專利名稱：癌組織來源細(xì)胞塊及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及癌組織來源細(xì)胞塊及其制備方法。更詳細(xì)而言，本發(fā)明涉及可在體外重建癌且保持增殖能力的癌組織來源細(xì)胞塊。
背景技術(shù)：
近年來，為了攻克癌癥人們反復(fù)進(jìn)行了各種研究，因此早期癌癥的治療成果得到了飛躍性提高。但是，晚期癌癥的治療仍然是個(gè)難題，癌癥一直占據(jù)著日本人死因的第一位。根據(jù)厚生勞動(dòng)省于平成19年進(jìn)行的人口動(dòng)態(tài)統(tǒng)計(jì)，每年死于癌癥的人數(shù)超過34萬人。迄今為止的癌癥研究中，特別是在研究體外癌癥行為時(shí)，主要是在最適合培養(yǎng)的條件下使用次代培養(yǎng)而建立的癌細(xì)胞株來進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。這種癌細(xì)胞株包括人乳腺癌細(xì)胞株(MDF7、NCI/ADR HS578T、MDA-MB-22231/ATCC、MDA-MB-4335、MDA-N、BT-549、T-47D)、人宮頸癌細(xì)胞株(HeLa)、人肺癌細(xì)胞株(AM9、EKVX, H0P-62、H0P-92、NCI-H23、NCI-H226、 NCI-H322M、NCI-H460、NCI-H522)以及人大腸癌細(xì)胞株(Caco-2、COLO 205、HCC-2998、 HCT-15, HCT-116, HT29、KMl2, Sff-620)、人前列腺癌細(xì)胞株(DU-145, PC-3、LNCaP)等，上述細(xì)胞株被廣泛用于研究。為了實(shí)現(xiàn)對(duì)癌癥患者的個(gè)別診斷和治療等，業(yè)界認(rèn)為有望進(jìn)行癌細(xì)胞的原代培養(yǎng)，因此一直在進(jìn)行這方面的研究。例如，開發(fā)出了使用原代培養(yǎng)細(xì)胞的⑶-DST法(膠滴月中瘤藥敏試驗(yàn)，Collagen gel droplet embedded drug sensitivity test)等。這種體夕卜實(shí)驗(yàn)法是一種將從患者分離的組織或細(xì)胞包埋在膠原凝膠小滴內(nèi)，再結(jié)合三維培養(yǎng)技術(shù)和圖像比色定量法來進(jìn)行檢驗(yàn)的藥物敏感性試驗(yàn)(例如非專利文獻(xiàn)1)。但是，對(duì)于原代培養(yǎng)細(xì)胞，還未建立培養(yǎng)方法且操作困難。作為癌細(xì)胞的研究成果，相繼出現(xiàn)了支持構(gòu)成癌癥的癌細(xì)胞可能是由多個(gè)亞群組成，并且存在被稱為“腫瘤原始細(xì)胞”或者“腫瘤干細(xì)胞”的亞群的報(bào)告，上述亞群雖然為小群，但可進(jìn)行自我復(fù)制且可通過分化而成為大多數(shù)癌細(xì)胞的來源(例如非專利文獻(xiàn)2、3)。 這種干細(xì)胞，例如可通過將從生物體取出的腫瘤分離至單個(gè)細(xì)胞后再進(jìn)行分類來獲取，其中一些干細(xì)胞顯示出了體外增殖能力(非專利文獻(xiàn)4)。但是，也有報(bào)告否定了用干細(xì)胞來這樣解釋癌癥起源的說法(非專利文獻(xiàn)幻，這些報(bào)告仍是一種假設(shè)。雖然現(xiàn)在對(duì)癌癥的研究很廣泛，但是關(guān)于癌癥還存在諸多未知。1 Takamura Y, et al. , (2002) Prediction of chemotherapeutic response by collagen gel droplet embedded culture-drug sensitivity test in human breast cancers. Int. J. Cancer,98,450-455非專禾Ij 文獻(xiàn) 2 :Vermeulen L，et al.，(2008) Single-cell cloning of colon cancer stem cells reveals a multi—1ineage differentiation capacity. PNAS Vol. 105No. 3613427-13432非專利文獻(xiàn)3 :Ricci_Vitiani L，et al.，(2007) Identification and expansion ofhuman colon-cancer-initiating cells. Nature Vol. 445111-115
非專利文獻(xiàn) 4 :Todaro Μ, et al. , (2007)Colon cancer stem cells dictate tumor growth and resist cell death by production of interleukin-4. Cell Stem Celll :389-402非專禾Ij 文獻(xiàn) 5 :Shmelkov S V, et al.，(2008)CD133 expression is not restricted to stem cells,and both CD133+and CD133_metastatic colon cancer cells initiate tumors. The Journal of Clinical Investigation Vol. 1182111-2120

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種新的癌組織來源細(xì)胞塊，該癌組織來源細(xì)胞塊能夠在體外再現(xiàn)癌細(xì)胞在生物體內(nèi)的行為，并能夠通過藥物敏感性試驗(yàn)或射線敏感性試驗(yàn)等準(zhǔn)確驗(yàn)證在生物體內(nèi)的效果，還可用來作為癌癥分析和治療研究的試樣。本發(fā)明的目的還在于提供一種新的癌組織來源細(xì)胞塊，在向異種動(dòng)物的移植中， 少量的該細(xì)胞塊即具有充分的固定性，可用于制作簡(jiǎn)便的癌動(dòng)物模型，還可用來作為癌癥分析和治療研究的試樣。本發(fā)明人打算對(duì)各癌癥患者進(jìn)行治療敏感性試驗(yàn)，考慮到作為癌研究的研究材料而使用的細(xì)胞株對(duì)患者的癌來說有可能是異物，為了解決上述課題，本發(fā)明人對(duì)作為研究材料的癌細(xì)胞的原代培養(yǎng)法進(jìn)行了反復(fù)深入的研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)了新的癌組織來源細(xì)胞塊及其制備方法，從而完成本發(fā)明。即，本發(fā)明的目的在于提供一種在體外也能夠準(zhǔn)確反映出癌細(xì)胞在生物個(gè)體內(nèi)的行為的新的癌組織來源細(xì)胞塊及其制備方法。本發(fā)明涉及一種癌組織來源細(xì)胞塊，該細(xì)胞塊是從個(gè)體得到的癌組織中以含有3 個(gè)以上癌細(xì)胞的細(xì)胞塊的形式經(jīng)分離處理得到的分離物或其培養(yǎng)物，并且在體外能夠保持增殖能力。上述癌組織來源細(xì)胞塊可以通過包括以下工序的方法獲得，S卩，用含有膠原酶的酶對(duì)由上述個(gè)體得到的癌組織進(jìn)行處理的工序。作為這種酶，特別地，可以通過包括以下工序的方法獲得，S卩，用含有蛋白酶和膠原酶的混合酶進(jìn)行處理的工序，上述蛋白酶選自溶組織梭菌中性蛋白酶、嗜熱菌蛋白酶和分散酶中的1種以上，上述膠原酶選自膠原酶I、膠原酶II和膠原酶IV中的1種以上。上述混合酶可為L(zhǎng)IBERASE BLENDZYME 1 。本發(fā)明還涉及一種含有3個(gè)以上的癌細(xì)胞集合體且大致呈球形或橢球形的癌組織來源細(xì)胞塊。本發(fā)明還涉及一種癌組織來源細(xì)胞塊，該細(xì)胞塊含有3個(gè)以上的癌細(xì)胞集合體、 以及存在于該癌細(xì)胞集合體外周面的基底膜狀物，并大致呈球形或橢球形。上述癌組織來源細(xì)胞塊優(yōu)選實(shí)質(zhì)上不含有癌細(xì)胞以外的細(xì)胞。上述基底膜狀物可為層粘蛋白。上述癌組織來源細(xì)胞塊的直徑可為40 μ m 250 μ m。上述癌細(xì)胞可來源于上皮癌細(xì)胞。上述癌細(xì)胞可來源于大腸癌、卵巢癌、乳腺癌、肺癌、前列腺癌、腎癌、膀胱癌、咽喉癌、或胰腺癌。
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本發(fā)明還涉及一種癌組織來源細(xì)胞塊的制備方法，其包括對(duì)從生物體取出的癌組織碎片狀物進(jìn)行酶處理的工序、以及對(duì)該酶處理物中含有3個(gè)以上癌細(xì)胞的細(xì)胞塊進(jìn)行選擇回收的工序。上述制備方法進(jìn)一步包括對(duì)上述回收的成分進(jìn)行3個(gè)小時(shí)以上的培養(yǎng)的工序。上述選擇回收可使用篩來進(jìn)行回收。上述對(duì)含有3個(gè)以上癌細(xì)胞的細(xì)胞塊進(jìn)行選擇回收的工序，可以是對(duì)目徑為 40 μ m的篩的篩上成分且目徑為250 μ m的篩的篩下成分進(jìn)行回收的工序。上述酶可含有膠原酶。上述酶可以是含有蛋白酶和膠原酶的混合酶，上述蛋白酶選自溶組織梭菌中性蛋白酶、嗜熱菌蛋白酶和分散酶中的1種以上，上述膠原酶選自膠原酶I、膠原酶II和膠原酶IV中的1種以上。上述混合酶可為L(zhǎng)IBERASE BLENDZYME 1 。本發(fā)明還涉及通過上述制備方法得到的癌組織來源細(xì)胞塊。本發(fā)明的癌組織來源細(xì)胞塊，在體外能夠顯示出與生物體內(nèi)相同的行為，并且能夠?qū)︼@示這種行為的細(xì)胞塊進(jìn)行重建，而且經(jīng)過一定時(shí)間之后仍能保持增殖能力。這種癌組織來源細(xì)胞塊，能夠通過對(duì)癌細(xì)胞的培養(yǎng)而擴(kuò)增使用，并且能夠廣泛且方便地用于體外藥物敏感性試驗(yàn)或射線敏感性試驗(yàn)。由于對(duì)異種動(dòng)物的腫瘤固定性優(yōu)異，因此能夠用于制作簡(jiǎn)易的腫瘤形成動(dòng)物。


圖1是本發(fā)明的癌組織來源細(xì)胞塊的形成過程的示意圖。圖2是本發(fā)明的癌組織來源細(xì)胞塊的一個(gè)實(shí)施方式中，細(xì)胞表達(dá)表面抗原⑶133、 ⑶44、⑶166等的示意圖。圖3是體外培養(yǎng)過程中顯示本發(fā)明的癌組織來源細(xì)胞塊的形狀變化和增殖能力的圖。圖4是使用本發(fā)明的癌組織來源細(xì)胞塊，體外給予5-FU的藥物敏感性試驗(yàn)的結(jié)果示意圖。圖5是將本發(fā)明的癌組織來源細(xì)胞塊移植到小鼠而得的腫瘤組織(右)、與從癌組織來源細(xì)胞塊的來源的生物體內(nèi)取出的腫瘤組織(左)進(jìn)行比較的圖。圖6是使用本發(fā)明的癌組織來源細(xì)胞塊，進(jìn)行體外射線敏感性試驗(yàn)的結(jié)果示意圖。圖7是由各癌組織得到的本發(fā)明的癌組織來源細(xì)胞塊的示意圖，左起為大腸癌、 胰腺癌、卵巢癌(上段)；咽喉癌、乳腺癌、肺癌(中段)；前列腺癌、腎癌、膀胱癌(下段)。圖8是表示使用乳腺癌組織來源細(xì)胞塊，進(jìn)行激素敏感性培養(yǎng)試驗(yàn)的結(jié)果圖。圖9是由小鼠胰島細(xì)胞瘤得到的本發(fā)明的癌組織來源細(xì)胞塊的示意圖。圖10是將本發(fā)明的癌組織來源細(xì)胞塊進(jìn)行冷凍保存的前后(冷凍保存前(左) 以及溶解后M小時(shí)(右))狀態(tài)的比較圖。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明的癌組織來源細(xì)胞塊是從個(gè)體得到的癌組織中以含有3個(gè)以上癌細(xì)胞的細(xì)胞塊的形式經(jīng)分離處理而得到的分離物或其培養(yǎng)物，并且在體外能夠保持增殖能力。在此，“從個(gè)體得到的癌組織中以含有3個(gè)以上癌細(xì)胞的細(xì)胞塊的形式經(jīng)分離處理而得到的分離物”是指，對(duì)從生物體內(nèi)生成的癌中得到的癌組織進(jìn)行處理，從而得到含有3 個(gè)以上、優(yōu)選為8個(gè)以上癌細(xì)胞的分離物。這種分離物不含有已被分離成單個(gè)細(xì)胞的物質(zhì)， 并且不含有被分離成單個(gè)細(xì)胞后重建而成的重建物。但是，這種分離物不僅含有剛從生物體分離的物質(zhì)，還含有例如在生理鹽水中保持了一定時(shí)間的物質(zhì)、經(jīng)過冷凍或冷藏的物質(zhì)。從個(gè)體“得到的癌組織”是指，除了通過手術(shù)等取出而得的癌組織之外，還包括能夠利用注射針或內(nèi)窺鏡在體外進(jìn)行處理的用于組織檢查而得的癌組織。“從個(gè)體得到的癌組織中以含有3個(gè)以上癌細(xì)胞的細(xì)胞塊的形式經(jīng)分離處理而得到的分離物的培養(yǎng)物”是指，通過對(duì)分離物進(jìn)行體外培養(yǎng)而得到的培養(yǎng)物，上述分離物是指，對(duì)從生物體內(nèi)產(chǎn)生的癌中獲得的癌組織進(jìn)行處理，再以含有3個(gè)以上癌細(xì)胞的細(xì)胞塊的形式，將得到的處理物進(jìn)行分離處理而得到的分離物。對(duì)于培養(yǎng)時(shí)間沒有特別限定，只要是能夠在培養(yǎng)基中短時(shí)間存活的細(xì)胞塊即可。在多數(shù)情況下，這種培養(yǎng)物經(jīng)過一定時(shí)間的培養(yǎng)，優(yōu)選為3小時(shí)以上，會(huì)大致呈球形或橢球形。這里的培養(yǎng)物包括經(jīng)過上述一定時(shí)間后大致呈球形或橢球形的培養(yǎng)物、以及一定時(shí)間后仍為不定形的培養(yǎng)物。并且，這里所說的培養(yǎng)物還包括對(duì)上述大致呈球形或橢球形的培養(yǎng)物進(jìn)行進(jìn)一步分割而得到的不定形的培養(yǎng)物、以及通過進(jìn)一步培養(yǎng)而得到的大致呈球形或橢球形的培養(yǎng)物。本發(fā)明的癌組織來源細(xì)胞塊在體外“能夠保持增殖能力”是指，在37°C、5% CO2的培養(yǎng)箱的細(xì)胞培養(yǎng)條件下，能夠在至少10天以上、優(yōu)選為13天以上、進(jìn)一步優(yōu)選為30天以上的期間保持增殖能力。即使對(duì)這種癌組織來源細(xì)胞塊保持原樣持續(xù)培養(yǎng)，經(jīng)過10天以上、優(yōu)選為13天以上、進(jìn)一步優(yōu)選為30天以上的時(shí)間也仍然能夠保持增殖能力，而通過進(jìn)一步在培養(yǎng)過程中進(jìn)行定期機(jī)械分割，能夠保持實(shí)質(zhì)上的無限增殖能力。 除了可以使用手術(shù)刀、刀、剪刀以外，還可使用眼科尖刀等進(jìn)行機(jī)械分割?；蛘哌€可通過將注射針安裝在注射器上，對(duì)培養(yǎng)液和癌組織來源細(xì)胞塊反復(fù)吸入排出來進(jìn)行分割。本發(fā)明優(yōu)選使用例如Iml的注射器和27G的注射針，但并不受此限定。這里，對(duì)于本發(fā)明的癌組織來源細(xì)胞塊培養(yǎng)用培養(yǎng)基沒有特別限定，但優(yōu)選使用動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)用培養(yǎng)基。特別優(yōu)選使用干細(xì)胞培養(yǎng)用的無血清培養(yǎng)基。這種無血清培養(yǎng)基只要是用于培養(yǎng)干細(xì)胞的無血清培養(yǎng)基，則沒有特別限定。無血清培養(yǎng)基是指不含有沒有提煉或未純化的血清的培養(yǎng)基，可以添加純化了的血液來源成分或動(dòng)物組織來源成分(例如增殖因子)而使用?？梢詫⒂糜谂囵B(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)基作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基來制備本發(fā)明的無血清培養(yǎng)基。作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，例如可列舉BME培養(yǎng)基、BGJb培養(yǎng)基、CMRL 1066培養(yǎng)基、Glasgow MEM培養(yǎng)基、改良的MEM Zinc Option培養(yǎng)基、IMDM培養(yǎng)基、Medium 199培養(yǎng)基、Eagle MEM 培養(yǎng)基、α MEM培養(yǎng)基、DMEM培養(yǎng)基、RPMI 1640培養(yǎng)基、Fischer，s培養(yǎng)基，以及它們的組
口 O可以在這種無血清培養(yǎng)基中添加血清替代物來培養(yǎng)本發(fā)明的癌組織來源細(xì)胞塊。 血清替代物可適當(dāng)添加例如白蛋白、氨基酸(例如非必需氨基酸)、轉(zhuǎn)鐵蛋白、脂肪酸、胰島素、膠原蛋白前體、微量元素、2-巰基乙醇或3’ -硫醇甘油(3’ -thiolglycerol)，或者它們
6的同等物等。本發(fā)明的培養(yǎng)方法可使用市售的血清替代物。作為這種市售的血清替代物，例如可列舉 Knockout 血清替代品(KSR)、Chemically-defined Lipid concentrated 脂肪酸濃縮液(Gibco社制)、GlutamaX(Gibco社制)。用來培養(yǎng)本發(fā)明的癌組織來源細(xì)胞塊的培養(yǎng)基還可含有維生素、增殖因子、細(xì)胞因子、抗氧化劑、丙酮酸、緩沖劑、無機(jī)鹽類等?？墒褂萌我獾臒o血清培養(yǎng)基，特別優(yōu)選使用含有EGF和bFGF的無血清培養(yǎng)基、含有例如Knockout血清替代物(KSR，4 > 卜α 7工 > 社制)等血清替代物和bFGF的無血清培養(yǎng)基等。血清替代物或EGF等的含量?jī)?yōu)選為培養(yǎng)基整體的10 30% w/v.作為這種培養(yǎng)基沒有限定，作為市售品可列舉STEMPR0人ES細(xì)胞用無血清培養(yǎng)基 (Gibco) ο用于培養(yǎng)癌組織來源細(xì)胞塊的培養(yǎng)器只要是通常能夠進(jìn)行動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的培養(yǎng)器，則沒有特別限定，例如可列舉培養(yǎng)瓶、組織培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)皿、有蓋培養(yǎng)皿、組織培養(yǎng)皿、復(fù)合皿(multi dish)、微量板、微孔板、復(fù)合板(multi plate)、多孔板、腔室培養(yǎng)玻片、培養(yǎng)皿 (schale)、培養(yǎng)管、培養(yǎng)托盤、培養(yǎng)袋、培養(yǎng)轉(zhuǎn)瓶。優(yōu)選地，培養(yǎng)器無細(xì)胞粘附性，并且在培養(yǎng)基中與細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)等細(xì)胞支持用基質(zhì)共存，進(jìn)行三維培養(yǎng)。細(xì)胞支持用基質(zhì)可以用于粘附癌組織來源細(xì)胞塊粘附。作為這種細(xì)胞支持用基質(zhì)，可列舉使用了細(xì)胞外基質(zhì)的基質(zhì)膠，例如膠原凝膠、明膠、多聚-L-賴氨酸、多聚-D-賴氨酸、層粘蛋白、纖維連接蛋白。在想使本發(fā)明的癌組織來源細(xì)胞塊增殖的情況下，特別適合使用以上條件?？梢赃m當(dāng)設(shè)定其它培養(yǎng)條件，例如培養(yǎng)溫度雖沒有特別限定，但優(yōu)選約為30 40°C。最優(yōu)選為37°C。(X)2濃度例如約1 10%、優(yōu)選約為2 5%。本發(fā)明的癌組織來源細(xì)胞塊能夠在上述培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件下進(jìn)行培養(yǎng)。并且，培養(yǎng)癌組織來源細(xì)胞塊時(shí)，根據(jù)其個(gè)別的性質(zhì)，有時(shí)可優(yōu)選與其它細(xì)胞共同培養(yǎng)，或者有時(shí)有必要添加例如激素等追加的特殊補(bǔ)充物。具體地，可與飼養(yǎng)細(xì)胞一起進(jìn)行共同培養(yǎng)。作為飼養(yǎng)細(xì)胞，可使用胚胎成纖維細(xì)胞等的基質(zhì)細(xì)胞等。雖然沒有具體限定，但優(yōu)選NIH3T3等。或者，對(duì)于特定種類的乳腺癌、子宮癌、前列腺癌，優(yōu)選在存在激素的條件下進(jìn)行培養(yǎng)。具體而言，對(duì)于乳腺癌為雌激素、對(duì)于子宮癌為黃體酮、對(duì)于前列腺癌為睪酮等，但不受此限定，可添加各種激素并調(diào)整最適培養(yǎng)條件。此外，由于存在上述激素，通過研究癌組織來源細(xì)胞塊在培養(yǎng)后的行為是如何變化的，從而有可能能夠了解來源于患者的癌的激素依賴性，并能夠預(yù)測(cè)抗激素藥物治療的有效性。本發(fā)明的癌組織來源細(xì)胞塊還可以采用懸浮培養(yǎng)進(jìn)行培養(yǎng)。采用懸浮培養(yǎng)，在對(duì)培養(yǎng)器無粘附性的條件下，在培養(yǎng)基中培養(yǎng)癌組織來源細(xì)胞塊。作為這種懸浮培養(yǎng)，例如可列舉胚狀體培養(yǎng)法(Keller et al.，Curr. Opin. Cell Biol. 7，862-869 (1995))、SFEB 法(例如 Watanabe et al.，Nature Neuroscience 8，288_296θ005)；參照國(guó)際公開第 2005/123902號(hào))。雖然沒有特別限定，但例如可用于形成或維持大致呈球形且有時(shí)具有基底膜的穩(wěn)定的癌組織來源細(xì)胞塊。本發(fā)明的癌組織來源細(xì)胞塊中，含有剛從個(gè)體的癌組織來源細(xì)胞塊中進(jìn)行了分離處理的物質(zhì)，還含有經(jīng)過冷藏或冷凍保存后的物質(zhì)，并且還含有它們的培養(yǎng)物。培養(yǎng)時(shí)間可優(yōu)選為3小時(shí)以上、更優(yōu)選為10小時(shí)以上36小時(shí)、進(jìn)一步優(yōu)選為M小時(shí) 36小時(shí)以上。構(gòu)成癌組織來源細(xì)胞塊的癌細(xì)胞至少為3個(gè)以上、優(yōu)選為8個(gè)以上、更優(yōu)選為10 個(gè)以上、進(jìn)一步優(yōu)選為20個(gè)以上、最優(yōu)選為50個(gè)以上。在本發(fā)明的癌組織來源細(xì)胞塊為分離物的情況下，優(yōu)選為1000個(gè)以下、更優(yōu)選為500個(gè)以下左右。如果是培養(yǎng)分離物后的培養(yǎng)物，則可通過培養(yǎng)來增加該數(shù)量。但是，培養(yǎng)物優(yōu)選為1萬個(gè)以下、更優(yōu)選為5000個(gè)以下。本發(fā)明中提到“癌細(xì)胞”時(shí)，是指其常用的涵義，S卩，生物體內(nèi)的正常細(xì)胞中所見的秩序已經(jīng)紊亂的細(xì)胞，該細(xì)胞可無限制地分裂增殖并逃脫了細(xì)胞凋亡。更詳細(xì)而言，是指細(xì)胞增殖調(diào)控機(jī)能喪失或嚴(yán)重減弱的細(xì)胞，典型是指以下細(xì)胞以80%以上的高頻率獲得無限增殖能力，并且在多數(shù)情況下大部分還具有浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移能力，導(dǎo)致人特別是哺乳動(dòng)物死亡的且被認(rèn)為是惡性新生物的細(xì)胞。在本發(fā)明中，癌組織來源的種類并沒有特別限制，可以是在哺乳類等動(dòng)物體內(nèi)生成的淋巴瘤、胚細(xì)胞瘤、肉瘤、脂肪肉瘤、神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤、間皮瘤、神經(jīng)細(xì)胞瘤、腦膜瘤、腺瘤、黑素瘤、白血病、惡性淋巴瘤等，特別優(yōu)選在哺乳類的上皮細(xì)胞內(nèi)生成的腫瘤。這種在上皮細(xì)胞內(nèi)生成的腫瘤包括非小細(xì)胞肺癌、肝細(xì)胞癌、膽管癌、食道癌、胃癌、結(jié)腸直腸癌、胰腺癌、宮頸癌、卵巢癌、子宮內(nèi)膜癌、膀胱癌、咽喉癌、乳腺癌、唾液腺癌、腎癌、前列腺癌、陰唇癌、肛門癌、陰莖癌、睪丸癌、甲狀腺癌、頭頸癌。以哺乳類為代表的動(dòng)物并沒有特別限定， 例如可列舉猴和人等靈長(zhǎng)目動(dòng)物、小鼠和松鼠以及大鼠等嚙齒目動(dòng)物、兔形目動(dòng)物、狗和貓等食肉目動(dòng)物。其中，在本發(fā)明的癌組織來源細(xì)胞塊，特別優(yōu)選來源于大腸癌組織、卵巢癌組織、 乳腺癌組織、肺癌組織、前列腺癌組織、腎癌組織、膀胱癌組織、咽喉癌組織或者胰腺癌，但不受此限定。如果是來源于大腸癌組織的癌組織來源細(xì)胞塊，則所含有的癌細(xì)胞沒有特別限定，但有時(shí)可發(fā)現(xiàn)⑶133。對(duì)從在生物體內(nèi)生成的癌中獲得的癌組織進(jìn)行分離處理時(shí)，雖然沒有任何限定， 但包含對(duì)從個(gè)體所獲得的癌組織進(jìn)行的酶處理。可使用膠原酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、透明質(zhì)酸酶、溶組織梭菌中性蛋白酶、嗜熱菌蛋白酶和分散酶中的1種，或者它們的2種以上的組合來進(jìn)行酶處理。酶處理?xiàng)l件可以使用生理學(xué)上可接受的PH，例如約6 8、優(yōu)選為約7. 2 7. 6的緩沖等滲鹽溶液，例如在 PBS或Hank，s緩沖鹽溶液中，例如在約20 40°C、優(yōu)選為約25 39°C下，用于分解結(jié)締組織的充分時(shí)間，例如約1 180分鐘、優(yōu)選為30 150分鐘；用于分解結(jié)締組織的充分濃度,例如約0. 0001 5% w/v、優(yōu)選為約0. 001% 0. 5% w/v。雖然沒有限定，但該酶處理的條件包括用含有膠原酶的混合酶進(jìn)行處理的工序。 例如包括了用含有蛋白酶和膠原酶的混合酶進(jìn)行處理的工序，上述蛋白酶選自溶組織梭菌中性蛋白酶、嗜熱菌蛋白酶和分散酶中的1種以上，上述膠原酶選自膠原酶I、膠原酶II和膠原酶IV中的1種以上。對(duì)于這種混合酶沒有限定，但含有LIBERASE BLENDZYME 1 等。本發(fā)明癌組織來源細(xì)胞塊可含有3個(gè)以上的癌細(xì)胞集合體且大致呈球形或橢球形。雖沒有限定，但可含有存在于該癌細(xì)胞集合體外周面的基底膜狀物。
這里雖沒有特別限定，但在多數(shù)情況下，形成集合體的癌細(xì)胞的細(xì)胞表面含有選自 CD133、CD44、CD166、CD117、CD24 和 ESA 中的 1 種以上的表面抗原。CD133、CD44、CD166、 ⑶117丄擬4和ESA —般為在淋巴細(xì)胞等白血細(xì)胞、纖維原細(xì)胞、上皮細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞等細(xì)胞中表達(dá)的表面抗原。這些表面抗原除具有細(xì)胞-細(xì)胞間、細(xì)胞-基質(zhì)間的粘附功能以外，還與各種信號(hào)傳導(dǎo)相關(guān)，是各種干細(xì)胞的表面標(biāo)記。本發(fā)明中提到細(xì)胞群“表達(dá)”CD133等表面抗原時(shí)是指，在細(xì)胞群中存在的80%以上、優(yōu)選為90%以上、更優(yōu)選實(shí)質(zhì)上為全部的細(xì)胞顯示表面抗原的狀態(tài)。本說明書中，雖沒有限定“基底膜狀物”，但優(yōu)選為含有膠原蛋白、層粘蛋白、巢蛋白、硫酸類肝素蛋白多糖等蛋白聚糖，以及纖維連接蛋白等糖蛋白中的至少1種的物質(zhì)。本發(fā)明中，優(yōu)選含有層粘蛋白的基底膜狀物。層粘蛋白是構(gòu)成基底膜的高分子糖蛋白。層粘蛋白的功能復(fù)雜，例如該功能與以下細(xì)胞功能相關(guān)細(xì)胞粘附、細(xì)胞間信息傳導(dǎo)、正常細(xì)胞和癌細(xì)胞的增殖等。層粘蛋白具有 3個(gè)不同的亞單位分別通過雙硫鍵連接的結(jié)構(gòu)，因各亞單位的種類不同，而出現(xiàn)了 11種層粘蛋白。它們之中，層粘蛋白5通常只產(chǎn)生于上皮細(xì)胞，并作為具有促進(jìn)與上皮細(xì)胞基底膜的粘附和促進(jìn)運(yùn)動(dòng)功能的活性的成分而被人所知。這種層粘蛋白5具有以下結(jié)構(gòu)由α 3 鏈、β 3鏈、Y 2鏈各1條形成的復(fù)合體，特別地，認(rèn)為Y 2鏈?zhǔn)荓N5固有的，其它的LN分子種類中不含有。本發(fā)明的癌組織來源細(xì)胞塊可具有以下結(jié)構(gòu)癌細(xì)胞集合體的整個(gè)外周被形成有這種基底膜狀物的膜包圍。這種形態(tài)可以通過以下方法解析，即，用電子顯微鏡對(duì)癌組織來源細(xì)胞塊進(jìn)行觀察，或者對(duì)基底膜構(gòu)成要素進(jìn)行免疫染色，或結(jié)合上述兩種方法。例如，可以使識(shí)別層粘蛋白的抗體(例如，ν “ - 7 ^ F 'J、y ★社的小鼠層粘蛋白來源兔抗體)與癌組織來源細(xì)胞塊接觸來測(cè)定抗體抗原反應(yīng)，由此檢測(cè)層粘蛋白的存在。并且，也可以使用識(shí)別特定種類層粘蛋白的特異性抗體。例如，可使用例如，特別地，使對(duì)上述固有的Y2鏈或其斷片具有反應(yīng)性的抗體與癌組織來源細(xì)胞塊接觸來測(cè)定抗體反應(yīng)，由此檢測(cè)層粘蛋白的存在。在本發(fā)明的癌組織來源細(xì)胞塊中，根據(jù)細(xì)胞塊的大小，可形成數(shù)μ m左右、優(yōu)選為 40 120nm左右的薄膜狀基底膜狀物，但不受上述限定。本發(fā)明癌組織來源細(xì)胞塊的尺寸沒有限定，既包括粒徑或體積平均粒徑為 8μπι ΙΟμπι左右的不定形細(xì)胞塊，還包括經(jīng)過培養(yǎng)而長(zhǎng)大的Imm粒徑以上的細(xì)胞塊。優(yōu)選直徑為40 μ m 1000 μ m、更優(yōu)選為40 μ m 250 μ m、進(jìn)一步優(yōu)選為80 μ m 200 μ m。在多數(shù)情況下，本發(fā)明的癌組織來源細(xì)胞塊具有選自棚狀排列、片狀排列、重層排列以及合胞體狀排列中的1種以上的排列，但沒有特別限定。本發(fā)明的癌組織來源細(xì)胞塊可通過包括以下典型工序的方法來制備，S卩，對(duì)從生物體取出的癌組織的碎片狀物進(jìn)行酶處理的工序、以及對(duì)酶處理物中含有3個(gè)以上癌細(xì)胞的細(xì)胞塊進(jìn)行選擇回收的工序。并且，雖然沒有限定，但可通過包括以下工序的制造方法制備本發(fā)明癌組織來源細(xì)胞塊，即，對(duì)上述回收成分進(jìn)行3個(gè)小時(shí)以上培養(yǎng)的工序。
可以首先將從生物體取出的癌組織保持原樣進(jìn)行碎片化，此外，還可以在碎片化前先將其放置動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)用培養(yǎng)基內(nèi)。雖然沒有限定，但這種動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)用培養(yǎng)基中含有 Dulbecco，s MEM(DMEM F12 等)、Eagle，s MEM、RPMI、Ham，s F12,alpha MEM、Iscove，s 改良的Dulbecco’ s MEM等。此時(shí)，優(yōu)選在無細(xì)胞粘附性的培養(yǎng)器中進(jìn)行懸浮培養(yǎng)。優(yōu)選在碎片化前洗滌癌組織。雖然沒有特別限定，但可以使用以下溶液進(jìn)行這種洗滌醋酸緩沖溶液(醋酸+醋酸鈉)、磷酸緩沖溶液(磷酸+磷酸鈉)、檸檬酸緩沖溶液 (檸檬酸+檸檬酸鈉)、硼酸緩沖溶液、酒石酸緩沖溶液、Tris緩沖溶液、磷酸緩沖生理鹽水等緩沖溶液等。本發(fā)明中特別優(yōu)選能夠在HBSS中進(jìn)行組織洗滌。適當(dāng)?shù)南礈齑螖?shù)為1次至3次。可使用刀、剪刀、切割器(手動(dòng)、自動(dòng))等將洗滌后的組織分割來進(jìn)行碎片化。碎片化后的尺寸和形狀沒有特別限定，可以隨意分割，但優(yōu)選為Imm3 5mm3、更優(yōu)選為Imm3 2mm3的均勻尺寸。接著，將由此得到的碎片狀物進(jìn)行酶處理。這種酶處理可通過膠原酶、胰蛋白酶、 木瓜蛋白酶、透明質(zhì)酸酶、溶組織梭菌中性蛋白酶、嗜熱菌蛋白酶、以及分散酶中的1種、或者2種以上這些酶的組合來進(jìn)行處理。酶處理?xiàng)l件可以使用生理學(xué)上可接受的pH，例如約 6 8、優(yōu)選為約7. 2 7. 6的緩沖等滲鹽溶液，例如在PBS或Hank’ s緩沖鹽溶液中，例如在約20 40°C、優(yōu)選為約25 39°C下，用于分解結(jié)締組織的充分時(shí)間，例如約1 180分鐘、優(yōu)選為30 150分鐘；用于分解結(jié)締組織的充分濃度，例如約0. 0001 5% w/v、優(yōu)選為約 0. 001% 0. 5% w/vo雖沒有限定，但該酶處理的條件，例如可以用含有膠原酶的混合酶進(jìn)行處理。更優(yōu)選為用含有蛋白酶和膠原酶的混合酶進(jìn)行處理，上述蛋白酶選自溶組織梭菌中性蛋白酶、 嗜熱菌蛋白酶、以及分散酶中的1種以上；上述膠原酶選自膠原酶I、膠原酶II、以及膠原酶 IV中的1種以上。上述混合酶沒有限定，但含有LIBERASE BLENDZYME1 等。接著，優(yōu)選對(duì)由上述方法得到的酶處理物中含有3個(gè)以上癌細(xì)胞的細(xì)胞塊進(jìn)行選擇回收。選擇回收的方法沒有特別限定，可使用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的任何方法進(jìn)行尺寸分類。作為尺寸的分類方法，簡(jiǎn)便的方法有采用目視或相差顯微鏡進(jìn)行區(qū)分、或者利用篩子，但只要是本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠利用的粒徑區(qū)分法，則沒有特別限定。使用篩子時(shí)，優(yōu)選回收能通過篩目徑20 μ m且不能通過500 μ m的成分。更優(yōu)選回收能通過篩目徑40 μ m 且不能通過250 μ m的成分。其中，作為選擇對(duì)象的含有3個(gè)以上癌細(xì)胞的細(xì)胞塊是本發(fā)明癌組織來源細(xì)胞塊，具有一定范圍的尺寸。一定范圍的尺寸也包括體積平均粒徑為8 μ m 10 μ m左右的小尺寸，但接近球形時(shí)，指直徑為20 μ m以上500 μ m以下、優(yōu)選為30 μ m以上 400 μ m以下、更優(yōu)選為40 μ m以上250 μ m以下；為橢圓形時(shí)，指長(zhǎng)徑為20 μ m以上500 μ m 以下、優(yōu)選為30 μ m以上400 μ m以下、更優(yōu)選為40 μ m以上250 μ m以下；為不定形時(shí)，指體積平均粒徑為20 μ m以上500 μ m以下、優(yōu)選為30 μ m以上400 μ m以下、更優(yōu)選為40 μ m以上250 μ m以下?？梢允褂冒惭b有CXD相機(jī)的相差顯微鏡(1X70 ；才U )八卞社制)根據(jù)對(duì)粒度分布及粒子形狀的評(píng)價(jià)，來測(cè)定體積平均粒徑。由此得到的作為選擇回收成分的分離處理物或其培養(yǎng)物均為本發(fā)明的癌組織來源細(xì)胞塊。培養(yǎng)物可以是在培養(yǎng)基中短時(shí)間存活的選擇回收成分的分離物，也可以是經(jīng)過例如至少3小時(shí)以上、優(yōu)選為10小時(shí) 36小時(shí)、更優(yōu)選為M小時(shí) 36小時(shí)以上的培養(yǎng)時(shí)間，形成大致球形或者大致橢球形的形狀的培養(yǎng)物。培養(yǎng)時(shí)間可以超過36小時(shí)、數(shù)日、或者經(jīng)過10天以上、13天以上、或者30天以上?？梢栽谂囵B(yǎng)基中長(zhǎng)期保持原樣進(jìn)行培養(yǎng)，優(yōu)選為，通過在培養(yǎng)中途進(jìn)行定期機(jī)械分割，從而保持實(shí)質(zhì)上的無限增殖能力。由此得到的本發(fā)明的癌組織來源細(xì)胞塊在體外顯示了與生物體內(nèi)癌組織相同的行為，能夠穩(wěn)定地進(jìn)行培養(yǎng)，并且能夠保持增殖能力。因此，能夠有效用于例如對(duì)得到的癌組織來源的腫瘤具有敏感性的現(xiàn)有藥物種類的選定、或者針對(duì)每個(gè)患者是否對(duì)放射線敏感的個(gè)別確認(rèn)。藥物或者放射線敏感性可使用公知的所有方法，沒有特別限定。藥物敏感性可通過對(duì)體外癌組織來源細(xì)胞塊的增殖率進(jìn)行測(cè)定而得。該增殖率的測(cè)定例如包括對(duì)添加被檢藥物后、數(shù)小時(shí)后、或數(shù)日后的存活細(xì)胞數(shù)與對(duì)照例一起進(jìn)行目視觀察；在CCD相機(jī)照相后進(jìn)行圖像解析；或者對(duì)各細(xì)胞所含的由蛋白結(jié)合性色素(例如，硫氰酸鹽B)染色的蛋白量進(jìn)行比色測(cè)定等。并且，這種癌組織來源細(xì)胞塊也可用作篩選未知藥物。關(guān)于該未知藥物的敏感性， 也可通過進(jìn)行體外癌組織來源細(xì)胞塊的增殖率測(cè)定、或者進(jìn)行細(xì)胞存活判定來得到。增殖率的測(cè)定例如包括對(duì)添加被檢藥物后、數(shù)小時(shí)后、或數(shù)日后的存活細(xì)胞數(shù)與對(duì)照例一起進(jìn)行目視觀察；在CCD相機(jī)照相后進(jìn)行圖像解析；或者對(duì)各細(xì)胞所含的由蛋白結(jié)合性色素硫氰酸鹽B染色的蛋白量進(jìn)行比色測(cè)定；對(duì)SD(SuCCinyl dehidrogenase)活性進(jìn)行測(cè)定等。對(duì)所有人培養(yǎng)細(xì)胞的被檢化合物敏感性測(cè)定數(shù)據(jù)，即，抑制細(xì)胞增殖50%的濃度 (GI5tl)、外觀上抑制細(xì)胞增殖的濃度(TGI)以及細(xì)胞數(shù)減少了播種時(shí)50%的濃度(LC5tl)等， 能夠進(jìn)行計(jì)算、信息處理。GI5(i、TGI、LC50值分別由被測(cè)試的癌組織來源細(xì)胞塊的固有數(shù)值而得。求出其整體平均GI5(I、TGI、LC5tl值，再求出該平均值與每個(gè)細(xì)胞的Log GI5tl值之差， 以平均LogGI5tl值為基準(zhǔn)，將該差值的絕對(duì)值以正負(fù)表示。可以判斷正值越大是敏感性越高的藥物。作為使用本發(fā)明癌組織來源細(xì)胞塊的射線敏感性試驗(yàn)，包括以下公知試驗(yàn)單獨(dú)使用X射線、以鈷的放射性同位素為放射源的Y射線、用直線加速器將電子束加速的粒子線、由回旋加速器取出的α射線等重粒子線等，或者與放射增敏劑并用。此外，本發(fā)明的癌組織來源細(xì)胞塊，例如即使直徑100 μ m的癌組織來源細(xì)胞塊為 10個(gè)以下(相當(dāng)于1000個(gè)以下細(xì)胞)，向異種動(dòng)物移植的固定度也很高。因此，本發(fā)明的癌組織來源細(xì)胞塊能夠有效用于簡(jiǎn)易制作小鼠等癌模型動(dòng)物，并且能夠?qū)Ω鼑?yán)謹(jǐn)?shù)陌┙M織檢驗(yàn)、藥物敏感性評(píng)價(jià)、或者放射治療等治療狀態(tài)進(jìn)行評(píng)價(jià)。本發(fā)明的癌組織來源細(xì)胞塊能夠進(jìn)行冷凍保存，在通常的保存狀態(tài)下能夠保持其增殖能力。[產(chǎn)業(yè)上的可利用性]本發(fā)明的癌組織來源細(xì)胞塊，能夠在體外以可培養(yǎng)狀態(tài)進(jìn)行凍結(jié)保存，用途廣泛。 并且，能夠通過培養(yǎng)使其增殖，從而使來源于微量樣品的癌細(xì)胞增殖成為可能。此外，本發(fā)明的癌組織來源細(xì)胞塊，能夠廣泛用于藥物敏感性試驗(yàn)或者射線敏感性試驗(yàn)，并且能夠用于制作簡(jiǎn)易的腫瘤形成動(dòng)物。因此，本發(fā)明的癌組織來源細(xì)胞塊，能夠?yàn)楝F(xiàn)在常用于試錯(cuò)法或者聯(lián)合療法的抗癌藥或放射治療帶來飛躍改善。即，在進(jìn)行上述療法之前，能夠用分別從
11患者得到的癌組織來源細(xì)胞塊，預(yù)先對(duì)藥物或放射治療的效果進(jìn)行預(yù)測(cè)，從而可以僅給予患者有效的藥物。并且，由于本發(fā)明的癌組織來源細(xì)胞塊僅具有用注射針能夠采集的大小即可，因此可以從進(jìn)行手術(shù)前的患者上得到，從而能夠在減輕患者負(fù)擔(dān)的狀態(tài)下對(duì)抗癌藥和放射治療的效果進(jìn)行預(yù)測(cè)。[實(shí)施例]以下，通過實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行具體說明，但本發(fā)明不受這些實(shí)施例的限定。應(yīng)予說明，各實(shí)施例中份和％均以重量為基準(zhǔn)。以下如沒有特別規(guī)定的培養(yǎng)條件則均為在37°C、 5% CO2培養(yǎng)箱條件下。離心分離的條件如無特別說明，則為4°C、1000rpm、5分鐘。(實(shí)施例1)(來源于小鼠大腸癌移植腫瘤的癌組織來源細(xì)胞塊的制備)采用如下所述異種移植法制備小鼠大腸癌移植腫瘤。首先，無菌操作下，將手術(shù)取出的人腫瘤(大腸癌)標(biāo)本切細(xì)至約2mm3。接著，在重癥免疫不全小鼠(裸鼠、優(yōu)選N0D/SCID小鼠)的背部切開約5mm的小切口，剝離皮下組織。將預(yù)先準(zhǔn)備的腫瘤片插入皮下后，用皮膚縫合夾進(jìn)行縫合。約14天后至3個(gè)月后將一部分移植腫瘤作為皮下腫瘤進(jìn)行觀察。將得到的大腸癌小鼠在SPF(speCifiC pathogen free)飼養(yǎng)條件下進(jìn)行飼養(yǎng)，在腫瘤為Icm大小的時(shí)間點(diǎn)，取出腫瘤，回收至添加有20ml的DMEM(Gibco ； 11965-092)+1 % Pen Strep (Gibco ； 15140-022)(終濃度均為 100units/ml 盤尼西林，100 μ g/ml)的 50ml 離心管(IWAKI ；2345-050)中。接著，加入20ml HBSS(Gibco ； 14025-092)，通過翻轉(zhuǎn)混合對(duì)腫瘤進(jìn)行洗滌。再加入20ml新的HBSS，將該操作重復(fù)2次，將腫瘤組織轉(zhuǎn)移至IOcm組織培養(yǎng)皿(組織培養(yǎng)皿) (IWAKI ；3020-100)中。在該培養(yǎng)皿上，用手術(shù)刀除去壞死組織。將除去了壞死組織的腫瘤片，轉(zhuǎn)移至添加有HBSS 30ml的新的IOcm培養(yǎng)皿中。然后用手術(shù)刀將腫瘤片切成約2mm3的碎片。將HBSS和腫瘤碎片一起轉(zhuǎn)移至新的50ml離心管后，進(jìn)行離心分離，棄上清，用 20ml HBSS通過翻轉(zhuǎn)混合進(jìn)行洗滌。反復(fù)進(jìn)行離心分離及洗滌。然后，加入20ml的DMEM+1 % Pen Strep+0. 28U/ml (終濃度)Blendzyme 1 (Roche ；11988417001)并混合。將其轉(zhuǎn)移至100ml的錐形瓶中，在37°C 恒溫槽內(nèi)，一邊低速旋轉(zhuǎn)攪拌器一邊用LIBERASE BLENDZYME 1 ( α ν ^ T ^ 7 ^ r I”卞社制)進(jìn)行2小時(shí)的處理。接著，將酶處理物回收至50ml離心管中，進(jìn)行離心分離，棄上清，加入20ml HBSS 并混合。將通過不銹鋼篩(500μπι)并通過了濾器的成分回收至50ml離心管中，再進(jìn)行離心分離操作。棄上清，加入lmg/ml DNaseI溶液(Roche ； 128493 (10mg/ml stock 100 μ 1+PBS 900 μ 1)并混合，在4°C下靜置5分鐘，再加入20mlHBSS混合后，進(jìn)行離心分離，棄去上清液。與20ml HBSS混合后，以500-250-100 μ m階段性過篩，然后通過40 μ m細(xì)胞過濾網(wǎng)(BD ；352340)。在添加有HBSS 30ml的IOcm組織培養(yǎng)皿(組織培養(yǎng)皿)中浸入細(xì)胞過濾網(wǎng)，輕微搖動(dòng)以除去單細(xì)胞、40 μ m以下的小細(xì)胞塊、以及碎屑。將細(xì)胞過濾網(wǎng)轉(zhuǎn)移至添加有HBSS 30ml的其它的IOcm組織培養(yǎng)皿(組織培養(yǎng)皿)中，通過移液器(pipetting) 對(duì)捕獲在細(xì)胞過濾網(wǎng)上的細(xì)胞塊進(jìn)行回收。
然后，進(jìn)行數(shù)次與上述同樣的離心分離操作，在得到的成分中加入^ilStemPro hESC SFM(Gibco ;A10007-01)+8ng/ml bFGF (Invitrogen ； 13256-029)+0. ImM 2-巰基乙醇 (Wako ； 137-06862)+1% PenStrep+25 μ g/ml 兩性霉素 B(Wako ；541-01961)，混合后轉(zhuǎn)移至 6cm 未經(jīng)處理的皿(EIKENCHEMICAL ;AG2000)中。將其在37°C下5% CO2培養(yǎng)箱(寸> 3 —社制MC0-17AIC)中培養(yǎng)36小時(shí)。其結(jié)果如圖1所示，隨著時(shí)間的流逝，由不定形向完整的球形變化，在至少3 6 小時(shí)后為大致球形，在M小時(shí)后得到完全完整的球形癌組織來源細(xì)胞塊。(實(shí)施例2)(來源于人大腸癌手術(shù)樣品的癌組織來源細(xì)胞塊的制備)除了使用大腸癌手術(shù)樣品以外，采用與實(shí)施例1相同的方法獲取癌組織來源細(xì)胞塊。其結(jié)果如圖7所示，在至少12小時(shí)后得到了與圖1相同的大致球形的癌組織來源細(xì)胞塊。(實(shí)施例3)(來源于人卵巢癌手術(shù)樣品的癌組織來源細(xì)胞塊的制備)除了使用卵巢癌手術(shù)樣品以外，采用與實(shí)施例2相同的方法獲得癌組織來源細(xì)胞塊。其結(jié)果如圖7所示，在至少12小時(shí)后得到了與圖1相同的大致球形的癌組織來源細(xì)胞塊。(實(shí)施例4)(來源于人胰腺癌手術(shù)樣品的癌組織來源細(xì)胞塊的制備)除了使用胰腺癌手術(shù)樣品以外，采用與實(shí)施例2相同的方法獲得癌組織來源細(xì)胞塊。其結(jié)果如圖7所示，在至少12小時(shí)后得到了與圖1相同的大致球形的癌組織來源細(xì)胞塊。(實(shí)施例5)(來源于人小細(xì)胞癌手術(shù)樣品的癌組織來源細(xì)胞塊的制備)除了使用作為肺癌之一的小細(xì)胞癌手術(shù)樣品以外，采用與實(shí)施例2相同的方法獲得癌組織來源細(xì)胞塊。其結(jié)果如圖7所示，在至少12小時(shí)后得到了與圖1相同的大致球形的癌組織來源細(xì)胞塊。(實(shí)施例6)(來源于人腎癌手術(shù)樣品的癌組織來源細(xì)胞塊的制備)除了使用腎癌手術(shù)樣品以外，采用與實(shí)施例2相同的方法獲得癌組織來源細(xì)胞塊。其結(jié)果如圖7所示，在至少12小時(shí)后得到了與圖1相同的大致球形的癌組織來源細(xì)胞塊。(實(shí)施例7)(來源于人膀胱癌手術(shù)樣品的癌組織來源細(xì)胞塊的制備)除了使用膀胱癌手術(shù)樣品以外，采用與實(shí)施例2相同的方法獲得癌組織來源細(xì)胞塊。其結(jié)果如圖7所示，在至少12小時(shí)后得到了與圖1相同的大致球形的癌組織來源細(xì)胞塊。(實(shí)施例8)(來源于人乳腺癌手術(shù)樣品的癌組織來源細(xì)胞塊的制備)
除了使用乳腺癌手術(shù)樣品以外，采用與實(shí)施例2相同的方法獲得癌組織來源細(xì)胞塊。其結(jié)果如圖7所示，在至少12小時(shí)后得到了與圖1相同的大致球形的癌組織來源細(xì)胞塊。(實(shí)施例9)(來源于人前列腺癌手術(shù)樣品的癌組織來源細(xì)胞塊的制備)除了使用前列腺癌手術(shù)樣品以外，采用與實(shí)施例2相同的方法獲得組織來源的細(xì)胞塊。在培養(yǎng)基中添加10_8摩爾/L濃度的雙氫睪酮(DHT)，進(jìn)行與實(shí)施例1相同的培養(yǎng)。 其結(jié)果如圖7所示，在至少12小時(shí)后得到了與圖1相同的大致球形的癌組織來源細(xì)胞塊。(實(shí)施例10)(來源于人咽喉癌手術(shù)樣品的癌組織來源細(xì)胞塊的制備)除使用咽喉癌手術(shù)樣品以外，采用與實(shí)施例2相同的方法獲得癌組織來源細(xì)胞塊。其結(jié)果如圖7所示，在至少12小時(shí)后得到了與圖1相同的大致球形的癌組織來源細(xì)胞塊。(實(shí)施例11)(來源于乳腺癌的癌組織來源細(xì)胞塊的激素敏感性試驗(yàn))在與實(shí)施例8相同的培養(yǎng)基條件下，通過雌二醇的有無，來對(duì)從多名患者得到的乳腺癌組織來源細(xì)胞塊的狀態(tài)有怎樣的不同進(jìn)行調(diào)查。其結(jié)果如圖8所示，存在因添加雌二醇而促進(jìn)增殖的病例、以及對(duì)雌二醇無反應(yīng)的病例。并且可知在進(jìn)行來源于患者的激素療法時(shí)可被用來進(jìn)行敏感性試驗(yàn)。(實(shí)施例12)(來源于小鼠胰島細(xì)胞瘤的癌組織來源細(xì)胞塊的制備)RipTag是在大鼠胰島素啟動(dòng)子的控制下，強(qiáng)制性表達(dá)SV40-T抗原的轉(zhuǎn)基因小鼠的胰島中產(chǎn)生的腫瘤。除了使用RipTag小鼠的胰島細(xì)胞瘤以外，采用與實(shí)施例2相同的方法獲取癌組織來源細(xì)胞塊。其結(jié)果為，在至少12小時(shí)后，得到與圖1同樣的大致球形的癌組織來源細(xì)胞塊(圖9)。(實(shí)施例I3)將實(shí)施例2得到的如圖7所示的培養(yǎng)中的癌組織來源細(xì)胞塊，在培養(yǎng)后M小時(shí)， 與培養(yǎng)基一起取出5ml，在1000rpm、4°C下進(jìn)行離心分離，棄去上清液。將回收的癌組織來源細(xì)胞塊懸浮于細(xì)胞保存液(Cell Banker) (BLC-1、三菱化學(xué)乂 rM ^ >社制)中，再加入 ΙΟμΜ的Y27632(和光純藥工業(yè)社制)，移入冷凍保存管(Cryogenic vials 2. 0ml、Nalge Nunc社制)中，在_80°C低溫冰箱中保存。保存后經(jīng)過7天后，在37°C水浴中迅速復(fù)溫。將其懸浮于PBS中，在1000rpm、4°C 下進(jìn)行離心分離，棄去上清液。將得到的沉淀物懸浮于MemPro ( 4 > e卜α社制)中，進(jìn)行培養(yǎng)。如圖10所示，溶解后M小時(shí)的細(xì)胞狀態(tài)良好。并且，通過將含有約1000個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞塊植入NOD-SCID小鼠中，來確認(rèn)存活的得到的癌組織來源細(xì)胞塊。(比較例1)使用人大腸癌手術(shù)樣品，按照文獻(xiàn)記載的方法(Todaro M et al. , (2007) Colon cancer stem cells dictate tumor growth and resist cell death by productionofinterleukin-4. Cell Stem Cell 1 :389-402)，處理成單細(xì)胞，制備試樣。但是，進(jìn)行了單細(xì)胞處理并挑選后的CD133陽性細(xì)胞，未發(fā)現(xiàn)在體外的增殖。按照下述方法對(duì)實(shí)施例等中的評(píng)價(jià)項(xiàng)目進(jìn)行測(cè)定。〈表面抗原的識(shí)別〉將實(shí)施例1得到的癌組織來源細(xì)胞塊用胰蛋白酶*EDTA分散成單細(xì)胞。將這些細(xì)胞與用熒光標(biāo)記的表面抗原特異性抗體反應(yīng)后，用流式細(xì)胞儀法進(jìn)行解析。如圖2所示，結(jié)果發(fā)現(xiàn)存在同時(shí)均勻表達(dá)表面抗原的細(xì)胞?！椿啄钗锏拇_認(rèn)〉將實(shí)施例1得到的癌組織來源細(xì)胞塊，在溫度37°C、5% CO2培養(yǎng)箱的培養(yǎng)條件下， 用STEMPR0人ES細(xì)胞用無血清培養(yǎng)基(Gibco) Icc進(jìn)行3天培養(yǎng)。將其用福爾馬林固定后包埋石蠟，切成薄片，按照制造商的說明書進(jìn)行抗層粘蛋白抗體染色Wu ^ κ 'j、y ★社制、小鼠層粘蛋白來源的兔抗體)后，對(duì)在癌組織來源細(xì)胞塊的外周以及靠近外周的細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的層粘蛋白的抗原性進(jìn)行觀察。由此發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的癌組織來源細(xì)胞塊，在癌細(xì)胞集合體的周邊包圍有層粘蛋白。另一方面，手術(shù)樣品處理后M小時(shí)無法確認(rèn)層粘蛋白的表達(dá)。〈低氧的檢測(cè)〉使用哌莫硝唑進(jìn)行低氧檢測(cè)的例子硝基咪唑類化合物哌莫硝唑，具有在無氧條件下形成蛋白或核酸與Adduct的特性。低氧下，可以使用特異識(shí)別哌莫硝唑的抗體，對(duì)經(jīng)哌莫硝唑處理的組織的低氧區(qū)域進(jìn)行識(shí)別。癌組織中離開血管約IOOym時(shí)，則出現(xiàn)低氧區(qū)域，在距離實(shí)施例1中得到的癌組織來源細(xì)胞塊外緣約ΙΟΟμπι的范圍內(nèi)，在其內(nèi)部的低氧區(qū)域也觀察到了大面積的細(xì)胞死亡。<對(duì)體外增殖能力的評(píng)價(jià)>體外癌組織來源細(xì)胞塊的增殖能力，通過下述方法進(jìn)行驗(yàn)證。將每10個(gè)從實(shí)施例1得到的癌組織來源細(xì)胞塊包埋于膠原凝膠(CellMatrix typeIA(Nitta Gelatin) :5x DMEM(Gibco ； 12100-038)凝膠重建用緩沖溶液(50mM NaOH, 260mM NaHCO3, 200mM HEPES) =7:2: 1)中，在溫度37°C、5% CO2培養(yǎng)箱的培養(yǎng)條件下，在STEMPR0人ES細(xì)胞用無血清培養(yǎng)基(Gibco) Icc中進(jìn)行培養(yǎng)。定期對(duì)細(xì)胞狀態(tài)進(jìn)行觀察，用安裝有CCD相機(jī)的相差顯微鏡(倍率40倍)測(cè)定其大小。結(jié)果如圖3所示，沒有機(jī)械分割能夠保持至少13天的增殖能力。并且確認(rèn)，在第13天進(jìn)行機(jī)械分割后，還能夠保持至少13天的增殖能力。應(yīng)予說明，機(jī)械分割是使用眼科尖刀將直徑500 μ m的癌組織來源細(xì)胞塊分成4份?！醇?xì)胞數(shù)的確認(rèn)〉采用與實(shí)施例1相同的方法，將100 250 μ m的癌組織來源細(xì)胞塊用胰蛋白酶 0. 25%, EDTA2. 6mM處理3分鐘，通過約30次的移液(pipetting)進(jìn)行機(jī)械分解。以每孔一個(gè)細(xì)胞的比例，將上述處理液稀釋分注在96孔培養(yǎng)板中。對(duì)于未單細(xì)胞化的細(xì)胞塊，對(duì)構(gòu)成的細(xì)胞數(shù)進(jìn)行計(jì)數(shù)并記錄。然后，進(jìn)行培養(yǎng)(在與上述相同的條件下)，記錄各孔增加的細(xì)胞數(shù)，進(jìn)行30天的培養(yǎng)觀察。其結(jié)果確認(rèn)，如果有3個(gè)細(xì)胞則能夠成長(zhǎng)成細(xì)胞塊?！此幬锩舾行栽囼?yàn)〉使用5-FU對(duì)實(shí)施例2的試樣進(jìn)行藥物敏感性試驗(yàn)，已知該5-FU會(huì)與作為DNA合成所必須的代謝過程中的胸苷酸合酶結(jié)合，來阻礙DNA合成。試驗(yàn)方法如下將每10個(gè)癌
15組織來源細(xì)胞塊包埋于膠原凝膠(CellMatrix typeIA(Nitta Gelatin) :5x DMEM(Gibco ； 12100-038)凝膠重建用緩沖溶液(50mM NaOH, 260mM NaHCO3, 200mM HEPES) =7:2:1) 中，在溫度37°C、5 % CO2培養(yǎng)箱的培養(yǎng)條件下，在STEMPR0人ES細(xì)胞用無血清培養(yǎng)基 (Gibco) Icc 中進(jìn)行培養(yǎng)。然后，使用 0. 01yg/ml,0. 1 μ g/ml、1 μ g/ml、10 μ g/ml、100 μ g/ ml濃度的5-FU，分別對(duì)培養(yǎng)第O天和第8天的狀態(tài)進(jìn)行比較評(píng)價(jià)。其結(jié)果如圖4所示。關(guān)于癌組織來源細(xì)胞塊的面積的增大率，是將未使用藥物培養(yǎng)下的面積的增大率作為1，而進(jìn)行相對(duì)表示的。圖4中證實(shí)，5-FU能夠濃度依賴性地抑制培養(yǎng)第8天的癌細(xì)胞增殖，從而證明本發(fā)明的癌組織來源細(xì)胞塊在藥物敏感性試驗(yàn)中有效。<移植到異種動(dòng)物的試驗(yàn)>將10個(gè)實(shí)施例2得到的本發(fā)明培養(yǎng)了 3天的直徑約100 μ m的癌組織來源細(xì)胞塊懸浮于基質(zhì)膠(BD社)中，并移植到NOD-SCID小鼠的背部皮下。通過對(duì)腫瘤尺寸進(jìn)行經(jīng)時(shí)測(cè)定，來評(píng)價(jià)腫瘤的形成。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在移植有本發(fā)明實(shí)施例2的癌組織來源細(xì)胞塊的小鼠個(gè)體中有明顯腫瘤形成，從而能夠確認(rèn)本發(fā)明的癌組織來源細(xì)胞塊具有很高的腫瘤形成能力。對(duì)該組織進(jìn)行解析，則可知移植到小鼠所形成的腫瘤與生物體內(nèi)存在的腫瘤具有相似的組織類型(圖5)?！捶派渚€照射試驗(yàn)〉將實(shí)施例2得到的本發(fā)明所使用的直徑約100 μ m的癌組織來源細(xì)胞塊包埋到膠原凝膠(CellMatrix typeIA (Nitta Gelatin) :5x DMEM (Gibco ； 12100-038)凝膠重建用緩沖溶液(50mM NaOH, 260mM NaHCO3, 200mM HEPES) =7:2:1)中，在溫度 37°C、5% (X)2 培養(yǎng)箱的培養(yǎng)條件下，接種10個(gè)到STEMPR0人ES細(xì)胞用無血清培養(yǎng)基(Gibco) Icc中，進(jìn)行培養(yǎng)。向其照射以鈷的放射性同位素為放射源的Y射線，確認(rèn)細(xì)胞塊的狀況。其結(jié)果如圖6所示。圖6證實(shí)，至培養(yǎng)第8天，可照射量依賴性地抑制癌細(xì)胞增殖，從而證明本發(fā)明的癌組織來源細(xì)胞塊在放射線照射試驗(yàn)中有效。
權(quán)利要求
1.一種癌組織來源細(xì)胞塊，其是從個(gè)體得到的癌組織中以含有3個(gè)以上癌細(xì)胞的細(xì)胞塊的形式經(jīng)分離處理而得到的分離物或其培養(yǎng)物，其中，所述細(xì)胞塊在體外能夠保持增殖能力。
2.如權(quán)利要求1所述的癌組織來源細(xì)胞塊，該細(xì)胞塊通過包括以下工序的方法獲得， 即，用含有膠原酶的酶對(duì)由個(gè)體得到的癌組織進(jìn)行處理的工序。
3.如權(quán)利要求2所述的癌組織來源細(xì)胞塊，該細(xì)胞塊通過包括以下工序的方法獲得， 即，用含有蛋白酶和膠原酶的混合酶對(duì)由個(gè)體得到的癌組織進(jìn)行處理的工序，所述蛋白酶選自溶組織梭菌中性蛋白酶、嗜熱菌蛋白酶和分散酶中的1種以上，所述膠原酶選自膠原酶I、膠原酶II和膠原酶IV中的1種以上。
4.如權(quán)利要求3所述的癌組織來源細(xì)胞塊，其中，所述混合酶為L(zhǎng)IBERASEBLENDZYME1 。
5.一種癌組織來源細(xì)胞塊，其含有3個(gè)以上的癌細(xì)胞集合體且大致呈球形或橢球形。
6.一種癌組織來源細(xì)胞塊，其含有3個(gè)以上的癌細(xì)胞集合體、以及存在于該癌細(xì)胞集合體外周面的基底膜狀物，并大致呈球形或橢球形。
7.如權(quán)利要求1至6中任一項(xiàng)所述的癌組織來源細(xì)胞塊，其實(shí)質(zhì)上不含有癌細(xì)胞以外的細(xì)胞。
8.如權(quán)利要求6或7所述的癌組織來源細(xì)胞塊，其中，所述基底膜狀物為層粘蛋白。
9.如權(quán)利要求1至8中任一項(xiàng)所述的癌組織來源細(xì)胞塊，其直徑為40μ m 250 μ m。
10.如權(quán)利要求1至9中任一項(xiàng)所述的癌組織來源細(xì)胞塊，其中所述癌細(xì)胞來源于上皮癌細(xì)胞。
11.如權(quán)利要求10所述的癌組織來源細(xì)胞塊，其中，所述癌細(xì)胞來源于大腸癌、卵巢癌、乳腺癌、肺癌、前列腺癌、腎癌、膀胱癌、咽喉癌、胰腺癌。
12.—種癌組織來源細(xì)胞塊的制備方法，其包括對(duì)從生物體取出的癌組織碎片狀物進(jìn)行酶處理的工序、以及對(duì)該酶處理物中含有3個(gè)以上癌細(xì)胞的細(xì)胞塊進(jìn)行選擇回收的工序。
13.如權(quán)利要求12所述的癌組織來源細(xì)胞塊的制備方法，該制備方法進(jìn)一步包括對(duì)所述回收的成分進(jìn)行3個(gè)小時(shí)以上的培養(yǎng)的工序。
14.如權(quán)利要求12或13所述的癌組織來源細(xì)胞塊的制備方法，其中，所述選擇回收是使用篩來進(jìn)行回收的。
15.如權(quán)利要求12至14任一項(xiàng)所述的癌組織來源細(xì)胞塊的制備方法，其中，所述對(duì)含有3個(gè)以上癌細(xì)胞的細(xì)胞塊進(jìn)行選擇回收的工序，是對(duì)目徑為40 μ m的篩的篩上成分且目徑為250 μ m的篩的篩下成分進(jìn)行回收的工序。
16.如權(quán)利要求12所述的制備方法，其中，所述酶是含有膠原酶的酶。
17.如權(quán)利要求16所述的癌組織來源細(xì)胞塊的制備方法，其中，所述酶為含有蛋白酶和膠原酶的混合酶，所述蛋白酶選自溶組織梭菌中性蛋白酶、嗜熱菌蛋白酶和分散酶中的1 種以上，所述膠原酶選自膠原酶I、膠原酶II和膠原酶IV中的1種以上。
18.如權(quán)利要求17所述的癌組織來源細(xì)胞塊的制備方法，其中，所述混合酶為 LIBERASE BLENDZYME 1 Q
19.一種癌組織來源細(xì)胞塊，其通過權(quán)利要求12至18任一項(xiàng)所述的制備方法而得。
全文摘要
本發(fā)明目的在于提供一種新的癌組織來源細(xì)胞塊及其制備方法，該細(xì)胞塊能夠準(zhǔn)確反映出癌細(xì)胞在生物體內(nèi)的行為。并且本發(fā)明制備一種癌組織來源細(xì)胞塊，該細(xì)胞塊是從個(gè)體得到的癌組織中以含有3個(gè)以上癌細(xì)胞的細(xì)胞塊的形式經(jīng)分離處理而得到的分離物或其培養(yǎng)物，在體外能夠保持增殖能力。這種癌組織來源細(xì)胞塊例如可以采用包括以下工序的制備方法獲得對(duì)從生物體取出的癌組織碎片狀物進(jìn)行酶處理的工序、以及對(duì)該酶處理物中含有3個(gè)以上癌細(xì)胞的細(xì)胞塊進(jìn)行選擇回收的工序。
文檔編號(hào)C12N5/09GK102439139SQ20108000996
公開日2012年5月2日 申請(qǐng)日期2010年3月1日 優(yōu)先權(quán)日2009年3月2日
發(fā)明者井上正宏, 大植雅之 申請(qǐng)人:地方獨(dú)立行政法人大阪府立病院機(jī)構(gòu), 株式會(huì)社Rei醫(yī)學(xué)