-5. Ocp (參照方法<4 ；此外，該混合水溶液的特征還包括( 無(wú)菌(參照方法<5>) ； (6)內(nèi)毒素
<0. 5EU/ml (參照方法 <6 。本實(shí)施例中所引用的參照6種方法適用于下面所有實(shí)施例中相應(yīng)的描述，所引用的參照方法包括<1>采用U型震蕩管法測(cè)定密度，參見美國(guó)藥典USP<841>Specific Gravity MethodII ；<2>采用冰點(diǎn)降低法測(cè)定滲透壓，參見《中華人民共和國(guó)藥典》2010年版附錄IX G “滲透壓摩爾濃度測(cè)定法”；<3>采用電位法測(cè)定pH值，參見《中華人民共和國(guó)藥典》2010年版附錄VIH“pH值測(cè)定法”；<4>采用落球法測(cè)定動(dòng)力粘度；<5>參見《中華人民共和國(guó)藥典》2010年版附錄XI H “無(wú)菌檢查法”；<6>采用鱟試劑法測(cè)定細(xì)菌內(nèi)毒素，參見《中華人民共和國(guó)藥典》2010年版附錄X III D “細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法”；<7>細(xì)胞計(jì)數(shù)板法測(cè)定細(xì)胞數(shù)量，使用25X16規(guī)格的細(xì)胞計(jì)數(shù)板，由本領(lǐng)域技術(shù)人員按照標(biāo)準(zhǔn)流程進(jìn)行操作。實(shí)施例2、配方B分離介質(zhì)的配制在具備局部百級(jí)層流凈化條件的環(huán)境中，在20°C下，經(jīng)過無(wú)菌技術(shù)培訓(xùn)的本領(lǐng)域技術(shù)人員使用常規(guī)方法分別將符合藥用標(biāo)準(zhǔn)的、質(zhì)量比為2 lWDextran 70、羥乙基淀粉(200/0. 5)與一定量的泛影酸鈉充分溶解于滅菌注射用水，形成澄清透明的無(wú)色或微黃色水溶液，三種物質(zhì)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為3. 0%、1. 5%、9. 0%，再經(jīng)過0. 22 μ m濾膜過濾至一支無(wú)菌、無(wú)內(nèi)毒素的容器內(nèi)。在20°C條件下，該混合水溶液的主要特征參數(shù)包括(1)密度為1. 074g/cm3 (見圖 1，參照方法<1>) ； (2)滲透壓為生理滲透壓(見圖2，285m0sm/kg至310m0sm/kg之間)(參照方法<2>) ； (3) pH在6. 0至9. 0之間(見圖3，參照方法<3>) ； (4)黏度為3. 0-5. Ocp (參照方法<4>)；此外，該混合水溶液的特征還包括( 無(wú)菌(參照方法<5>) ； (6)內(nèi)毒素
<0. 5EU/ml (參照方法 <6 。實(shí)施例3、配方C分離介質(zhì)的配制在具備局部百級(jí)層流凈化條件的環(huán)境中，在20°C下，經(jīng)過無(wú)菌技術(shù)培訓(xùn)的本領(lǐng)域技術(shù)人員使用常規(guī)方法分別將符合藥用標(biāo)準(zhǔn)的、質(zhì)量比為1 lWDextran 70、羥乙基淀粉(200/0. 5)與一定量的泛影酸鈉充分溶解于滅菌注射用水，形成三種物質(zhì)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為2. 45%,2. 45%、9. 0%的澄清透明的無(wú)色或微黃色水溶液，再經(jīng)過0. 22 μ m濾膜過濾至一支無(wú)菌、無(wú)內(nèi)毒素的容器內(nèi)。
在20°C條件下，該混合水溶液的主要特征參數(shù)包括(1)密度為1.075g/cm3 (見圖 1，參照方法<1>) ； (2)滲透壓為生理滲透壓(見圖2，285m0sm/kg至310m0sm/kg之間)(參照方法<2>) ； (3) pH在6. 0至9. 0之間(見圖3，參照方法<3>) ； (4)黏度為3. 0-5. Ocp (參照方法<4>)；
此外，該混合水溶液的特征還包括( 無(wú)菌(參照方法<5>) ； (6)內(nèi)毒素<0. 5EU/ml (參照方法 <6 。
實(shí)施例4、配方D分離介質(zhì)的配制
在具備局部百級(jí)層流凈化條件的環(huán)境中，在20°C下，經(jīng)過無(wú)菌技術(shù)培訓(xùn)的本領(lǐng)域技術(shù)人員使用常規(guī)方法分別將符合藥用標(biāo)準(zhǔn)的、質(zhì)量比約為3 lWDextran 70、羥乙基淀粉(200/0. 5)與一定量的泛影酸鈉充分溶解于滅菌注射用水，形成三種物質(zhì)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為3. 6 %、1. 3 %、9. 0 %的澄清透明的無(wú)色或微黃色水溶液，再經(jīng)過0. 22 μ m濾膜過濾至一支無(wú)菌、無(wú)內(nèi)毒素的容器內(nèi)。
在20°C條件下，該混合水溶液的主要特征參數(shù)包括(1)密度為1. 075g/cm3 (見圖 1，參照方法<1>) ； (2)滲透壓為生理滲透壓(見圖2，285m0sm/kg至310m0sm/kg之間)(參照方法<2>) ； (3) pH在6. 0至9. 0之間(見圖3，參照方法<3>) ； (4)黏度為3. 0-5. Ocp (參照方法<4>)；
此外，該混合水溶液的特征還包括( 無(wú)菌(參照方法<5>) ； (6)內(nèi)毒素<0. 5EU/ml (參照方法 <6 。
實(shí)施例5、配方E分離介質(zhì)的配制
在具備局部百級(jí)層流凈化條件的環(huán)境中，在20°C下，經(jīng)過無(wú)菌技術(shù)培訓(xùn)的本領(lǐng)域技術(shù)人員使用常規(guī)方法分別將符合藥用標(biāo)準(zhǔn)的、質(zhì)量比為1 lWDextran 70、羥乙基淀粉(200/0. 5)與一定量的泛影酸鈉充分溶解于滅菌注射用水，形成三種物質(zhì)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為2. 85 %、2. 85 %、9. 0 %的澄清透明的無(wú)色或微黃色水溶液，再經(jīng)過0. 22 μ m濾膜過濾至一支無(wú)菌、無(wú)內(nèi)毒素的容器內(nèi)。
在20°C條件下，該混合水溶液的主要特征參數(shù)包括(1)密度為1.078g/cm3 (見圖 1，參照方法<1>) ； (2)滲透壓為生理滲透壓(見圖2，285m0sm/kg至310m0sm/kg之間)(參照方法<2>) ； (3) pH在6. 0至9. 0之間(見圖3，參照方法<3>) ； (4)黏度為3. 0-5. Ocp (參照方法<4>)；
此外，該混合水溶液的特征還包括( 無(wú)菌(參照方法<5>) ； (6)內(nèi)毒素<0. 5EU/ml (參照方法 <6 。
實(shí)施例6、配方F分離介質(zhì)的配制
在具備局部百級(jí)層流凈化條件的環(huán)境中，在20°C下，經(jīng)過無(wú)菌技術(shù)培訓(xùn)的本領(lǐng)域技術(shù)人員使用常規(guī)方法分別將符合藥用標(biāo)準(zhǔn)的、質(zhì)量比為1 lWDextran 40、羥乙基淀粉(200/0. 5)與一定量的泛影酸鈉充分溶解于滅菌注射用水，形成三種物質(zhì)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為2. 45%,2. 45%、9. 0%的澄清透明的無(wú)色或微黃色水溶液，再經(jīng)過0. 22 μ m濾膜過濾至一支無(wú)菌、無(wú)內(nèi)毒素的容器內(nèi)。
在20°C條件下，該混合水溶液的主要特征參數(shù)包括(1)密度為1.075g/cm3 (見圖 1，參照方法<1>) ； (2)滲透壓為生理滲透壓(見圖2，285m0sm/kg至310m0sm/kg之間)(參照方法<2>) ； (3) pH在6. 0至9. 0之間(見圖3，參照方法<3>) ； (4)黏度為3. 0-5. Ocp (參照方法<4>)；
此外，該混合水溶液的特征還包括(5)無(wú)菌(參照方法<5>) ； (6)內(nèi)毒素<0. 5EU/ ml (參照方法<6 。
實(shí)施例7、配方G分離介質(zhì)的配制
在具備局部百級(jí)層流凈化條件的環(huán)境中，在20°C下，經(jīng)過無(wú)菌技術(shù)培訓(xùn)的本領(lǐng)域技術(shù)人員使用常規(guī)方法分別將符合藥用標(biāo)準(zhǔn)的、質(zhì)量比為1 lWDextran 70、羥乙基淀粉130/0. 4與一定量的泛影酸鈉充分溶解于滅菌注射用水，形成三種物質(zhì)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為2. 45%、2. 45%、9. 0%的澄清透明的無(wú)色或微黃色水溶液，再經(jīng)過0. 22 μ m濾膜過濾至一支無(wú)菌、無(wú)內(nèi)毒素的容器內(nèi)。
在20°C條件下，該混合水溶液的主要特征參數(shù)包括(1)密度為1.075g/cm3 (見圖 1，參照方法<1>) ； (2)滲透壓為生理滲透壓(見圖2，285m0sm/kg至310m0sm/kg之間)(參照方法<2>) ； (3) pH在6. 0至9. 0之間(見圖3，參照方法<3>) ； (4)黏度為3. 0-5. Ocp (參照方法<4>)；
此外，該混合水溶液的特征還包括( 無(wú)菌(參照方法<5>) ； (6)內(nèi)毒素 < 0. 5EU/ml (參照方法 <6 。
實(shí)施例8、分離介質(zhì)的貯藏
在具備局部百級(jí)層流凈化條件的環(huán)境中，在20°C條件下，所有配制而成的分離介質(zhì)樣品均貯藏于密閉的無(wú)菌玻璃或塑料容器內(nèi)，并在錫箔紙包裝遮光的條件下，于常溫 (參照《中華人民共和國(guó)藥典》2010年版凡例二十一)進(jìn)行保存。
實(shí)施例9、利用所配制的分離介質(zhì)分離人臍帶血中的淋巴細(xì)胞及分離效果的評(píng)價(jià)
按照實(shí)施例8對(duì)所配制的復(fù)方淋巴細(xì)胞分離介質(zhì)進(jìn)行貯藏，將5ml上述淋巴細(xì)胞分離介質(zhì)或作為對(duì)照組的Ficoll-Paque Premium 分離介質(zhì)(美國(guó)GE Healthcare公司) 加入到15ml離心管(美國(guó)BD公司)，再將5ml利用抗凝劑處理過的RPMI 1640 (美國(guó)Life Technologies公司)1 1稀釋后的臍帶血樣本沿管壁小心鋪在淋巴細(xì)胞分離介質(zhì)上；在溫度為20°C和400g的條件下進(jìn)行離心(美國(guó)Thermo Scientific公司)30min，后停止離心，淋巴細(xì)胞與單核細(xì)胞將在分離介質(zhì)和血漿的交界面形成比較明顯的云霧狀細(xì)胞條帶， 而紅細(xì)胞、粒細(xì)胞等其它細(xì)胞將主要分布在離心管底和分離介質(zhì)層(見圖3)。利用移液管將血清層吸出并棄置不用，再利用移液管小心將云霧狀細(xì)胞條帶吸出，利用無(wú)血清培養(yǎng)基對(duì)收獲的淋巴細(xì)胞進(jìn)行洗滌和離心，最終獲得純度較高的淋巴細(xì)胞懸液，將該淋巴細(xì)胞懸液進(jìn)行CD45和CD14熒光標(biāo)記抗體(美國(guó)BD公司)檢測(cè)，利用細(xì)胞計(jì)數(shù)板對(duì)收獲的細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)(參照方法<7>)，計(jì)算各分離介質(zhì)組淋巴細(xì)胞回收率和淋巴細(xì)胞純度，并分別與 Ficoll-Paque Premium 分離介質(zhì)的結(jié)果進(jìn)行比較，計(jì)算各分離介質(zhì)組淋巴細(xì)胞回收率和淋巴細(xì)胞純度占相應(yīng)的Ficoll-Paque Premium 分離介質(zhì)結(jié)果的比例，作為分離效果的評(píng)價(jià)指標(biāo)(見圖4、圖幻，特別說明為每組Ficoll-Paque Premium 分離介質(zhì)淋巴細(xì)胞回收率和淋巴細(xì)胞純度所占比例均記為lOO^UOO^。對(duì)試驗(yàn)結(jié)果選用恰當(dāng)?shù)慕y(tǒng)計(jì)學(xué)方法(t檢驗(yàn))進(jìn)行分析可知，配方A、B、C、D的淋巴細(xì)胞純度與Ficoll-Paque Premium 對(duì)照組無(wú)顯著性差異，配方A、D、E、G的淋巴細(xì)胞回收率指標(biāo)與Ficoll-Paque Premium 對(duì)照組有相當(dāng)?shù)男Ч?。?shí)施例10、利用所配制的分離介質(zhì)分離人外周血中的淋巴細(xì)胞及分離效果的評(píng)價(jià)按照實(shí)施例8對(duì)所配制的復(fù)方淋巴細(xì)胞分離介質(zhì)進(jìn)行貯藏，將5ml上述淋巴細(xì)胞分離介質(zhì)或作為對(duì)照組的Ficoll-Paque Premium 分離介質(zhì)(美國(guó)GE Healthcare公司) 加入到15ml離心管(美國(guó)BD公司)，再將5ml利用抗凝劑處理過的RPMI 1640 (美國(guó)Life Technologies公司)1 1稀釋后的新鮮人外周血樣本沿管壁小心鋪在淋巴細(xì)胞分離介質(zhì)上；在溫度為20°C和400g的條件下進(jìn)行離心(美國(guó)Thermo Scientific公司)30min， 后停止離心，淋巴細(xì)胞與單核細(xì)胞將在分離介質(zhì)和血漿的交界面形成比較明顯的云霧狀細(xì)胞條帶，而紅細(xì)胞、粒細(xì)胞等其它細(xì)胞將主要分布在離心管底和分離介質(zhì)層。利用移液管將血清層吸出并棄置不用，再利用移液管小心將云霧狀細(xì)胞條帶吸出，利用無(wú)血清培養(yǎng)基對(duì)收獲的淋巴細(xì)胞進(jìn)行洗滌和離心，最終獲得純度較高的淋巴細(xì)胞懸液，將該淋巴細(xì)胞懸液進(jìn)行CD45和CD14熒光標(biāo)記抗體(美國(guó)BD公司)檢測(cè)，利用細(xì)胞計(jì)數(shù)板對(duì)收獲的細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)(參照方法<7>)，計(jì)算各分離介質(zhì)組淋巴細(xì)胞回收率和淋巴細(xì)胞純度，并分別與 Ficoll-Paque Premium 分離介質(zhì)的結(jié)果進(jìn)行比較，計(jì)算各分離介質(zhì)組淋巴細(xì)胞回收率和淋巴細(xì)胞純度占相應(yīng)的Ficoll-Paque Premium 分離介質(zhì)結(jié)果的比例，作為分離效果的評(píng)價(jià)指標(biāo)(見圖6、圖7)，特別說明為每組Ficoll-Paque Premium 分離介質(zhì)淋巴細(xì)胞回收率和淋巴細(xì)胞純度所占比例均記為100%、100%。由試驗(yàn)結(jié)果可知，配方D在淋巴細(xì)胞純度和淋巴細(xì)胞回收率兩項(xiàng)指標(biāo)中均與Ficoll-Paque Premium 對(duì)照組有相當(dāng)?shù)男Ч?，配方E的淋巴細(xì)胞回收率指標(biāo)優(yōu)于Ficoll-Paque Premium 對(duì)照組。實(shí)施例11、利用所配制的分離介質(zhì)分離人臍帶血而得的淋巴細(xì)胞的體外培養(yǎng)與觀
察將分離收獲的淋巴細(xì)胞接種于6孔板(美國(guó)CELLSTAR公司)上，通過典型的CIK 細(xì)胞培養(yǎng)流程進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)持續(xù)14至觀天。期間，利用細(xì)胞計(jì)數(shù)板對(duì)生長(zhǎng)期間的細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)(臺(tái)盼藍(lán)排除法)并繪制增殖曲線(見圖8)；利用顯微鏡進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察，并拍照存檔；對(duì)達(dá)到預(yù)設(shè)培養(yǎng)時(shí)間的細(xì)胞產(chǎn)品進(jìn)行CD3和CD56，及PI熒光標(biāo)記抗體(美國(guó)BD公司) 檢測(cè)，同時(shí)對(duì)A549細(xì)胞進(jìn)行殺瘤活性測(cè)試，⑶3+⑶56+雙陽(yáng)性細(xì)胞群比例和效靶比為10 1 條件下的殺傷率(見圖9)作為培養(yǎng)的評(píng)價(jià)指標(biāo)。由試驗(yàn)結(jié)果可知，配方D分離而得的淋巴細(xì)胞，在經(jīng)過典型的CIK細(xì)胞培養(yǎng)后，在增殖、形態(tài)學(xué)(細(xì)胞形態(tài)、增殖團(tuán)出現(xiàn)時(shí)間與大小)、 表面標(biāo)記物(⑶3+CD56+雙陽(yáng)性細(xì)胞比例)及殺瘤活性測(cè)試四項(xiàng)指標(biāo)中均與Ficoll-Paque Premium 對(duì)照組有相當(dāng)?shù)男Ч?，是一種安全、有效的產(chǎn)品。以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái)說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和潤(rùn)飾，這些改進(jìn)和潤(rùn)飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。
權(quán)利要求
1.一種用于單個(gè)核細(xì)胞分離的組合物，由分子量大于40kD的右旋糖酐、藥學(xué)上可接受的羥乙基淀粉與泛影酸鈉或泛影葡胺組成。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其特征在于，所述右旋糖酐為Dextran70或 Dextran 40。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其特征在于，所述羥乙基淀粉為羥乙基淀粉200/0.5 或羥乙基淀粉130/0. 4。
4.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的組合物，其特征在于，右旋糖酐、羥乙基淀粉質(zhì)量比為 1 1、2 1 或 3 1。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)所述的組合物，其特征在于，所述單個(gè)核細(xì)胞為單核細(xì)胞或淋巴細(xì)胞。
6.一種復(fù)方淋巴細(xì)胞分離介質(zhì)，其特征在于，含有分子量大于40kD的右旋糖酐、藥學(xué)上可接受的羥乙基淀粉與泛影酸鈉或泛影葡胺，該分離介質(zhì)為生理溶液，其密度在1. 060g/ cm3 和 1. 090g/cm3 之間，滲透壓在 ^0m0smol/kg 和 310m0smol/kg 之間，pH 在 6 和 9 之間， 黏度為 3. 0-5. Ocp。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的復(fù)方淋巴細(xì)胞分離介質(zhì)，其特征在于，含有0-6%(w/w)的右旋糖酐70、0-10% (w/w)的泛影酸鈉、0-6% (w/w)的羥乙基淀粉200/0. 5。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的復(fù)方淋巴細(xì)胞分離介質(zhì)，其特征在于，含有1-3%(w/w)的右旋糖酐70、5-10% (w/w)的泛影酸鈉、1-3% (w/w)的羥乙基淀粉Q00/0. 5)。
9.根據(jù)權(quán)利要求6所述的復(fù)方淋巴細(xì)胞分離介質(zhì)，其特征在于，還含有0-0.9% (w/w) 的 NaCl。
10.根據(jù)權(quán)利要求6-9任一項(xiàng)所述的復(fù)方淋巴細(xì)胞分離介質(zhì)，其特征在于，其為無(wú)菌狀態(tài)。
11.根據(jù)權(quán)利要求6-9任一項(xiàng)所述的復(fù)方淋巴細(xì)胞分離介質(zhì)，其特征在于，其內(nèi)毒素含量< 0.5EU/ml。
12.—種分離樣品細(xì)胞的方法，其特征在于，包括以下步驟步驟1 將O-SOml權(quán)利要求6-11任一項(xiàng)所述淋巴細(xì)胞分離介質(zhì)加入離心管；步驟2 再將利用抗凝劑處理過的平衡鹽溶液或無(wú)血清培養(yǎng)基稀釋后的樣品鋪在淋巴細(xì)胞分離介質(zhì)上，在溫度為4°C -30°C進(jìn)行離心。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，其特征在于，步驟1為15ml離心管中裝入3_5ml分離介質(zhì)，或50ml離心管中裝入20-30ml分離介質(zhì)。
14.根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，其特征在于，步驟2所述稀釋的稀釋比例為 1:2-2: 1，優(yōu)選為 1 1-1 1.5。
15.根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，其特征在于，步驟2所述離心的溫度為20-25°C，在 100-800g的條件下進(jìn)行離心；優(yōu)選的離心條件為300-500g，離心時(shí)間為15_30min。
16.根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，其特征在于，所述樣品選自外周血、臍帶血或骨髓。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種用于單個(gè)核細(xì)胞分離的組合物及復(fù)方淋巴細(xì)胞分離介質(zhì)。本發(fā)明所述復(fù)方淋巴細(xì)胞分離介質(zhì)配方中的全部原料均符合靜注級(jí)原料藥標(biāo)準(zhǔn)，原料安全性高，回收的淋巴細(xì)胞純度及淋巴細(xì)胞回收率與常規(guī)分離介質(zhì)對(duì)照組無(wú)顯著性差異；經(jīng)分離得到的淋巴細(xì)胞，在增殖、形態(tài)學(xué)、表面標(biāo)記物及殺瘤活性測(cè)試四項(xiàng)指標(biāo)中均與對(duì)照組有相當(dāng)?shù)男Ч?，具有良好的臨床應(yīng)用前景。
文檔編號(hào)C12N5/078GK102533650SQ201110456878
公開日2012年7月4日 申請(qǐng)日期2011年12月30日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月30日
發(fā)明者丁銀巧, 樊曉翔, 趙侃, 高錦, 高長(zhǎng)青 申請(qǐng)人:北京京蒙高科干細(xì)胞技術(shù)有限公司, 北京市星奧同創(chuàng)科技有限責(zé)任公司