一種通過下調(diào)PAB2和PAB4提高植物對NaCl耐受性的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[00011本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種通過下調(diào)PAB2和PAB4提高植物對NaCl耐受性 的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 隨著世界人口不斷增長，人類對糧食的需求越來越大。鹽脅迫是世界范圍內(nèi)影響 農(nóng)作物產(chǎn)量的主要因素之一。鹽脅迫主要是通過氯化鈉作為脅迫來對植物造成損傷。土壤 中高濃度的鈉離子會直接影響植物的蛋白質(zhì)合成、光合作用以及能量代謝等等，導(dǎo)致植物 發(fā)育遲緩、發(fā)芽率降低、器官的生長和分化被抑制、新陳代謝減緩、蛋白合成減少等等，最終 影響作物的產(chǎn)量。截止到目前為止，全球鹽堿土地的總面積達(dá)8.4億hm 2,約占世界陸地面積 的6 %，并按每年1 -4億hm2的速度增加;我國的鹽堿地面積為0.27億hm2，約占耕地面積的 10%，正以每年1000多畝的速度增加。
[0003] 在我國鹽漬地不斷增加的嚴(yán)峻形勢下，有效改善和利用鹽漬地資源以及提高鹽漬 化土地上的作物產(chǎn)量對我國農(nóng)業(yè)發(fā)展有著重大的現(xiàn)實(shí)意義。目前為止，改善和利用鹽漬地 的方式主要有兩種：一是通過合理灌溉、淡水洗鹽等土地改良工程措施;但是，這些方法耗 資巨大且有很強(qiáng)的副作用；當(dāng)今的淡水資源變得日益珍貴，這些措施的實(shí)施難度較大并且 很難維持。另一有效利用鹽漬化土地的方法是培育出高效耐鹽新品種，這也是今后發(fā)展農(nóng) 業(yè)的重要方向。
[0004]植物的耐鹽性是由多基因數(shù)量性狀控制且受環(huán)境影響的復(fù)雜性狀；因此，傳統(tǒng)育 種方法在提高作物耐鹽性的效果上十分有限。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展以及科學(xué)家們對植物 耐鹽分子機(jī)制研究的不斷深入，通過基因工程手段提高作物的耐鹽性受到廣泛重視?；?工程技術(shù)手段的優(yōu)勢在于可以精確、穩(wěn)定和高效地改變基因表達(dá)，進(jìn)而可以有效提高作物 耐鹽性，極大地加快了育種速度，成為培育高效耐鹽新品種的有效途徑。而鑒定耐鹽基因以 及深入研究植物耐鹽分子機(jī)制是培育高效耐鹽新品種的首要任務(wù)。
[0005] Poly(A)幾乎存在于所有真核生物的mRNA3'端，并且影響著mRNA幾乎所有的代謝 活動:轉(zhuǎn)運(yùn)、翻譯和降解。P〇ly(A)結(jié)合蛋白[Poly(A)_binding protein，PABP/PAB]是RNA結(jié) 合蛋白超家族中一類高度保守的蛋白亞族，廣泛存在于酵母、線蟲、人和擬南芥等真核生物 不同類型的細(xì)胞中。PABP/PAB蛋白是重要的翻譯起始因子之一，它能與mRNA末端po 1 y (A)尾 巴相結(jié)合，控制poly (A)的長度，參與調(diào)節(jié)mRNA的合成、降解和穩(wěn)定性以及翻譯的起始等等。
[0006] 酵母和動物中對PABP基因的研究較多，它們的一級結(jié)構(gòu)和基因結(jié)構(gòu)都具有高度保 守性，而高等植物有關(guān)PABP基因的研究較少。在酵母細(xì)胞中，PABP基因的缺失突變體是致死 型的，說明該基因?qū)湍讣?xì)胞極其重要;擬南芥PABP5基因是花藥特異性表達(dá)的，該基因在 小孢子發(fā)育過程中可能也起到重要的作用，它的缺失可能會引起植物的敗育。擬南芥中 PAB2基因在tair網(wǎng)站的基因號為At4g34110，PAB4基因在tair網(wǎng)站的基因號為At2g23350 (https ://www.arabidopsis .org/);另外，擬南芥中PAB2、PAB4和PAB8這三個(gè)基因被報(bào)道參 與調(diào)控病毒的復(fù)制。
[0007] 隨著植物耐鹽分子機(jī)制研究的深入及應(yīng)用的拓展，如何利用已發(fā)現(xiàn)的耐鹽基因改 變植物對NaCl的耐受性以及如何培育高效耐鹽新品種成為研究前沿。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明的目的是提供一種通過下調(diào)PAB2和PAB4提高植物對NaCl耐受性的方法。
[0009] 本發(fā)明提供了如下A-C中任一的應(yīng)用：
[0010] A.蛋白質(zhì)1和蛋白質(zhì)2作為靶標(biāo)在如下任一中的應(yīng)用：
[0011] al)提尚植物的耐鹽性；
[0012] a2)選育耐鹽性提尚的植物品種；
[0013]所述蛋白質(zhì)1為PAB2蛋白；所述蛋白質(zhì)2為PAB4蛋白。
[0014] 在所述應(yīng)用中，所述"蛋白質(zhì)1和蛋白質(zhì)2作為靶標(biāo)"具體可為：以所述蛋白質(zhì)1和所 述蛋白質(zhì)2作為靶標(biāo)，下調(diào)所述蛋白質(zhì)1和所述蛋白質(zhì)2的表達(dá)。
[0015] B.能夠抑制植物中蛋白質(zhì)1和蛋白質(zhì)2表達(dá)的物質(zhì)在如下任一中的應(yīng)用：
[0016] al)提尚植物的耐鹽性；
[0017] a2)選育耐鹽性提尚的植物品種；
[0018] 所述蛋白質(zhì)1為PAB2蛋白；所述蛋白質(zhì)2為PAB4蛋白。
[0019] C.能夠抑制植物中蛋白質(zhì)1的編碼基因和蛋白質(zhì)2的編碼基因表達(dá)的物質(zhì)在如下 任一中的應(yīng)用：
[0020] al)提尚植物的耐鹽性；
[0021] a2)選育耐鹽性提尚的植物品種；
[0022] 所述蛋白質(zhì)1為PAB2蛋白；所述蛋白質(zhì)2為PAB4蛋白。
[0023] 更進(jìn)一步，所述蛋白質(zhì)1(PAB2蛋白）為由序列表中序列3所示的氨基酸序列組成的 蛋白質(zhì);所述蛋白質(zhì)2 (PAB4蛋白）為由序列表中序列6所不的氣基酸序列組成的蛋白質(zhì)。
[0024] 在本發(fā)明中，以上所有a2)中的所述選育耐鹽性提高的植物品種的方法，具體可包 括將所述蛋白質(zhì)KPAB2蛋白）和所述蛋白質(zhì)2(PAB4蛋白）表達(dá)量均較低的植株作為親本進(jìn) 行雜交的步驟。
[0025] 本發(fā)明還提供了一種培育耐鹽性提高的轉(zhuǎn)基因植物的方法。
[0026] 本發(fā)明所提供的培育耐鹽性提高的轉(zhuǎn)基因植物的方法，具體可包括如下步驟:在 受體植物中對蛋白質(zhì)1的編碼基因和蛋白質(zhì)2的編碼基因均進(jìn)行抑制表達(dá)，得到轉(zhuǎn)基因植 物;所述轉(zhuǎn)基因植物與所述受體植物相比耐鹽性增強(qiáng)；
[0027] 所述蛋白質(zhì)1為PAB2蛋白；所述蛋白質(zhì)2為PAB4蛋白。
[0028]更進(jìn)一步，所述蛋白質(zhì)1(PAB2蛋白）為由序列表中序列3所示的氨基酸序列組成的 蛋白質(zhì);所述蛋白質(zhì)2 (PAB4蛋白）為由序列表中序列6所不的氣基酸序列組成的蛋白質(zhì)。
[0029]其中，所述"在受體植物中對蛋白質(zhì)1的編碼基因和蛋白質(zhì)2的編碼基因均進(jìn)行抑 制表達(dá)"可為任何能夠抑制所述受體植物中所述蛋白質(zhì)1的編碼基因和所述蛋白質(zhì)2的編碼 基因表達(dá)的方法。在本發(fā)明中，是從擬南芥生物研究中心[Arabidopsis Biological Resource Center(ABRC)，http: //www. arabidopsis · org/]獲得的PAB2和PAB4基因雙敲除 突變體，該雙突變體對NaCl耐受性增強(qiáng)。當(dāng)然，也可以通過基因工程手段(RNAi技術(shù)）獲得 PAB2和PAB4低表達(dá)、對NaCl耐受性增強(qiáng)的轉(zhuǎn)基因植物。
[0030] 在上述應(yīng)用或方法中，所述蛋白質(zhì)1的編碼基因（即PAB2基因）是如下1)至5)中任 一所述的DNA分子：
[0031] 1)編碼序列為序列表中序列2自5'末端第346至2235位核苷酸所示的DNA分子；
[0032] 2)序列表中序列2所示的DNA分子；
[0033] 3)序列表中序列1所示的DNA分子；
[0034] 4)在嚴(yán)格條件下與1)-3)任一所限定的DNA分子雜交且編碼由序列表中序列3所示 的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)的DNA分子；
[0035] 5)與1)-4)任一限定的DNA分子具有90%以上同源性且編碼由序列表中序列3所示 的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)的DNA分子。
[0036] 在上述應(yīng)用或方法中，所述蛋白質(zhì)2的編碼基因（即PAB4基因）是如下6)至10)中任 一所述的DNA分子：
[0037] 6)編碼序列為序列表中序列5自5'末端第157至2145位核苷酸所示的DNA分子； [0038] 7)序列表中序列5所示的DNA分子；
[0039] 8)序列表中序列4所示的DNA分子；
[0040] 9)在嚴(yán)格條件下與6)-8)任一所限定的DNA分子雜交且編碼由序列表中序列6所示 的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)的DNA分子；
[0041] 10)與6)_9)任一限定的DNA分子具有90%以上同源性且編碼由序列表中序列6所 示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)的DNA分子。
[0042] 上述嚴(yán)格條件可為用6 X SSC，0.5 % SDS的溶液，在65°C下雜交，然后用2 X SSC， 0 · 1 % SDS和 1 X SSC，0· 1 % SDS各洗膜一次。
[0043]其中，序列1由3712個(gè)核苷酸組成，為所述PAB2基因在擬南芥基因組中序列，其中 第614-846位、第966-1152位、第 1810-1898位、第 1977-2051 位、第2142-2408位、第2547-2780位、第2952-3053位、第3204-3287位均為內(nèi)含子序列；序列2由2441個(gè)核苷酸組成，為所 述PAB2基因的cDNA序列，其中第346-2235位為編碼序列(0RF);序列1和序列2均編碼序列表 中序列3所示的蛋白質(zhì)，序列3由629個(gè)氨基酸殘基組成。
[0044] 序列4由3217個(gè)核苷酸組成，為所述PAB4基因在擬南芥基因組中序列，其中第455-666位、第 786-869位、第 1527-1623位、第 1702-1794位、第 1885-1965位、第 2101-2201 位、第 2370-2452位、第2636-2728位均為內(nèi)含子序列；序列5由2373個(gè)核苷酸組成，為所述PAB4基 因的cDNA序列，其中第157-2145位為編碼序列(0RF);序列4和序列5均編碼序列表中序列6 所示的蛋白質(zhì)，序列6由662個(gè)氨基酸殘基組成。
[0045] 在上述應(yīng)用或方法中，所述植物即可為雙子葉植物，也可為單子葉植物。
[0046] 在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，所述植物為雙子葉植物，進(jìn)一步為十字花科植物，具體 為擬南芥，更加具體為擬南芥野生型(Col-Ο生態(tài)型）。
[0047] 本發(fā)明研究發(fā)現(xiàn)，從擬南芥生物研究中心(ABRC)獲得的PAB2和PAB4基因雙敲除突 變體對NaCl耐受性增強(qiáng)；因此，可利用PAB2和PAB4調(diào)節(jié)植物對NaCl的耐受性。另外，也可通 過基因工程手段(RNAi技術(shù))獲得PAB2和PAB4低表達(dá)、耐鹽轉(zhuǎn)基因作物。本發(fā)明符合可持續(xù) 農(nóng)業(yè)發(fā)展需求，對于研究植物耐受NaCl分子機(jī)制、改良遺傳特性，培育高效耐鹽新品種等方 面具有重要的實(shí)用價(jià)值和市場前景。
【附圖說明】
[0048] 圖1為PAB2和PAB4基因 T-DNA插入雙突變體pab2-lpab4-l的鑒定。圖中WT代表擬南 芥野生型，即Col-Ο生態(tài)型；圖中2/4代表pab2-lpab4-l雙突變體。從圖中可以看出，pab2-lpab4-l雙突變體植株為純合體植株。
[0049] 圖2為用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測PAB2基因 T-DNA插入突變體pab2-l中PAB2基因表達(dá) 量的分析結(jié)果。從圖中可以看出，pab2-l突變體為PAB2基因敲除突變體。
[0050] 圖3為用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測PAB4基因 T-DNA插入突變體pab4-l中PAB4基因表達(dá) 量的分析結(jié)果。從圖中可以看出，pab4-l突變體為PAB4基因敲除突變體。
[0051 ] 圖4為用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測pab2-lpab4-l雙突變體中PAB2和PAB4基因表達(dá)量 的分析結(jié)果。圖中WT代表擬南芥野生型，即Col-ο生態(tài)型；圖中pab2/4代表pab2-lpab4-l雙 突變體。從圖中可以看出，pab2-lpab4-l雙突變體為PAB2和PAB4基因雙敲除突變體。
[0052] 圖5為NaCl對pab2-lpab4_l雙突變體幼苗生長的影響分析結(jié)果。圖中pab2/4代表 pab2_lp