專利名稱：一種來源于人肺未分化癌的細(xì)胞株及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種人肺癌細(xì)胞株及其制備方法，尤其是一種來源于人肺未分化癌的細(xì)胞株及其制備方法。
背景技術(shù)：
腫瘤是嚴(yán)重危害人類健康的主要疾病之一，世界衛(wèi)生組織發(fā)表的一項(xiàng)研究報(bào)告表明，全球癌癥狀況將日益嚴(yán)重，因此，深入研究腫瘤發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制，尋找更為有效的腫瘤治療方案，成為當(dāng)今醫(yī)學(xué)研究的前沿課題。隨著腫瘤生物學(xué)研究的不斷深入，腫瘤的早期診斷及預(yù)防水平有了較大的提高，但是腫瘤治療后的高轉(zhuǎn)移及高復(fù)發(fā)仍是腫瘤臨床治療中一個(gè)亟待解決的難題。近年來，“腫瘤干細(xì)胞”學(xué)說的提出及其研究進(jìn)展，從一個(gè)全新的角度去認(rèn)識腫瘤。該學(xué)說認(rèn)為，腫瘤中存在一部分獨(dú)特的具有自我更新和分化功能的干細(xì)胞樣亞群并將之稱為腫瘤干細(xì)胞，這一亞群細(xì)胞正是腫瘤的起源細(xì)胞并維持腫瘤的生長。因此，腫瘤細(xì)胞株是研究細(xì)胞癌變機(jī)理、腫瘤轉(zhuǎn)移、腫瘤放療和化療敏感性分子基礎(chǔ)等生物醫(yī)學(xué)問題的重要材料，建立和鑒定不同的腫瘤細(xì)胞株是一項(xiàng)很有意義的工作。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種來源于人肺未分化癌的細(xì)胞株，所述細(xì)胞株具有典型的腫瘤細(xì)胞生物學(xué)特性；同時(shí)，還提供一種所述細(xì)胞株的制備方法。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案為一種來源于人肺未分化癌的細(xì)胞株， 命名為人肺癌細(xì)胞株0114，保藏號為CCTCC NO :C201026。所述細(xì)胞株在電鏡下觀察顯示，細(xì)胞表面長絨毛，細(xì)胞間絨毛交纏，連接緊密，核大，核膜邊緣分布有異染色質(zhì)，細(xì)胞器以線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)較多，線粒體多為斑馬樣線粒體。所述細(xì)胞株在倒置顯微鏡下觀察有兩種生長形態(tài)，一種為懸浮生長，細(xì)胞折光性較好，胞漿豐富，含有大量折光性物質(zhì)，一種為貼壁生長，細(xì)胞間連接緊密，細(xì)胞間界限不清，細(xì)胞與平皿之間緊密貼附，不易消化分散；懸浮細(xì)胞可以向貼壁細(xì)胞轉(zhuǎn)化，一旦貼壁，便不易脫落。所述細(xì)胞株的體外倍增時(shí)間為42. 685h。所述細(xì)胞株的蛋白表達(dá)特征為vimentin、CK7和TTF-1均表達(dá)陽性。所述細(xì)胞株的染色體數(shù)為40-52條。本發(fā)明所述人肺癌細(xì)胞株0114，是一株中國南方人肺未分化癌細(xì)胞株，來源于一位59歲女性肺癌病人的左下肺癌病灶。病人在接受手術(shù)前未接受任何化療、放療及靶向治療等治療，術(shù)中發(fā)現(xiàn)肺部腫瘤位于左下肺，質(zhì)地脆軟，大量壞死，局部侵潤生長，壁胸膜廣泛轉(zhuǎn)移。所述來源于人肺未分化癌的細(xì)胞株，是從病理類型為未分化癌的肺癌病人肺部腫塊切除物中培養(yǎng)所得，經(jīng)病理鑒定為肺未分化癌，為多邊形上皮細(xì)胞，具有典型的腫瘤細(xì)胞生物學(xué)特性，它能在體外連續(xù)長期傳代，在體外制備一年，傳100多代，細(xì)胞仍然生長增殖活躍。 一種來源于人肺未分化癌的細(xì)胞株的制備方法，包括以下步驟
(1)組織塊機(jī)械解離將切除的人肺未分化癌組織解離，清洗去除雜質(zhì)，分離肺癌實(shí)質(zhì)組織，去除正常肺泡及支氣管組織和間質(zhì)組織，得到剩余的組織；
(2)膠原酶消化將步驟(1)得到的剩余的組織切成組織片，清洗，然后向組織片加入膠原酶，孵育，過濾，然后收集腫瘤細(xì)胞，進(jìn)行接種培養(yǎng)，得到存活細(xì)胞；
(3)對步驟(2)得到的存活細(xì)胞進(jìn)行純化，去除纖維細(xì)胞等雜質(zhì)，純化后的肺癌細(xì)胞連續(xù)培養(yǎng)并傳代大于12個(gè)月，即得細(xì)胞株。作為本發(fā)明所述制備方法的優(yōu)選實(shí)施方式，所述制備方法包括以下步驟
(1)組織塊機(jī)械解離將切除的人肺未分化癌組織解離，清洗去除粘液和紅細(xì)胞等雜質(zhì)，分離肺癌實(shí)質(zhì)組織，去除正常肺泡及支氣管組織和間質(zhì)組織，得到剩余的組織；
(2)膠原酶消化將步驟(1)得到的剩余的組織切成Imm3的組織片，清洗組織片，讓組織片沉淀，去除上清液，把剩余組織再細(xì)切，清洗組織碎片，然后向組織片加入膠原酶，在 37°C下孵育4-18小時(shí)；過濾，然后收集腫瘤細(xì)胞，在含20%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基中懸浮細(xì)胞，進(jìn)行接種培養(yǎng)，得到存活細(xì)胞；
(3)對步驟(2)得到的存活細(xì)胞進(jìn)行純化，去除纖維細(xì)胞等雜質(zhì)，純化后的肺癌細(xì)胞在含20%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基中連續(xù)培養(yǎng)并傳代大于12個(gè)月，即得細(xì)胞株。作為本發(fā)明所述制備方法的優(yōu)選實(shí)施方式，所述步驟(1)為將切除的人肺未分化癌組織解離成0. 5cm3，用100%的青-鏈霉素雙抗溶液浸泡移至生物安全柜，用消毒的PBS 緩沖液反復(fù)清洗組織去除粘液和紅細(xì)胞等雜質(zhì)，再浸泡于培養(yǎng)基中移至解剖顯微鏡下，用兩個(gè)10號注射器針頭分離肺癌實(shí)質(zhì)組織，去除正常肺泡及支氣管組織和間質(zhì)組織，得到剩余的組織。作為本發(fā)明所述制備方法的優(yōu)選實(shí)施方式，步驟(2)為使用無菌的解剖刀和剪子把步驟(1)得到的剩余的組織切成Imm3的組織片，用PBS緩沖液清洗組織片，讓組織片沉淀，去除上清液，用無菌解剖刀和剪子把剩余組織再細(xì)切，用PBS清洗組織碎片數(shù)次，然后加入膠原酶(50-200單位/ml，溶解在PBS中)，在37°C下孵育4_18小時(shí)，通過無菌不銹鋼絲網(wǎng)或尼龍網(wǎng)過濾細(xì)胞懸液，然后收集腫瘤細(xì)胞，在含20%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基中懸浮細(xì)胞，進(jìn)行接種培養(yǎng)，得到存活細(xì)胞。更優(yōu)選地，步驟(2)中，加入膠原酶的同時(shí)還加入有3mM的CaCl2。加入CaCl2可提高膠原酶對組織的解離效率。作為本發(fā)明所述制備方法的優(yōu)選實(shí)施方式，步驟(3)中純化后的肺癌細(xì)胞的培養(yǎng)溫度為37°C，氣體環(huán)境為5%C02/95%空氣，濕度為飽和濕度，每3天更換一次培養(yǎng)液，每3_5 天傳代一次。采用本發(fā)明所述制備方法得到的來源于人肺未分化癌的細(xì)胞株，是從病理類型為未分化癌的肺癌病人肺部腫塊切除物中制備所得，經(jīng)病理鑒定為肺未分化癌，為上皮細(xì)胞， 具有典型的腫瘤細(xì)胞生物學(xué)特性，它能在體外連續(xù)長期傳代，在體外培養(yǎng)一年，傳100多代，細(xì)胞仍然生長增殖活躍。本發(fā)明所述細(xì)胞株經(jīng)檢測，其一般生物學(xué)特性表明，所述細(xì)胞株為多邊形上皮樣細(xì)胞，可成囊球狀懸浮生長，一旦貼壁，也可生長，且貼壁緊密，接觸性生長抑制消失。


圖1為本發(fā)明所述細(xì)胞株倒置顯微鏡下懸浮生長活細(xì)胞像。圖2為本發(fā)明所述細(xì)胞株倒置顯微鏡下貼壁生長活細(xì)胞像。圖3為本發(fā)明所述細(xì)胞株的染色體的一種影像圖。圖4為本發(fā)明所述細(xì)胞株的染色體的另一種影像圖。圖5為本發(fā)明所述細(xì)胞株的電鏡超微結(jié)構(gòu)圖。圖6為本發(fā)明所述細(xì)胞株種植在NOD-SCID鼠肩胛部皮下移植瘤組織的形態(tài)圖。
具體實(shí)施例方式為更好的說明本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點(diǎn)，下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步描述。實(shí)施例1
本發(fā)明一種來源于人肺未分化癌的細(xì)胞株，按照以下制備方法所得
(1)組織塊機(jī)械解離將手術(shù)切除的肺癌組織以消毒小剪刀迅速解離到0.5cm3大小，用 100%青-鏈霉素雙抗溶液浸泡移至生物安全柜，消毒PBS緩沖液反復(fù)清洗組織去除粘液和紅細(xì)胞等雜質(zhì)，再浸泡于培養(yǎng)基中移至解剖顯微鏡下，用兩個(gè)10號注射器針頭細(xì)心分離肺癌實(shí)質(zhì)組織，盡量去除正常肺泡及支氣管組織和間質(zhì)組織，得到剩余的組織；
(2)膠原酶消化在解剖顯微鏡下去除肺癌標(biāo)本中的間質(zhì)組織后，使用無菌的解剖刀和剪子把步驟(1)所得的剩余的組織切成Imm3組織片，用PBS緩沖液清洗組織片。讓組織片沉淀，去除上清液，用無菌解剖刀和剪子把剩余組織再細(xì)切，用PBS清洗組織碎片數(shù)次，然后加入膠原酶(50-200單位/ml，溶解在PBS中)，在37°C孵育4_18小時(shí)后。在膠乳膠原酶的同時(shí)可加入3mM CaCl2,以提高膠原酶對組織的解離效率。通過無菌不銹鋼絲網(wǎng)或尼龍網(wǎng)過濾細(xì)胞懸液，以分離分散細(xì)胞、組織碎片和較大的碎片；對較大的組織碎片可以加入新鮮的膠原酶進(jìn)行進(jìn)一步的解離。消化完全后，收集腫瘤細(xì)胞，在含20%胎牛血清的高糖DMEM 培養(yǎng)基中懸浮細(xì)胞，進(jìn)行接種培養(yǎng)，得到存活細(xì)胞；
(3)對步驟(2)所得存活細(xì)胞進(jìn)行純化，去除纖維細(xì)胞等雜質(zhì)細(xì)胞，純化后的肺癌細(xì)胞在含20%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為37°C，氣體環(huán)境為5% C02/95%空氣，濕度為飽和濕度，每3天更換一次培養(yǎng)液，每3-5天傳代一次，連續(xù)培養(yǎng)并傳代超過12 個(gè)月，得細(xì)胞株。所述步驟(1)中的肺癌組織，來源于一位59歲女性肺癌病人的左下肺癌病灶。病人在接受手術(shù)前未接受任何化療、放療及靶向治療等治療，術(shù)中發(fā)現(xiàn)肺部腫瘤位于左下肺， 質(zhì)地脆軟，大量壞死，局部侵潤生長，壁胸膜廣泛轉(zhuǎn)移。所述步驟(3)中得到的細(xì)胞株，于2010年4月1日送達(dá)中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，保藏編號為CCTCC NO :C201026，命名為人肺癌細(xì)胞株0114。實(shí)施例2
本發(fā)明所述人肺癌細(xì)胞株0114的檢測鑒定 1、G6PD同工酶檢測物種來源(由中國典型培養(yǎng)物保藏中心檢測)。本發(fā)明所述人肺癌細(xì)胞株0114是一株中國南方人肺未分化癌細(xì)胞株，來源于一位59歲女性肺癌病人的左下肺癌病灶。病人在接受手術(shù)前未接受任何化療、放療及靶向治療等治療，術(shù)中發(fā)現(xiàn)肺部腫瘤位于左下肺，質(zhì)地脆軟，大量壞死，局部侵潤生長，壁胸膜廣泛轉(zhuǎn)移。2、形態(tài)觀察
主要觀察細(xì)胞的一般形態(tài)，如大體形態(tài)、核 漿比例、染色質(zhì)和核仁大小、多少等，以及細(xì)胞骨架微絲微管的排列狀態(tài)等。2. 1倒置光學(xué)顯微鏡觀察
主要在正常生長狀態(tài)下觀察細(xì)胞的一般形態(tài)，如大體形態(tài)、核漿比例、粘附特性等。倒置光學(xué)相差顯微鏡下觀察本發(fā)明所述人肺癌細(xì)胞株0114，可見其有兩種生長形態(tài)，部分細(xì)胞呈懸浮生長，細(xì)胞折光性較好，胞漿豐富含有大量折光性物質(zhì)，部分貼壁生長， 細(xì)胞間連接緊密，細(xì)胞間界限不清，細(xì)胞與平皿之間緊密貼附，不易消化分散；懸浮細(xì)胞可以向貼壁細(xì)胞轉(zhuǎn)化，一旦貼壁，便不易再脫落。如附圖1和2所示。2.2投射電鏡觀察
(1)從2.5%戊二醛固定液中取出樣品，用0. 2mol/L PBS(pH7. 4)漂洗3次，每次15min ；
(2)1% OsO4后固定，室溫Ih ；
(3)0. 2mol/L PBS (ρΗ7· 4)漂洗 3 次，每次 15min ；
(4)50%、70%、90%及100%的丙酮逐級脫水，每梯度濃度15min ；
(5)浸透用丙酮樹脂=1:1浸lh，然后用丙酮樹脂=1 2浸2h最后純樹脂浸過夜；
(6)樣品包埋后進(jìn)行聚合，70°C，24h；
(7)超薄切片，厚度SOnm；
(8)鉛-鈾染色后，上機(jī)觀察。電鏡超微結(jié)構(gòu)顯示，本發(fā)明所述人肺癌細(xì)胞株0114細(xì)胞有著令人印象深刻的細(xì)胞表面長絨毛，細(xì)胞間絨毛交纏，連接緊密。核大，核膜邊緣分布少許異染色質(zhì)，細(xì)胞器以線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)較多，線粒體多為斑馬樣線粒體，如附圖5所示。2.3免疫組化檢測細(xì)胞標(biāo)記蛋白
采用S-P法進(jìn)行免疫組化染色，免疫組化染色S-P試劑盒購自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司。所用的抗體為CK7、TTF-I、vimentin、EGFR、VEGF 和 NSE。具體步驟為
(1)待檢測細(xì)胞株提前24小時(shí)爬片于消毒載玻片上，24小時(shí)后，用PBS緩沖液沖洗2 次，冷丙酮固定15分鐘，浸泡于PBS中備用；
(2)取所需玻片加1滴或50μ 1過氧化物酶阻斷溶液(試劑Α)室溫下孵育10分鐘，以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶的活性；PBS沖洗三次，每次3分鐘；
(3)除去PBS液，每張切片加1滴或50μ 1正常非免疫動(dòng)物血清(試劑B)，室溫下孵育 10分鐘；
(4)除去血清，每張切片加1滴或50μ 1的第一抗體，室溫下孵育60分鐘；
(5)PBS沖洗三次，每次3-5分鐘；除去PBS液，每張切片加一滴或50μ 1生物素標(biāo)記的第二抗體(試劑C)，室溫下孵育10分鐘；PBS沖洗三次，每次3分鐘；
(6)除去PBS液，每張切片加1滴或50μ 1鏈霉菌抗生物素過氧化酶溶液(試劑D)，室溫下孵育10分鐘；PBS沖洗三次，每次3分鐘；
(7)除去PBS液，每張切片加2滴或100μ 1新鮮配制的DAB或AEC溶液，顯微鏡下觀察3-10分鐘；
(8)自來水沖洗，蘇木素復(fù)染， PBS或自來水沖洗返藍(lán)；
(9)DAB顯色，切片經(jīng)過梯度酒精脫水干燥，二甲苯透明，中性樹膠封固。免疫組化檢測結(jié)果判斷方法按細(xì)胞著色評分棕褐色3分；棕黃色2分；淡黃色 1分；無著色0分。同樣物鏡下計(jì)數(shù)陽性細(xì)胞數(shù)，按陽性細(xì)胞的數(shù)量評分一個(gè)視野內(nèi)著色細(xì)胞>70%為4分；51%-75%為3分；11%_50%為2分；1%_10%為1分；陰性為0分。兩項(xiàng)得分相乘，滿3分為“ + ” ；4分為“++” ；5分以上為“+++”?！? +++”為陽性表達(dá)。本發(fā)明所述人肺癌細(xì)胞株0114的免疫組織化學(xué)染色顯示，其與來源于轉(zhuǎn)移灶腫瘤組織的細(xì)胞株有著相似的蛋白表達(dá)，其突出的表達(dá)特征為vimentin、CK7和TTF-I均表達(dá)陽性。Vimentin是波形蛋白，是一種間質(zhì)細(xì)胞廣泛表達(dá)的標(biāo)記物，CK7和TTF-1則是上皮來源的肺腺癌最常表達(dá)的標(biāo)記物，三者同時(shí)表達(dá)往往顯示腫瘤開始出現(xiàn)了上皮間質(zhì)樣轉(zhuǎn)化 (EMT)的傾向，腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力提高，這從側(cè)面提示，人肺癌細(xì)胞株0114是一株有著較高轉(zhuǎn)移潛能的細(xì)胞株。3、細(xì)胞生長增殖
檢測細(xì)胞生長曲線、細(xì)胞分裂指數(shù)、倍增時(shí)間、細(xì)胞周期時(shí)間。3.1 MTT法測定細(xì)胞生長增殖和對藥物的敏感性
(1)取96孔細(xì)胞制備板，每孔中加0.Iml含2X IO4 IOXlO4靶細(xì)胞的制備液(含10% 小牛血清的DMEM制備液)，在37°C 5% C02的飽和水汽二氧化碳制備箱中制備2_3小時(shí)，讓細(xì)胞貼壁；
(2)用DMEM制備液0.1 100倍遞次配置藥物，每孔加0. Iml稀釋的藥物和待檢細(xì)胞， 每個(gè)稀釋度3個(gè)重復(fù)孔。對照孔9個(gè)3個(gè)陽性對照孔，每孔加0. Iml含1000倍藥物的DMEM 制備液和細(xì)胞，3個(gè)陰性對照孔，每孔加不含藥物的0. Iml DMEM制備液和細(xì)胞，3個(gè)空白對照孔，每孔加0.1ml DMEM制備液，不加細(xì)胞。在37°C 5% CO2的飽和水汽二氧化碳制備箱中制備24 48小時(shí)或預(yù)定的時(shí)間；
(3)吸去制備液，用PBS洗滌一次(如為懸浮細(xì)胞，應(yīng)在吸去上清液前離心制備板)；
(4)每孔加0.Iml PBS和10 μ 1 MTT染液，在37°C 5% CO2的飽和水汽二氧化碳制備箱中制備4 6小時(shí)；
(5)每孔加0.Iml酸化異丙醇，也可用含10% SDS的lOmmol/L HCl代替酸化異丙醇， 在振蕩器上振蕩混勻，讓還原產(chǎn)物充分溶解。置酶聯(lián)檢測儀上測定光密度(OD)值，檢測波長570nm，參考波長630nm。以O(shè)D值對樣品稀釋度作圖，比較標(biāo)準(zhǔn)曲線和待測樣品曲線即可求得待測樣品中細(xì)胞因子的含量。3. 2細(xì)胞流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期與凋亡
流式細(xì)胞儀是美國BECKMAN-COULTER(貝克曼-庫爾特)公司生產(chǎn)。機(jī)器型號ELITE， 激光波長488nm，功率15麗。取IO6已固定的細(xì)胞，用PBS洗兩遍，去上清后加入300 μ 1 DNA染液(內(nèi)含碘化丙啶100 μ g/ml和RNase 20單位/ml)，室溫30min。上機(jī)激光管預(yù)熱30min后用熒光微球(美國BECKMAN-COULTER公司)調(diào)整儀器，使各放大器接收的信號的 HCV值<2%，收集12000個(gè)細(xì)胞，DNA周期分析用美國ΡΗΕ0ΝΙΧ公司的MULTYCYCLE軟件，最后計(jì)算出細(xì)胞各期的百分?jǐn)?shù)。另外，細(xì)胞凋亡是用儀器自帶軟件處理，直接得出細(xì)胞的凋亡率。本發(fā)明所述人肺癌細(xì)胞株0114的體外倍增時(shí)間為42. 685h。4、細(xì)胞核型分析
檢測核型特點(diǎn)，染色體數(shù)量、標(biāo)記染色體的有無、帶型等。4. 1準(zhǔn)備秋水仙堿(秋水仙素)，生理鹽水配制成10 μ g/ml濃度，15磅20分鐘滅菌，分裝，置_20°C ；低滲液0. 35% KCl ；固定液(Carnoy固定液)甲醇冰乙酸(3 :1)，臨時(shí)配制；Giemsa工作液1份原液和10份磷酸緩沖液，臨時(shí)配制。4. 2秋水仙素處理終止制備前2-4小時(shí)，在制備液中加入秋水仙堿(用Iml注射器5號針尖滴加2滴，使終濃度為0. 07 μ g/ml )。4. 3染色體制備
(1)收集細(xì)胞將制備物全部轉(zhuǎn)入潔凈離心管中，以IOOOrpm離心8-10分鐘，棄上清
液；
(2)低滲處理向刻度離心管中加入預(yù)溫37°C的低滲液8ml，用滴管混勻，置37°C恒溫水浴中低滲15-25分鐘；
(3)預(yù)固定低滲后加入0.5ml固定液，輕輕混勻后IOOOrpm離心8—10分鐘；
(4)一固定棄上清液，加入5ml固定液，輕輕混勻，靜置20分鐘；IOOOrpm離心，棄上清
液；
(5)二固定、三固定同一固定；
(6)制懸液棄上清液后，視細(xì)胞數(shù)量多少加入適量固定液制成細(xì)胞懸液；
(7)滴片吸取細(xì)胞懸液自10-20cm高滴在一張干燥潔凈的載玻片上，輕吹散，氣干；
(8)染色110 Giemsa染色5-10分鐘，細(xì)水洗去多余染液，氣干；
(9)鏡檢低倍鏡下尋找分散良好、染色適中的分裂相，油鏡下觀察染色體形態(tài)并計(jì)數(shù)。本發(fā)明所述人肺癌細(xì)胞株0114的染色體數(shù)較其他的肺癌細(xì)胞株少，對50個(gè)分裂期的細(xì)胞進(jìn)行的記錄分析，染色體數(shù)從40條-52條，染色體中位數(shù)為46條，多為亞二倍體。 未發(fā)現(xiàn)標(biāo)記染色體，如附圖3和4所示。5、異體動(dòng)物接種
向異體動(dòng)物體內(nèi)接種細(xì)胞懸液，觀察成瘤能力。采用皮下注射的方法，注射時(shí)用左手拇指及食指輕輕捏起皮膚，右手持注射器將針頭刺入，固定后在小鼠背部或前肢腋下進(jìn)行注射。 IO6個(gè)本發(fā)明所述人肺癌細(xì)胞株0114細(xì)胞種植在5只4周齡的NOD-SCID鼠肩胛部皮下，第3周種植部位均出現(xiàn)直徑約2mm的移植瘤，2個(gè)月后，瘤體增大到1. 2cm，麻醉后處死動(dòng)物，移植瘤組織經(jīng)包埋切片HE染色，形態(tài)如附圖6所示，細(xì)胞體積巨大，核大，核仁明顯，與來源的病人組織相似。最后所應(yīng)當(dāng)說明的是，以上實(shí)施例僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案而非對本發(fā)明保護(hù)范圍的限制，盡管參照較佳實(shí)施例對本發(fā)明作了詳細(xì)說明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以對本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的實(shí)質(zhì)和范圍。
權(quán)利要求
1.一種來源于人肺未分化癌的細(xì)胞株，其特征在于，命名為人肺癌細(xì)胞株0114，保藏號為 CCTCC NO :C201026。
2.如權(quán)利要求1所述的來源于人肺未分化癌的細(xì)胞株，其特征在于，所述細(xì)胞株在電鏡下觀察顯示，細(xì)胞表面長絨毛，細(xì)胞間絨毛交纏，連接緊密，核大，核膜邊緣分布有異染色質(zhì)，細(xì)胞器以線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)較多，線粒體多為斑馬樣線粒體。
3.如權(quán)利要求1所述的來源于人肺未分化癌的細(xì)胞株，其特征在于，所述細(xì)胞株在倒置顯微鏡下觀察有兩種生長形態(tài)，一種為懸浮生長，細(xì)胞折光性較好，胞漿豐富，含有大量折光性物質(zhì)，一種為貼壁生長，細(xì)胞間連接緊密，細(xì)胞間界限不清，細(xì)胞與平皿之間緊密貼附，不易消化分散；懸浮細(xì)胞可以向貼壁細(xì)胞轉(zhuǎn)化，一旦貼壁，便不易脫落。
4.如權(quán)利要求1所述的來源于人肺未分化癌的細(xì)胞株，其特征在于，所述細(xì)胞株的體外倍增時(shí)間為42. 685h。
5.如權(quán)利要求1所述的來源于人肺未分化癌的細(xì)胞株，其特征在于，所述細(xì)胞株的蛋白表達(dá)特征為vimentin、CK7和TTF-I均表達(dá)陽性。
6.如權(quán)利要求1所述的來源于人肺未分化癌的細(xì)胞株，其特征在于，所述細(xì)胞株的染色體數(shù)為40-52條。
7.一種來源于人肺未分化癌的細(xì)胞株的制備方法，其特征在于，包括以下步驟(1)組織塊機(jī)械解離將切除的人肺未分化癌組織解離，清洗去除雜質(zhì)，分離肺癌實(shí)質(zhì)組織，去除正常肺泡及支氣管組織和間質(zhì)組織，得到剩余的組織；(2)膠原酶消化將步驟(1)得到的剩余的組織切成組織片，清洗，然后向組織片加入膠原酶，孵育，過濾，然后收集腫瘤細(xì)胞，進(jìn)行接種培養(yǎng)，得到存活細(xì)胞；(3)對步驟(2)得到的存活細(xì)胞進(jìn)行純化，去除纖維細(xì)胞等雜質(zhì)，純化后的肺癌細(xì)胞連續(xù)培養(yǎng)并傳代大于12個(gè)月，即得細(xì)胞株。
全文摘要
本發(fā)明公開一種來源于人肺未分化癌的細(xì)胞株，所述細(xì)胞株命名為人肺癌細(xì)胞株0114，保藏號為CCTCCNOC201026。所述細(xì)胞株是從病理類型為未分化癌的肺癌病人肺部腫塊切除物中制備所得，具有典型的腫瘤細(xì)胞生物學(xué)特性，能在體外連續(xù)長期傳代。同時(shí)，本發(fā)明還公開了所述細(xì)胞株的制備方法。
文檔編號C12N5/09GK102424815SQ20111045730
公開日2012年4月25日 申請日期2011年12月31日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月31日
發(fā)明者何建行, 李慧靈 申請人:何建行, 廣州呼吸疾病研究所, 李慧靈