專利名稱：對(duì)除草劑具有增加的耐受性的植物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明大體上涉及賦予植物對(duì)除草劑的農(nóng)業(yè)水平耐受性的方法。特別地，本發(fā)明涉及對(duì)“香豆酮(coumarone)衍生物”除草劑具有增加的耐受性的植物。更具體地，本發(fā)明涉及方法和由誘變及雜交育種及轉(zhuǎn)化獲得的對(duì)“香豆酮衍生物”除草劑具有增加的耐受性的植物。
背景技術(shù)：
自1990年代早期以來(lái)，抑制異戊二烯基醌質(zhì)體醌及生育酚的生物合成中的關(guān)鍵酶4-羥苯基丙酮酸雙加氧酶(4-HPH) ；EC1. 13. 11. 27)的除草劑已用于進(jìn)行選擇性雜草控制。其阻斷生物合成路徑中4-輕苯基丙酮酸轉(zhuǎn)化成尿黑酸(homogentisate) (Matringe等 人，2005, Pest Manag Sci.，第 61 卷:269-276 ；Mitchell 等人，2001，Pest Manag Sci.第57卷120-128)。認(rèn)為質(zhì)體醌是類胡蘿卜素生物合成中八氫蕃爺紅素去飽和酶(phytoenedesaturase)的必需輔因子(Boeger 及 Sandmann, 1998, Pestic Outlook,第 9 卷:29_35)。其抑制作用會(huì)使植物質(zhì)體醌及維生素E庫(kù)耗盡，從而導(dǎo)致漂白癥狀。類胡蘿卜素的損失，特別是其作為對(duì)抗光氧化作用的光系統(tǒng)保護(hù)劑功能的損失，會(huì)導(dǎo)致生長(zhǎng)中的芽組織中的葉綠素及光合膜氧化降解。因此，葉綠體合成及功能被破壞Ooeger及Sandmann, 1998)。尿黑酸爺尼基轉(zhuǎn)移酶(homogentisate solanesyl transferase,HST)催化質(zhì)體醌生物合成路徑HPH)之后的步驟。HST為異戊二烯基轉(zhuǎn)移酶，其使尿黑酸脫羧并且將來(lái)自茄尼基二磷酸酯的茄尼基轉(zhuǎn)移至尿黑酸而因此形成2-甲基-6-茄尼基-I，4-苯醌(MSBQ)，一種沿質(zhì)體醌生物合成路徑的中間物。HST酶為膜結(jié)合酶且編碼其的基因包括質(zhì)體靶向序列。商品化4-HPH)抑制性除草劑的最重要化學(xué)種類包括卩比唑啉酮類(pyrazolone)、三酮類(triketone)及異惡唑類(isoxazole)。抑制劑通過(guò)形成穩(wěn)定離子偶極電荷轉(zhuǎn)移復(fù)合物而模擬底物4-羥苯基丙酮酸與活性位點(diǎn)中的酶結(jié)合亞鐵離子的結(jié)合。在4-HPH)抑制性除草劑中，三酮磺草酮(triketone sulcotrione)為此組除草劑中首個(gè)用于農(nóng)業(yè)中的實(shí)例且鑒別了其作用機(jī)制(Schulz等人，1993，F(xiàn)EBS Lett.第318卷162-166)。已報(bào)導(dǎo)三酮類是來(lái)自瓶刷形分支植物(bottlebrush plant)紅千層種(Callistemon spp)的除草組分的纖精麗(Ieptospermone)的衍生物(Lee 等人 1997, Weed Sci.第 45 卷，162-166)。因?yàn)橐种浦参镏械姆磻?yīng)會(huì)導(dǎo)致經(jīng)處理植物的葉變白并且導(dǎo)致所述植物死亡，這些分子中的一些已用作除草劑(Pallett，K. E.等人1997Pestic. Sci. 5083-84)。以HPPD為靶且描述于當(dāng)前現(xiàn)有技術(shù)中的除草劑特別地為異吃唑類(EP418175、EP470856、EP487352、EP527036、EP560482、EP682659、美國(guó)專利號(hào) 5,424，276)，特別地異5惡唑草酮(isoxaflutole)，其為玉米選擇性除草劑；二酮腈類(EP496630、EP496631)，特別地2_氛基_3_環(huán)丙基-I- (2-S02CH3-4_CF3苯基)丙燒-I，3-二麗及2-氛基-3-環(huán)丙基-I- (2-S02CH3-4-2, 3C12 苯基)丙烷-1，3- 二酮；諸如描述于 EP625505、EP625508、美國(guó)專利號(hào)5，506, 195中的三酮類,特別地磺草酮；或pyrazolinates。此外,在易感植物物種中，如同前述的4-HPH)抑制性漂白除草劑一般,熟知的除草劑苯卩比唑草酮(topramezone)會(huì)引發(fā)相同類型的植物毒性癥狀，伴有生長(zhǎng)中的芽組織中的葉綠素?fù)p失及壞死。苯吡唑草酮屬于化學(xué)種類吡唑啉酮類或苯甲酰基吡唑類且于2006年以商業(yè)引進(jìn)。當(dāng)萌芽后施用時(shí)，化合物選擇性控制玉米中的廣譜一年生草及闊葉雜草。植物對(duì)“香豆酮衍生物除草劑”的耐受性也已在許多專利中加以報(bào)導(dǎo)。國(guó)際申請(qǐng)?zhí)朤O2010/029311 —般性描述HPTO核酸及/或HST核酸在植物中引發(fā)除草劑耐受性的用途。W02009/090401、W02009/090402、W02008/071918、W02008/009908 具體公開(kāi)了某些“香豆酮衍生物除草劑”及“香豆酮衍生物除草劑”耐受性的植物株系。3種主要策略可用于使植物耐受除草劑，亦即(I)用將除草劑或其活性代謝物轉(zhuǎn)化成無(wú)毒產(chǎn)物的酶(諸如對(duì)溴苯腈(bromoxynil)或?qū)Σ蒌@膦(basta) (EP242236、EP337899)耐受性的酶)去除除草劑毒性；(2)將靶酶突變成對(duì)除草劑或其活性代謝物敏感性較小的功能性酶，諸如對(duì)草甘膦(glyphosate)耐受性的酶(EP293356、Padgette S. R.等 人，J. Biol. Chem.，266，33，1991);或(3)過(guò)表達(dá)敏感性酶使得鑒于此酶的動(dòng)力學(xué)常數(shù)，在植物中生產(chǎn)相對(duì)于除草劑足夠的靶酶量，使得具有足夠的功能性酶可用而不管其抑制劑之存在。描述了第三種策略用于成功獲得對(duì)HPH)抑制劑具有耐受性的植物(W096/38567)。US2009/0172831公開(kāi)了編碼氨基酸序列的核苷酸序列，所述氨基酸序列具有使得氨基酸序列對(duì)HPro抑制劑除草化學(xué)品，特別地對(duì)三酮抑制劑特異性HPro突變體具有抗性的酶促活性。迄今為止，現(xiàn)有技術(shù)尚未描述含有至少一種突變的HPro核酸的香豆酮衍生物除草劑耐受性植物?，F(xiàn)有技術(shù)亦尚未描述在除獲得HPro基因的基因組以外的基因組中含有突變的香豆酮衍生物除草劑耐受性作物植物。因此，本領(lǐng)域需要鑒定來(lái)自其他基因組及物種的香豆酮衍生物除草劑耐受基因。本領(lǐng)域亦需要植物作物和具有對(duì)除草劑(諸如香豆酮衍生物除草劑)增加的耐受性及含有至少一種突變的HPro核酸的植物作物。亦需要控制此類作物植物或作物植物附近雜草生長(zhǎng)的方法。當(dāng)向含有植物作物的區(qū)域或植物作物施用除草劑時(shí)，這些組合物及方法將允許使用噴霧技術(shù)。
發(fā)明總結(jié)通過(guò)涉及控制植物栽培位置處不合需要的植被的方法的本發(fā)明解決問(wèn)題，所述方法包括以下步驟a)在該位置處提供包含至少一種核酸的植物，該核酸包含(i)編碼對(duì)香豆酮衍生物除草劑具有抗性或耐受性的野生型羥苯基丙酮酸雙加氧酶或突變的羥苯基丙酮酸雙加氧酶(mut-HPro)的核苷酸序列，和/或(ii)編碼對(duì)香豆酮衍生物除草劑具有抗性或耐受性的野生型尿黑酸茄尼基轉(zhuǎn)移酶或突變的尿黑酸茄尼基轉(zhuǎn)移酶(mut-HST)的核苷酸序列b)向該位置施用有效量的所述除草劑。此外，本發(fā)明涉及通過(guò)使用由包含核苷酸序列SEQ ID NO :1、3或5或其變體的核酸編碼的mut-HPPD，和/或通過(guò)使用由包含核苷酸序列SEQ ID NO :7或9或其變體的核酸編碼的mut-HST鑒別香豆酮衍生物除草劑的方法。所述方法包括以下步驟a)生成包含編碼mut-HPH)的核酸的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞或植物，其中表達(dá)mut-HPH)；
b)向a)的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞或植物及相同品種的對(duì)照細(xì)胞或植物施用香豆酮衍生物除草劑；c)在施用所述測(cè)試化合物之后，測(cè)定轉(zhuǎn)基因細(xì)胞或植物及對(duì)照細(xì)胞或植物的生長(zhǎng)或生存力，及d)選擇使對(duì)照細(xì)胞或植物生長(zhǎng)較之轉(zhuǎn)基因細(xì)胞或植物的生長(zhǎng)降低的測(cè)試化合物。另一目標(biāo)涉及鑒別編碼對(duì)香豆酮衍生物除草劑具有抗性或耐受性的mut-HPH)的核苷酸序列的方法，該方法包括a)生成mut-HPH)編碼核酸的文庫(kù)，b)通過(guò)在細(xì)胞或植物中表達(dá)每種所述核酸并用香豆酮衍生物除草劑處理所述細(xì)胞或植物來(lái)篩選所得mut-HPH)編碼核酸的群體， c)比較由所述mut-HPH)編碼核酸群體提供的香豆酮衍生物除草劑耐受性水平與由對(duì)照HPro編碼核酸提供的香豆酮衍生物除草劑耐受性水平，d)選擇至少一種mut-HPH)編碼核酸，其提供較之由對(duì)照HPTO編碼核酸提供的對(duì)香豆酮衍生物除草劑的耐受性水平顯著增加的對(duì)香豆酮衍生物除草劑的耐受性水平。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，較之由對(duì)照HPro編碼核酸提供的對(duì)香豆酮衍生物除草劑的耐受性，步驟d)中選出的mut-HPro編碼核酸提供至少2倍的對(duì)香豆酮衍生物除草劑的耐受性。抗性或耐受性可通過(guò)生成包含步驟a)的文庫(kù)的核酸序列的轉(zhuǎn)基因植物并且比較所述轉(zhuǎn)基因植物與對(duì)照植物加以測(cè)定。另一目標(biāo)涉及鑒別含有編碼對(duì)香豆酮衍生物除草劑具有抗性或耐受性的mut-HPH)或mut-HST的核酸的植物或藻類之方法，該方法包括a)鑒別植物細(xì)胞或綠藻的培養(yǎng)物中有效量的香豆酮衍生物除草劑，b)用誘變處理劑處理所述植物細(xì)胞或綠藻，c)使所述經(jīng)誘變處理的細(xì)胞群體與a)中鑒別出的有效量的香豆酮衍生物除草劑接觸，d)選擇在這些測(cè)試條件下存活的至少一個(gè)細(xì)胞，e)對(duì)來(lái)自d)中選出的細(xì)胞的HPH)及/或HST基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增及測(cè)序并且將此類序列分別與野生型HPro或HST基因序列比較。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，誘變處理劑為甲烷磺酸乙酯。另一目標(biāo)涉及編碼mut-HPH)的分離的核酸，該核酸可通過(guò)如上定義的方法鑒別。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及由野生型或mut-HPH)核酸轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞或已經(jīng)被突變而獲得表達(dá)，優(yōu)選地過(guò)表達(dá)野生型或mut-HPH)核酸的植物的植物，其中核酸在該植物細(xì)胞中的表達(dá)導(dǎo)致較之野生型品種的植物細(xì)胞，對(duì)香豆酮衍生物除草劑的增加的抗性或耐受性。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及包含根據(jù)本發(fā)明的植物細(xì)胞的轉(zhuǎn)基因植物，其中核酸在植物中的表達(dá)導(dǎo)致較之野生型品種的植物，植物對(duì)香豆酮衍生物除草劑的增加的抗性。本發(fā)明的植物可為轉(zhuǎn)基因或非轉(zhuǎn)基因植物。優(yōu)選地，核酸在植物中的表達(dá)導(dǎo)致較之野生型品種的植物，植物對(duì)香豆酮衍生物除草劑的增加的抗性。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及由包含本發(fā)明的植物細(xì)胞的轉(zhuǎn)基因植物生產(chǎn)的種子，其中該種子對(duì)于較之野生型品種的種子的增加的香豆酮衍生物除草劑的抗性是純育的(true breeding)。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及生產(chǎn)較之野生型品種的植物細(xì)胞，具有對(duì)香豆酮衍生物除草劑的增加的抗性的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞的方法，所述方法包括用包含野生型或mut-HPPD核酸的表達(dá)盒轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因植物的方法，其包括(a)用包含野生型或mut-HPH)核酸的表達(dá)盒轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞，及(b)從植物細(xì)胞生成具有對(duì)香豆酮衍生物除 草劑的增加的抗性的植物。優(yōu)選地，表達(dá)盒還包含在植物中具有功能的轉(zhuǎn)錄起始調(diào)控區(qū)及翻譯起始調(diào)控區(qū)。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及使用本發(fā)明的mut-HPH)作為可選擇的標(biāo)志物。本發(fā)明提供鑒別或選擇經(jīng)轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞、植物組織、植物或其部分的方法，所述方法包括a)提供經(jīng)轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞、植物組織、植物或其部分，其中該經(jīng)轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞、植物組織、植物或其部分包含編碼如下文所述的本發(fā)明的mut-HPH)多肽的分離的核酸，其中該多肽用作選擇標(biāo)志物，且其中該經(jīng)轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞、植物組織、植物或其部分可任選地包含其他分離的目的核酸山)使經(jīng)轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞、植物組織、植物或其部分與至少一種香豆酮衍生物抑制性化合物接觸；c)確定植物細(xì)胞、植物組織、植物或其部分是否受抑制劑或抑制性化合物影響；及(1)鑒別或選擇經(jīng)轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞、植物組織、植物或其部分。本發(fā)明亦體現(xiàn)在含有本文所述的突變的經(jīng)純化的mut-HPH)蛋白質(zhì)方面，所述蛋白質(zhì)在設(shè)計(jì)對(duì)除草劑耐受性的其他改良的分子模造研究中是有用的。蛋白質(zhì)純化方法為熟知的，且可易于使用市售產(chǎn)品或如例如于Protein Biotechnology, Walsh和Headon(Wiley, 1994)中示出的特別設(shè)計(jì)的方法達(dá)成。附圖
簡(jiǎn)述圖 I:來(lái)自萊茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii) (Cr_HPPDla> Cr_HPPDlb) >小立碗蘚(Physcomitrellapatens) (Pp_HPPDl)、稻(Oryza sativa) (Osj_HPPDl)、小麥(Triticum aestivum) (Ta_HPPDl)、玉蜀黍(Zea mays) (Zm_HPPDl)、擬南芥(At_HPPD)、大豆(Glycine max) (Gm_HPPD)及葡萄(Vitis vinifera) (Vv_HPPD)的 HPF1D 酶的氨基酸序列比對(duì)及保守區(qū)；*源于基因組測(cè)序計(jì)劃的序列?；蜃鵌D :GRMZM2G088396**基于NCBI GenPept登錄號(hào)CAG25475的氨基酸序列圖2 選擇對(duì)“香豆酮衍生物除草劑”具有抗性的萊茵衣藻株系。(A)涂布于無(wú)選擇性試劑的固體培養(yǎng)基上的經(jīng)誘變處理的細(xì)胞。(B)涂布于含有50μΜ4-羥基-3-[2-甲基-3-(5-甲基-4，5-二氫異5惡唑-3-基)-4-甲基磺?；?苯基]吡喃并[3，2-b]吡啶-2-酮的固體培養(yǎng)基上的經(jīng)誘變處理的細(xì)胞。對(duì)“香豆酮衍生物除草劑”具有抗性的細(xì)胞能夠形成群落(經(jīng)圈出)，而易感細(xì)胞不能生長(zhǎng)。圖3展示用于使用HPHVHST序列所進(jìn)行的大豆轉(zhuǎn)化的植物轉(zhuǎn)化載體的載體圖。圖4:
針對(duì)表達(dá)擬南芥屬野生型HPro(AtHPro)的轉(zhuǎn)基因TO大豆插條的除草劑噴霧測(cè)試。AV3639、AV3641及AV3653為單個(gè)品系(individual event)。未經(jīng)轉(zhuǎn)化的對(duì)照植物標(biāo)記為野生型。用星號(hào)標(biāo)記的“香豆酮衍生物”對(duì)應(yīng)于* 3-[2，4_ 二氯-3-(3-甲基-4，5-二氫異唑-5-基)苯基]-I-(2, 2_ 二氣代乙基)-2, 2_ 二氧代-卩比卩定并[3,2_c]喔嚷-4-醇。序列表表I
權(quán)利要求
1.控制植物栽培位置處不合需要的植被的方法，該方法包括以下步驟 a)在該位置處提供包含至少一種核酸的植物，所述核酸包含 (i)編碼對(duì)香豆酮衍生物除草劑具有抗性或耐受性的野生型羥苯基丙酮酸雙加氧酶或突變的羥苯基丙酮酸雙加氧酶(mut-HPro)的核苷酸序列及/或 ( )編碼對(duì)香豆酮衍生物除草劑具有抗性或耐受性的野生型尿黑酸茄尼基轉(zhuǎn)移酶或突變的尿黑酸茄尼基轉(zhuǎn)移酶(mut-HST)的核苷酸序列 b)向所述位置處施用有效量的所述除草劑。
2.根據(jù)權(quán)利要求I的方法，其中⑴的核苷酸序列包含SEQID N0:l、3或5的序列，或其變體或衍生物。
3.根據(jù)權(quán)利要求I的方法，其中(ii)的核苷酸序列包含SEQID NO :7或9的序列，或其變體或衍生物。
4.根據(jù)權(quán)利要求I至3中任一項(xiàng)的方法，其中植物包含至少一種額外的異源核酸，所述核酸包含(iii)編碼除草劑耐受性酶的核苷酸序列。
5.根據(jù)權(quán)利要求I至4中任一項(xiàng)的方法，其中香豆酮衍生物除草劑連同一種或多種其他HPro及/或HST靶向除草劑一起施用。
6.鑒別香豆酮衍生物除草劑的方法，所述方法通過(guò)使用由包含SEQIDN0:1、3或5的核苷酸序列，或其變體或衍生物的核酸編碼的mut-HPPD，及/或通過(guò)使用由包含SEQ ID NO 7或9的核苷酸序列，或其變體或衍生物的核酸編碼的mut-HST來(lái)進(jìn)行鑒別。
7.根據(jù)權(quán)利要求6的方法，其包括以下步驟 a)生成包含編碼mut-HPH)的核酸的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞或植物，其中表達(dá)mut-HPH)； b)向a)的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞或植物及向相同品種的對(duì)照細(xì)胞或植物施用香豆酮衍生物； c)在施用所述測(cè)試化合物之后，測(cè)定轉(zhuǎn)基因細(xì)胞或植物及對(duì)照細(xì)胞或植物的生長(zhǎng)或生存力，及 d)較之轉(zhuǎn)基因細(xì)胞或植物的生長(zhǎng)，選擇賦予對(duì)照細(xì)胞或植物降低的生長(zhǎng)的測(cè)試化合物。
8.鑒別編碼對(duì)香豆酮衍生物除草劑具有抗性或耐受性的mut-HPH)的核苷酸序列的方法，該方法包括 a)生成mut-HPH)編碼核酸的文庫(kù)， b)通過(guò)在細(xì)胞或植物中表達(dá)每種所述核酸并用香豆酮衍生物處理所述細(xì)胞或植物，來(lái)篩選所得mut-HPH)編碼核酸的群體， c)比較由所述mut-HPH)編碼核酸群體提供的“香豆酮衍生物”耐受性水平與由對(duì)照HPPD編碼核酸提供的“香豆酮衍生物”耐受性水平， d)較之由對(duì)照HPH)編碼核酸提供的對(duì)“香豆酮衍生物”的耐受性水平，選擇提供對(duì)“香豆酮衍生物”的耐受性水平顯著增加的至少一種mut-HPH)編碼核酸。
9.根據(jù)權(quán)利要求8的方法，其中較之由對(duì)照HPro編碼核酸所提供的對(duì)香豆酮衍生物除草劑的耐受性，在步驟d)中選擇的mut-HPro編碼核酸提供至少2倍的對(duì)香豆酮衍生物除草劑的耐受性。
10.根據(jù)權(quán)利要求8或9的方法，其中通過(guò)生成包含步驟a)的文庫(kù)的核酸序列的轉(zhuǎn)基因植物并比較所述轉(zhuǎn)基因植物與對(duì)照植物來(lái)測(cè)定抗性或耐受性。
11.編碼mut-HPro的經(jīng)分離的核酸，其中核酸能夠通過(guò)如權(quán)利要求8至10中任一項(xiàng)所定義的方法鑒別。
12.根據(jù)權(quán)利要求11的核酸，其中被編碼的mut-HPH)為SEQID NO 2的變體，其包括下述中的一個(gè)或多個(gè)位置293的氨基酸不為谷氨酰胺；位置335的氨基酸不為甲硫氨酸；位置336的氨基酸不為脯氨酸；位置337的氨基酸不為絲氨酸；氨基酸位置363不為谷氨酸；位置422的氨基酸不為甘氨酸；位置385的氨基酸不為亮氨酸；及/或氨基酸位置393不為異亮氨酸。
13.由野生型或mut-HPH)核酸轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞，其中較之野生型品種的植物細(xì)胞，核酸在植物細(xì)胞中的表達(dá)導(dǎo)致對(duì)香豆酮衍生物除草劑的增加的抗性或耐受性。
14.根據(jù)權(quán)利要求13的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞，其中野生型或mut-HPH)核酸包含選自由以下 組所組成的多核苷酸序列，所述組為a)如SEQ ID NO :1、3或5中所示的多核苷酸，或其變體或衍生物山)如SEQ ID NO :7或9中所示的多核苷酸，或其變體或衍生物；c)編碼如SEQID NO :2、4、6、8或10中所示的多肽的多核苷酸，或其變體或衍生物；d)包含a)至c)中任一項(xiàng)的至少60個(gè)連續(xù)核苷酸的多核苷酸；及e)與a)至d)中任一項(xiàng)的多核苷酸互補(bǔ)的多核苷酸。
15.根據(jù)權(quán)利要求14的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞，其中c)中的SEQID NO :2的該多肽的變體包括下述中的一個(gè)或多個(gè)位置293的氨基酸不為谷氨酰胺；位置335的氨基酸不為甲硫氨酸；位置336的氨基酸不為脯氨酸；位置337的氨基酸不為絲氨酸；氨基酸位置363不為谷氨酸；位置422的氨基酸不為甘氨酸；位置385的氨基酸不為亮氨酸；及/或氨基酸位置393不為異亮氨酸。
16.包含如權(quán)利要求13至15中任一項(xiàng)所定義的植物細(xì)胞的轉(zhuǎn)基因植物，其中較之野生型品種的植物細(xì)胞，核酸在植物細(xì)胞中的表達(dá)導(dǎo)致植物對(duì)香豆酮衍生物除草劑的增加的抗性或耐受性。
17.表達(dá)包含SEQID NO :2的經(jīng)誘變的或重組mut-HPH)的植物，其中氨基酸序列在一個(gè)或多個(gè)氨基酸位置處不同于相應(yīng)野生型植物的HPI3D的氨基酸序列，其中位置293的氨基酸不為谷氨酰胺；位置335的氨基酸不為甲硫氨酸；位置336的氨基酸不為脯氨酸；位置337的氨基酸不為絲氨酸；氨基酸位置363不為谷氨酸；位置422的氨基酸不為甘氨酸；位置385的氨基酸不為亮氨酸；及/或氨基酸位置393不為異亮氨酸，且其中所述HPH)在植物中表達(dá)時(shí)，賦予植物較之相應(yīng)野生型品種植物的增加的除草劑耐受性。
18.由包含如權(quán)利要求13至15中任一項(xiàng)所定義的植物細(xì)胞的轉(zhuǎn)基因植物，或由權(quán)利要求16或17的植物所生產(chǎn)的種子，其中種子對(duì)于較之野生型品種的種子的增加的對(duì)香豆酮衍生物除草劑的抗性而言是純育的。
19.生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞的方法，所述方法包括用包含mut-HPH)核酸的表達(dá)盒轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞，所述轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞較之野生型品種的植物細(xì)胞，具有增加的對(duì)香豆酮衍生物除草劑的抗性。
20.生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因植物的方法，所述方法包括(a)用包含mut-HPH)核酸的表達(dá)盒轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞，及(b)從植物細(xì)胞生成具有對(duì)香豆酮衍生物除草劑的增加的抗性的植物。
21.權(quán)利要求19或20的方法，其中mut-HPH)核酸包含選自由以下組所組成的多核苷酸序列，所述組為a)如SEQ ID NO :1、3或5中所示的多核苷酸，或其變體或衍生物；b)如SEQ ID NO :7或9中所示的多核苷酸，或其變體或衍生物；c)編碼如SEQ ID N0:2、4、6、8或10中所示的多肽的多核苷酸，或其變體或衍生物；d)包含a)至c)中任一項(xiàng)的至少60個(gè)連續(xù)核苷酸的多核苷酸；及e)與a)至d)中任一項(xiàng)的多核苷酸互補(bǔ)的多核苷酸。
22.權(quán)利要求19或20的方法 ，其中表達(dá)盒還包含在植物中有功能的轉(zhuǎn)錄起始調(diào)控區(qū)及翻譯起始調(diào)控區(qū)。
23.鑒別或選擇經(jīng)轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞、植物組織、植物或其部分的方法，所述方法包括i)提供經(jīng)轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞、植物組織、植物或其部分，其中所述經(jīng)轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞、植物組織、植物或其部分包含如SEQ ID NO :1、3或5中所示的多核苷酸，或其變體或衍生物，其中多核苷酸編碼用作選擇標(biāo)志物的mut-HPH)多肽，且其中所述經(jīng)轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞、植物組織、植物或其部分可包含其他的經(jīng)分離的多核苷酸；ii)將經(jīng)轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞、植物組織、植物或其部分與至少一種香豆酮衍生物化合物接觸；iii)確定植物細(xì)胞、植物組織、植物或其部分是否受抑制性化合物影響；及iv)鑒別或選擇經(jīng)轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞、植物組織、植物或其部分。
全文摘要
本發(fā)明涉及控制植物栽培位置處不合需要的植被的方法。該方法包括以下步驟在所述位置處提供包含至少一種核酸的植物，所述核酸包含編碼對(duì)香豆酮衍生物除草劑具有抗性或耐受性的野生型羥苯基丙酮酸雙加氧酶或突變的羥苯基丙酮酸雙加氧酶(mut-HPPD)的核苷酸序列及/或編碼對(duì)香豆酮衍生物除草劑具有抗性或耐受性的野生型尿黑酸茄尼基轉(zhuǎn)移酶或突變的尿黑酸茄尼基轉(zhuǎn)移酶(mut-HST)的核苷酸序列，然后向所述植物栽培位置處施用有效量的所述除草劑。本發(fā)明還涉及包含mut-HPPD的植物及獲得此類植物的方法。
文檔編號(hào)C12N5/14GK102971428SQ201180033332
公開(kāi)日2013年3月13日 申請(qǐng)日期2011年5月2日 優(yōu)先權(quán)日2010年5月4日
發(fā)明者T·米茨納, M·維切爾, J·赫茨勒, T·埃爾哈德特, S·特雷施 申請(qǐng)人:巴斯夫歐洲公司