專(zhuān)利名稱(chēng)：一種來(lái)源于人放化療后復(fù)發(fā)小細(xì)胞肺癌淋巴結(jié)的細(xì)胞株及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種來(lái)源于人放化療后復(fù)發(fā)小細(xì)胞肺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶的細(xì)胞株及其制備方法。
背景技術(shù)：
腫瘤是嚴(yán)重危害人類(lèi)健康的主要疾病之一，世界衛(wèi)生組織發(fā)表的一項(xiàng)研究報(bào)告表明，全球癌癥狀況將日益嚴(yán)重，因此，深入研究腫瘤發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制，尋找更為有效的腫瘤治療方案，成為當(dāng)今醫(yī)學(xué)研究的前沿課題。隨著腫瘤生物學(xué)研究的不斷深入，腫瘤的早期診斷及預(yù)防水平有了較大的提高，但是腫瘤治療后的高轉(zhuǎn)移及高復(fù)發(fā)仍是腫瘤臨床治療中一個(gè)亟待解決的難題。近年來(lái)，“腫瘤干細(xì)胞”學(xué)說(shuō)的提出及其研究進(jìn)展，從一個(gè)全新的角度去認(rèn)識(shí)腫瘤。該學(xué)說(shuō)認(rèn)為，腫瘤中存在一部分獨(dú)特的具有自我更新和分化功能的干細(xì)胞樣亞群并將之稱(chēng)為腫瘤干細(xì)胞，這一亞群細(xì)胞正是腫瘤的起源細(xì)胞并維持腫瘤的生長(zhǎng)。因此，腫瘤細(xì)胞株是研究細(xì)胞癌變機(jī)理、腫瘤轉(zhuǎn)移、腫瘤放療和化療敏感性分子基礎(chǔ)等生物醫(yī)學(xué)問(wèn)題的重要材料，建立和鑒定不同的腫瘤細(xì)胞株是一項(xiàng)很有意義的工作。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種來(lái)源于人放化療后復(fù)發(fā)小細(xì)胞肺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶的細(xì)胞株，所述細(xì)胞株具有典型的腫瘤細(xì)胞生物學(xué)特性；同時(shí)，還提供一種所述細(xì)胞株的制備方法。
為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案為一種來(lái)源于人放化療后復(fù)發(fā)小細(xì)胞肺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶的細(xì)胞株，命名為人小細(xì)胞肺癌肺門(mén)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶來(lái)源細(xì)胞株 0225-12ScacLym，保藏號(hào)為 CCTCC NO :C201033。
所述細(xì)胞株在倒置顯微鏡下觀察顯示，細(xì)胞體積小，核大，胞漿少，細(xì)胞與平皿之間貼附生長(zhǎng)，貼附不緊密，細(xì)胞可成團(tuán)半懸浮生長(zhǎng)。
所述細(xì)胞株的體外倍增時(shí)間為31. 22證。
所述細(xì)胞株的蛋白表達(dá)特征為NSE陽(yáng)性表達(dá)。
本發(fā)明所述人小細(xì)胞肺癌肺門(mén)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶來(lái)源細(xì)胞株0225-12SCaCLym，是一株來(lái)源于中國(guó)南方人肺小細(xì)胞癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶的細(xì)胞株，原始肺癌組織來(lái)源于一位M歲男性肺癌病人的左肺門(mén)腫瘤病灶，病人在手術(shù)前一年接收了放療和化療，藥物療程和射線(xiàn)劑量如下VP12+DDP 2療程，放療56gyU8天)，紫杉醇+DDP 3療程，肺門(mén)和縱隔淋巴結(jié)變小。 手術(shù)前3個(gè)月又出現(xiàn)肺門(mén)腫物增大，痰中找到腫瘤細(xì)胞，即行拓?fù)涮婵?DDP 3療程，肺門(mén)腫物見(jiàn)縮小后即實(shí)行手術(shù)。淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌組織經(jīng)NOD-SCID鼠體內(nèi)生長(zhǎng)形成移植瘤后再體外培養(yǎng)成功細(xì)胞株。
一種來(lái)源于人放化療后復(fù)發(fā)小細(xì)胞肺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶的細(xì)胞株的制備方法，包括以下步驟(1)組織塊機(jī)械解離將切除的人放化療后復(fù)發(fā)小細(xì)胞肺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶組織解離， 清洗去除雜質(zhì)，分離肺癌實(shí)質(zhì)組織，去除正常肺泡及支氣管組織和間質(zhì)組織，得到剩余的組織；(2)膠原酶消化將步驟(1)得到的剩余的組織清洗，然后加入膠原酶，孵育，過(guò)濾，然后收集腫瘤細(xì)胞，進(jìn)行接種培養(yǎng)，得到存活細(xì)胞；(3)對(duì)步驟(2)得到的存活細(xì)胞進(jìn)行純化，去除纖維細(xì)胞等雜質(zhì)，純化后的肺癌細(xì)胞連續(xù)培養(yǎng)并傳代大于12個(gè)月，即得細(xì)胞株。
作為本發(fā)明所述制備方法的優(yōu)選實(shí)施方式，所述制備方法包括以下步驟(1)組織塊機(jī)械解離將切除的人放化療后復(fù)發(fā)小細(xì)胞肺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶組織解離，清洗去除粘液和紅細(xì)胞等雜質(zhì)，分離肺癌實(shí)質(zhì)組織，去除正常肺泡及支氣管組織和間質(zhì)組織， 得到剩余的組織；(2)膠原酶消化將步驟(1)得到的剩余的組織切成Imm3的組織片，清洗組織片，讓組織片沉淀，去除上清液，把剩余組織再細(xì)切，清洗組織碎片，然后向組織片加入膠原酶，在 37°C下孵育4-18小時(shí)；過(guò)濾，然后收集腫瘤細(xì)胞，在含20%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基中懸浮細(xì)胞，進(jìn)行接種培養(yǎng)，得到存活細(xì)胞；(3)對(duì)步驟(2)得到的存活細(xì)胞進(jìn)行純化，去除纖維細(xì)胞等雜質(zhì)，純化后的肺癌細(xì)胞在含20%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基中連續(xù)培養(yǎng)并傳代大于12個(gè)月，即得細(xì)胞株。
作為本發(fā)明所述制備方法的優(yōu)選實(shí)施方式，所述步驟(1)為將切除的人放化療后復(fù)發(fā)小細(xì)胞肺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶組織解離成0. 5cm3，用100%的青-鏈霉素雙抗溶液浸泡移至生物安全柜，用消毒的PBS緩沖液反復(fù)清洗組織去除粘液和紅細(xì)胞等雜質(zhì)，再浸泡于培養(yǎng)基中移至解剖顯微鏡下，用兩個(gè)10號(hào)注射器針頭分離肺癌實(shí)質(zhì)組織，并去除正常肺泡及支氣管組織和間質(zhì)組織后，得到剩余的組織。
作為本發(fā)明所述制備方法的優(yōu)選實(shí)施方式，步驟(2)為使用無(wú)菌的解剖刀和剪子把步驟(1)得到的剩余的組織切成Imm3的組織片，用PBS緩沖液清洗組織片，讓組織片沉淀，去除上清液，用無(wú)菌解剖刀和剪子把剩余組織再細(xì)切，用PBS清洗組織碎片數(shù)次，然后加入膠原酶(50-200單位/ml，溶解在PBS中)，在37°C下孵育4_18小時(shí)，通過(guò)無(wú)菌不銹鋼絲網(wǎng)或尼龍網(wǎng)過(guò)濾細(xì)胞懸液，然后收集腫瘤細(xì)胞，在含20%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基中懸浮細(xì)胞，進(jìn)行接種培養(yǎng)，得到存活細(xì)胞。更優(yōu)選地，步驟(2)中，加入膠原酶的同時(shí)還加入有3mM的CaCl2。加入CaCl2可提高膠原酶對(duì)組織的解離效率。
作為本發(fā)明所述制備方法的優(yōu)選實(shí)施方式，步驟(3)中純化后的肺癌細(xì)胞的培養(yǎng)溫度為37°C，氣體環(huán)境為5%C02/95%空氣，濕度為飽和濕度，每3天更換一次培養(yǎng)液，每3_5 天傳代一次。
采用本發(fā)明所述制備方法得到人小細(xì)胞肺癌肺門(mén)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶來(lái)源細(xì)胞株 0225-12ScacLym，是從病理類(lèi)型為小細(xì)胞肺癌的肺癌病人經(jīng)歷過(guò)VP-16、卡鉬和紫杉醇化療和肺局部放療后的縱隔淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶切除物中培養(yǎng)成功，經(jīng)病理鑒定為小細(xì)胞肺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。所得細(xì)胞株為上皮樣細(xì)胞，具有典型的腫瘤細(xì)胞生物學(xué)特性，它能在體外連續(xù)長(zhǎng)期傳代，在體外培養(yǎng)一年，傳100多代，細(xì)胞仍然生長(zhǎng)增殖活躍，而且經(jīng)檢測(cè)，其一般生物學(xué)特性表明所述細(xì)胞株細(xì)胞小，胞漿較少，可成團(tuán)懸浮生長(zhǎng)，也可貼壁生長(zhǎng)，貼壁松散，接觸性生長(zhǎng)抑制消失。


圖1為本發(fā)明所述細(xì)胞株在400x倒置顯微鏡下的形態(tài)圖。
圖2為本發(fā)明所述細(xì)胞株種植在NOD-SCID鼠肩胛部皮下移植瘤組織的形態(tài)圖。
具體實(shí)施方式
為更好的說(shuō)明本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點(diǎn)，下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步描述。
實(shí)施例1本發(fā)明一種來(lái)源于人放化療后復(fù)發(fā)小細(xì)胞肺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶的細(xì)胞株，按照以下制備方法所得(1)組織塊機(jī)械解離將手術(shù)切除的人放化療后復(fù)發(fā)小細(xì)胞肺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶組織以消毒小剪刀迅速解離到0. 5cm3大小，用100%青-鏈霉素雙抗溶液浸泡移至生物安全柜，消毒PBS緩沖液反復(fù)清洗組織去除粘液和紅細(xì)胞等雜質(zhì)，再浸泡于培養(yǎng)基中移至解剖顯微鏡下，用兩個(gè)10號(hào)注射器針頭細(xì)心分離肺癌實(shí)質(zhì)組織，盡量去除正常肺泡及支氣管組織和間質(zhì)組織，得到剩余的組織；(2)膠原酶消化在解剖顯微鏡下去除肺癌標(biāo)本中的間質(zhì)組織后，使用無(wú)菌的解剖刀和剪子把步驟(1)所得的剩余的組織切成Imm3組織片，用PBS緩沖液清洗組織片。讓組織片沉淀，去除上清液，用無(wú)菌解剖刀和剪子把剩余組織再細(xì)切，用PBS清洗組織碎片數(shù)次，然后加入膠原酶(50-200單位/ml，溶解在PBS中)，在37°C孵育4_18小時(shí)后。在膠乳膠原酶的同時(shí)可加入3mM CaCl2,以提高膠原酶對(duì)組織的解離效率。通過(guò)無(wú)菌不銹鋼絲網(wǎng)或尼龍網(wǎng)過(guò)濾細(xì)胞懸液，以分離分散細(xì)胞、組織碎片和較大的碎片；對(duì)較大的組織碎片可以加入新鮮的膠原酶進(jìn)行進(jìn)一步的解離。消化完全后，收集腫瘤細(xì)胞，在含20%胎牛血清的高糖DMEM 培養(yǎng)基中懸浮細(xì)胞，進(jìn)行接種培養(yǎng)，得到存活細(xì)胞；(3)對(duì)步驟(2)所得存活細(xì)胞進(jìn)行純化，去除纖維細(xì)胞等雜質(zhì)細(xì)胞，純化后的肺癌細(xì)胞在含20%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為37°C，氣體環(huán)境為5% C02/95%空氣，濕度為飽和濕度，每3天更換一次培養(yǎng)液，每3-5天傳代一次，連續(xù)培養(yǎng)并傳代超過(guò)12 個(gè)月，得細(xì)胞株。
所述步驟(1)中的人放化療后復(fù)發(fā)小細(xì)胞肺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶組織，來(lái)源于一位M 歲男性肺癌病人的左肺門(mén)腫瘤病灶。病人在手術(shù)前一年接受了放療和化療，藥物療程和射線(xiàn)劑量如下VP16+DDP 2療程，放療56gy ( 天)，紫杉醇+DDP 3療程，肺門(mén)和縱隔淋巴結(jié)變小，手術(shù)前3個(gè)月又出現(xiàn)肺門(mén)腫物增大，痰中找到腫瘤細(xì)胞，即行拓?fù)涮婵?DDP 3療程， 肺門(mén)腫物見(jiàn)縮小后即實(shí)行手術(shù)。
所述步驟(3)得到的細(xì)胞株，于2010年4月1日送達(dá)中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，保藏編號(hào)為CCTCC NO :C201033，命名為人小細(xì)胞肺癌肺門(mén)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶來(lái)源細(xì)胞株 0225-12ScacLymo
實(shí)施例2本發(fā)明所述人小細(xì)胞肺癌肺門(mén)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶來(lái)源細(xì)胞株0225-12ScacLym的檢測(cè)鑒定 1、G6PD同工酶檢測(cè)物種來(lái)源(由中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心檢測(cè))。
本發(fā)明所述小細(xì)胞肺癌肺門(mén)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶來(lái)源細(xì)胞株0225-12SCaCLym，是一株中國(guó)南方人肺小細(xì)胞癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶來(lái)源細(xì)胞株，原始肺癌組織來(lái)源于病人縱隔淋巴結(jié)腫瘤轉(zhuǎn)移病灶，具體來(lái)源于一位M歲男性肺癌病人的左肺門(mén)腫瘤病灶。病人在手術(shù)前一年接受了放療和化療，藥物療程和射線(xiàn)劑量如下VP16+DDP 2療程，放療56gyU8天)，紫杉醇+DDP 3療程，肺門(mén)和縱隔淋巴結(jié)變小，手術(shù)前3個(gè)月又出現(xiàn)肺門(mén)腫物增大，痰中找到腫瘤細(xì)胞，即行拓?fù)涮婵?DDP 3療程，肺門(mén)腫物見(jiàn)縮小后即實(shí)行手術(shù)。淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌組織經(jīng)NOD-SCID 鼠體內(nèi)生長(zhǎng)形成移植瘤后再體外培養(yǎng)成功細(xì)胞株。
2、形態(tài)觀察主要觀察細(xì)胞的一般形態(tài)，如大體形態(tài)、核漿比例、染色質(zhì)和核仁大小、多少等，以及細(xì)胞骨架微絲微管的排列狀態(tài)等。
2. 1倒置光學(xué)顯微鏡主要在正常生長(zhǎng)狀態(tài)下觀察細(xì)胞的一般形態(tài)，如大體形態(tài)、核漿比例、粘附特性等。
在放大倍數(shù)為400x的倒置光學(xué)相差顯微鏡下觀察本發(fā)明所述小細(xì)胞肺癌肺門(mén)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶來(lái)源細(xì)胞株0225-12ScacLym，如附圖1所示，可見(jiàn)細(xì)胞體積小，核大，胞漿少，細(xì)胞與平皿之間貼附生長(zhǎng)，貼附不緊密，細(xì)胞可成團(tuán)半懸浮生長(zhǎng)。
2. 2免疫組化檢測(cè)細(xì)胞標(biāo)記蛋白采用S-P法進(jìn)行免疫組化染色，免疫組化染色S-P試劑盒購(gòu)自福州邁新生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司。所用的抗體為CK7、TTF-I、vimentin、EGFR、VEGF 和 NSE。
具體步驟為(1)待檢測(cè)細(xì)胞株提前M小時(shí)爬片于消毒載玻片上，M小時(shí)后，用PBS緩沖液沖洗2 次，冷丙酮固定15分鐘，浸泡于PBS中備用；(2)取所需玻片加1滴或50μ 1過(guò)氧化物酶阻斷溶液(試劑Α)室溫下孵育10分鐘，以阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶的活性；PBS沖洗三次，每次3分鐘；(3)除去PBS液，每張切片加1滴或50μ 1正常非免疫動(dòng)物血清(試劑B)，室溫下孵育 10分鐘；(4)除去血清，每張切片加1滴或50μ 1的第一抗體，室溫下孵育60分鐘；(5)PBS沖洗三次，每次3-5分鐘；除去PBS液，每張切片加一滴或50μ 1生物素標(biāo)記的第二抗體(試劑C)，室溫下孵育10分鐘；PBS沖洗三次，每次3分鐘；(6)除去PBS液，每張切片加1滴或50μ 1鏈霉菌抗生物素過(guò)氧化酶溶液(試劑D)，室溫下孵育10分鐘；PBS沖洗三次，每次3分鐘；(7)除去PBS液，每張切片加2滴或100μ 1新鮮配制的DAB或AEC溶液，顯微鏡下觀察 3-10分鐘；(8)自來(lái)水沖洗，蘇木素復(fù)染，PBS或自來(lái)水沖洗返藍(lán)；(9)DAB顯色，切片經(jīng)過(guò)梯度酒精脫水干燥，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封固。
免疫組化檢測(cè)結(jié)果判斷方法按細(xì)胞著色評(píng)分棕褐色3分；棕黃色2分；淡黃色 1分；無(wú)著色0分。同樣物鏡下計(jì)數(shù)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，按陽(yáng)性細(xì)胞的數(shù)量評(píng)分一個(gè)視野內(nèi)著色細(xì)胞>70%為4分；51%-75%為3分；11%_50%為2分；1%_10%為1分；陰性為0分。兩項(xiàng)得分相乘，滿(mǎn)3分為“ + ” ；4分為“++” ；5分以上為“+++”?！? +++”為陽(yáng)性表達(dá)。
本發(fā)明所述小細(xì)胞肺癌肺門(mén)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶來(lái)源細(xì)胞株0225-12SCaCLym的免疫組織化學(xué)染色顯示，其與來(lái)源的轉(zhuǎn)移灶腫瘤組織有著相似的蛋白表達(dá)，其突出的表達(dá)特征為 NES陽(yáng)性表達(dá)。
3、細(xì)胞生長(zhǎng)增殖檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)曲線(xiàn)、細(xì)胞分裂指數(shù)、倍增時(shí)間、細(xì)胞周期時(shí)間。
3.1 MTT法測(cè)定細(xì)胞生長(zhǎng)增殖和對(duì)藥物的敏感性(1)取96孔細(xì)胞制備板，每孔中加0.Iml含2X IO4 IOXlO4靶細(xì)胞的制備液(含10% 小牛血清的DMEM制備液)，在37°C 5% C02的飽和水汽二氧化碳制備箱中制備2_3小時(shí)，讓細(xì)胞貼壁；(2)用DMEM制備液0.1 100倍遞次配置藥物，每孔加0. Iml稀釋的藥物和待檢細(xì)胞， 每個(gè)稀釋度3個(gè)重復(fù)孔。對(duì)照孔9個(gè)3個(gè)陽(yáng)性對(duì)照孔，每孔加0. Iml含1000倍藥物的DMEM 制備液和細(xì)胞，3個(gè)陰性對(duì)照孔，每孔加不含藥物的0. Iml DMEM制備液和細(xì)胞，3個(gè)空白對(duì)照孔，每孔加0.1ml DMEM制備液，不加細(xì)胞。在37°C 5% CO2的飽和水汽二氧化碳制備箱中制備M 48小時(shí)或預(yù)定的時(shí)間；(3)吸去制備液，用PBS洗滌一次(如為懸浮細(xì)胞，應(yīng)在吸去上清液前離心制備板)；(4)每孔加0.Iml PBS和10 μ 1 MTT染液，在37°C 5% CO2的飽和水汽二氧化碳制備箱中制備4 6小時(shí)；(5)每孔加0.Iml酸化異丙醇，也可用含10% SDS的lOmmol/L HCl代替酸化異丙醇， 在振蕩器上振蕩混勻，讓還原產(chǎn)物充分溶解。置酶聯(lián)檢測(cè)儀上測(cè)定光密度(OD)值，檢測(cè)波長(zhǎng)570nm，參考波長(zhǎng)630nm。以O(shè)D值對(duì)樣品稀釋度作圖，比較標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)和待測(cè)樣品曲線(xiàn)即可求得待測(cè)樣品中細(xì)胞因子的含量。
3. 2細(xì)胞流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期與凋亡流式細(xì)胞儀是美國(guó)BECKMAN-COULTER(貝克曼-庫(kù)爾特)公司生產(chǎn)。機(jī)器型號(hào)ELITE， 激光波長(zhǎng)488nm，功率15麗。取IO6已固定的細(xì)胞，用PBS洗兩遍，去上清后加入300 μ 1 DNA染液(內(nèi)含碘化丙啶100 μ g/ml和RNase 20單位/ml)，室溫30min。上機(jī)激光管預(yù)熱30min后用熒光微球(美國(guó)BECKMAN-COULTER公司)調(diào)整儀器，使各放大器接收的信號(hào)的 HCV值<2%，收集12000個(gè)細(xì)胞，DNA周期分析用美國(guó)ΡΗΕ0ΝΙΧ公司的MULTYCYCLE軟件，最后計(jì)算出細(xì)胞各期的百分?jǐn)?shù)。另外，細(xì)胞凋亡是用儀器自帶軟件處理，直接得出細(xì)胞的凋亡率。
本發(fā)明所述小細(xì)胞肺癌肺門(mén)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶來(lái)源細(xì)胞株0225-12SCaCLym的體外倍增時(shí)間為31. 225h0
4、異體動(dòng)物接種向異體動(dòng)物體內(nèi)接種細(xì)胞懸液，觀察成瘤能力。采用皮下注射的方法，注射時(shí)用左手拇指及食指輕輕捏起皮膚，右手持注射器將針頭刺入，固定后在小鼠背部或前肢腋下進(jìn)行注射。
IO6個(gè)所述小細(xì)胞肺癌肺門(mén)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶來(lái)源細(xì)胞株0225-12SCaCLym細(xì)胞種植在 5只4周齡的NOD-SCID鼠肩胛部皮下，第2周種植部位均出現(xiàn)直徑為2mm的移植瘤，2個(gè)月后瘤體增大到1. 2cm,麻醉后處死動(dòng)物，移植瘤組織經(jīng)包埋切片HE染色，形態(tài)如附圖2所示， 放大倍數(shù)為200x的形態(tài)圖，細(xì)胞體積小，核大，核仁明顯，與來(lái)源的病人組織相似。
最后所應(yīng)當(dāng)說(shuō)明的是，以上實(shí)施例僅用以說(shuō)明本發(fā)明的技術(shù)方案而非對(duì)本發(fā)明保護(hù)范圍的限制，盡管參照較佳實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作了詳細(xì)說(shuō)明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的實(shí)質(zhì)和范圍。
權(quán)利要求
1.一種來(lái)源于人放化療后復(fù)發(fā)小細(xì)胞肺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶的細(xì)胞株，其特征在于，命名為人小細(xì)胞肺癌肺門(mén)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶來(lái)源細(xì)胞株0225-12ScacLym，保藏號(hào)為CCTCC NO C201033。
2.如權(quán)利要求1所述的來(lái)源于人放化療后復(fù)發(fā)小細(xì)胞肺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶的細(xì)胞株，其特征在于，所述細(xì)胞株在倒置顯微鏡下觀察顯示，細(xì)胞體積小，核大，胞漿少，細(xì)胞與平皿之間貼附生長(zhǎng)，貼附不緊密，細(xì)胞可成團(tuán)半懸浮生長(zhǎng)。
3.如權(quán)利要求1所述的來(lái)源于人放化療后復(fù)發(fā)小細(xì)胞肺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶的細(xì)胞株，其特征在于，所述細(xì)胞株的體外倍增時(shí)間為31. 22 ！。
4.如權(quán)利要求1所述的來(lái)源于人放化療后復(fù)發(fā)小細(xì)胞肺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶的細(xì)胞株，其特征在于，所述細(xì)胞株的蛋白表達(dá)特征為NSE陽(yáng)性表達(dá)。
5.一種來(lái)源于人放化療后復(fù)發(fā)小細(xì)胞肺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶的細(xì)胞株的制備方法，其特征在于，包括以下步驟(1)組織塊機(jī)械解離將切除的人放化療后復(fù)發(fā)小細(xì)胞肺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶組織解離， 清洗去除雜質(zhì)，分離肺癌實(shí)質(zhì)組織，去除正常肺泡及支氣管組織和間質(zhì)組織，得到剩余的組織；(2)膠原酶消化將步驟(1)得到的剩余的組織清洗，然后加入膠原酶，孵育，過(guò)濾，然后收集腫瘤細(xì)胞，進(jìn)行接種培養(yǎng)，得到存活細(xì)胞；(3)對(duì)步驟(2)得到的存活細(xì)胞進(jìn)行純化，去除纖維細(xì)胞等雜質(zhì)，純化后的肺癌細(xì)胞連續(xù)培養(yǎng)并傳代大于12個(gè)月，即得細(xì)胞株。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)一種來(lái)源于人放化療后復(fù)發(fā)小細(xì)胞肺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶的細(xì)胞株，所述細(xì)胞株命名為人小細(xì)胞肺癌肺門(mén)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶來(lái)源細(xì)胞株0225-12ScacLym，保藏號(hào)為CCTCCNOC201033。所述細(xì)胞株是從病理類(lèi)型為小細(xì)胞肺癌的肺癌病人經(jīng)歷過(guò)VP-16、卡鉑和紫杉醇化療和肺局部放療后的縱隔淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶切除物中培養(yǎng)制備所得，具有典型的腫瘤細(xì)胞生物學(xué)特性，能在體外連續(xù)長(zhǎng)期傳代。同時(shí)，本發(fā)明還公開(kāi)了所述細(xì)胞株的制備方法。
文檔編號(hào)C12N5/09GK102517254SQ20111045730
公開(kāi)日2012年6月27日 申請(qǐng)日期2011年12月31日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月31日
發(fā)明者何建行, 李慧靈 申請(qǐng)人:何建行, 廣州呼吸疾病研究所, 李慧靈