專利名稱：一種培養(yǎng)基發(fā)酵高產(chǎn)銀耳多糖的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于微生物發(fā)酵培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域，涉及ー種培養(yǎng)基發(fā)酵高產(chǎn)銀耳多糖的方法。
背景技術(shù)：
銀耳又稱白木耳，是ー種高等真菌，是世界上公認的重要藥材。銀耳中含有的ー種酸性多糖類物質(zhì)，能提高機體的免疫功能，具有抗病毒的作用，促進T細胞的活動能力，故能有效地防治癌癥在內(nèi)的多種疾病。銀耳多糖還能提高機體對原子輻射的防護能力，降低機體脂褐質(zhì)沉積的物質(zhì)，具有抗衰延年的作用等。目前市面上要大量獲得銀耳多糖主要采用對分生孢子進行液體深層發(fā)酵，發(fā)酵生產(chǎn)成本低廉，高產(chǎn)多糖，能實現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化，能夠給生產(chǎn)企業(yè)取得顯著的經(jīng)濟效益。高產(chǎn)銀耳多糖的研究大多數(shù)集中在對發(fā)酵條件進行優(yōu)化，發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化在微生物產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)中舉足輕重，是從實驗室到エ業(yè)生產(chǎn)的必要環(huán)節(jié)。能否設計出ー個好的發(fā)酵培養(yǎng)基，是ー個發(fā)酵產(chǎn)品エ業(yè)化成功中非常重要的一歩。本發(fā)明是銀耳多糖液體深層發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化，通過大量的實驗研究篩選，找到了一種最適合其生長酵母狀分生孢子菌發(fā)酵的培養(yǎng)基，目前市面上產(chǎn)多糖4 g/L左右，本發(fā)明的方法產(chǎn)多糖高達9. 5 g/L，在原來的基礎(chǔ)上提高發(fā)酵多糖的產(chǎn)量，以期達到生產(chǎn)最高發(fā)酵多糖的目的。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種培養(yǎng)基液體深層發(fā)酵高產(chǎn)銀耳多糖的方法，其特點是在生產(chǎn)中供菌種生長繁殖和積累發(fā)酵產(chǎn)物，保持銀耳多糖菌體良好的細胞形態(tài)，高密度的生長，獲得大量高純的銀耳多糖產(chǎn)物。本發(fā)明的技術(shù)方案如下
一種培養(yǎng)基發(fā)酵高產(chǎn)銀耳多糖的方法，其特征在于按如下的步驟進行
(1)菌種
銀耳芽孢Tremella fuciformis CGMCCC5. 466購于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心；
(2)培養(yǎng)基配制
銀耳芽孢甘油保藏培養(yǎng)基甘油300g/L ；
銀耳芽孢斜面保藏培養(yǎng)基土豆200g/L，葡萄糖20g/L，蛋白胨5g/L，硫酸鎂0. 3g/L, 磷酸ニ氫鉀2g/L，瓊脂20g/L ；
銀耳芽孢種子培養(yǎng)基葡萄糖20g/L，蛋白胨8 g/L，硫酸鎂2.5 g/L，YNB(無氨基酵母氮源)1. 5g/L，磷酸ニ氫鉀0. 5g/L，PH要求6. 0 ；
銀耳芽孢發(fā)酵培養(yǎng)基葡萄糖30g/L，蛋白胨8g/L，硫酸鎂2.5 g/L, YNB(無氨基酵母氮源)2g/L，磷酸ニ氫鉀0. 5g/L，PH要求6. 0 ；(3)制備エ藝
菌種保藏用甘油保藏培養(yǎng)基，-70°C保存一年；
種子搖瓶培養(yǎng)接種量以5 10%菌液接入到種子培養(yǎng)基中培養(yǎng)1天，培養(yǎng)溫度25°C ； 發(fā)酵培養(yǎng)將培養(yǎng)好的種子以8 10%接種量接入到發(fā)酵罐中，發(fā)酵裝液量5L，發(fā)酵溫度25°C，攪拌轉(zhuǎn)速200rpm，用氨水控制PH6. 0 ；發(fā)酵時間到48h，調(diào)攪拌轉(zhuǎn)速到300rpm，發(fā)酵培養(yǎng)周期到72h結(jié)束，離心收集上清液，濃縮，醇沉得到銀耳多糖。本發(fā)明更加詳細的方法如下
(1) 菌種Tremella fuciformis CGMCCC5. 466購于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心。(2) 培養(yǎng)基配制
銀耳芽孢甘油保藏培養(yǎng)基甘油300g/L。銀耳芽孢斜面保藏培養(yǎng)基土豆200g/L，葡萄糖20g/L，蛋白胨5g/L，硫酸鎂0. 3g/ L,磷酸ニ氫鉀2g/L，瓊脂20g/L。銀耳芽孢種子培養(yǎng)基葡萄糖20g/L，蛋白胨8 g/L，硫酸鎂2.5 g/L，YNB(無氨基酵母氮源)1.5g/L，磷酸ニ氫鉀0.5g/L，PH要求6.0。銀耳芽孢發(fā)酵培養(yǎng)基葡萄糖30g/L，蛋白胨8g/L，硫酸鎂2. 5 g/L, YNB (無氨基酵母氮源)2g/L，磷酸ニ氫鉀0. 5g/L，PH要求6.0。(3) 制備エ藝
菌種保藏用甘油保藏培養(yǎng)基，-70°C保存一年。種子搖瓶培養(yǎng)接種量以5 10%菌液接入到種子培養(yǎng)基中培養(yǎng)1天，培養(yǎng)溫度 25 0C ο發(fā)酵培養(yǎng)將培養(yǎng)好的種子以10%接種量接入到發(fā)酵罐中，發(fā)酵裝液量5L，發(fā)酵溫度25°C，攪拌轉(zhuǎn)速200rpm，用氨水控制PH6. 0 ；發(fā)酵時間到48h，調(diào)攪拌轉(zhuǎn)速到300rpm，發(fā)酵培養(yǎng)周期到7 結(jié)束，離心收集上清，濃縮，醇沉多糖。發(fā)酵培養(yǎng)基為(葡萄糖30g/L，蛋白胨8g/L，硫酸鎂2. 5g/L，磷酸ニ氫鉀0. 5g/L，YNB (無氨基酵母氮源)2g/L，PH要求6. 0)。本發(fā)明制備的發(fā)酵多糖的理化特性如下
方法先采用脫蛋白(Sevage法)、脫小分子(透析)、凝膠色譜純化(EDAE柱)，柱純化吋，采用硫酸苯酚法監(jiān)測，然后進行DEAE柱色譜圖分析得到兩種均一體多糖BN516和 BN608。BN516和BN608均一體多糖的生物活性抑制淋巴瘤實驗
取BN516和BN608多糖，用注射用水配置成濃度5mg/kg、10mg/kg。IRM-2純系小鼠，雌雄各半。在IRM-2純系小鼠左側(cè)腹股溝處皮下注射，把IRM-2純系小鼠自發(fā)淋巴瘤傳代培養(yǎng)，處死IRM-2純系小鼠剝離瘤塊，稱瘤重，通過實驗表明，銀耳多糖對淋巴瘤具有抑制作用。本發(fā)明的有益效果通過發(fā)酵培養(yǎng)中設計到的培養(yǎng)基，使發(fā)酵過程中有利分生孢子菌體的生長，代謝大量的目標產(chǎn)物，得到了高效生產(chǎn)多糖9. 5g/L，有利于縮短了發(fā)酵周期、成本低廉、エ藝簡單易操作、環(huán)境污染小、能得到高產(chǎn)的多糖及容易實現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化。
具體實施方式
下面結(jié)合實施例說明本發(fā)明，這里所述實施例的方案，不限制本發(fā)明，本領(lǐng)域的專業(yè)人員按照本發(fā)明的精神可以對其進行改進和變化，所述的這些改進和變化都應視為在本發(fā)明的范圍內(nèi)，本發(fā)明的范圍和實質(zhì)由權(quán)利要求來限定。其中所用的培養(yǎng)基個各種試劑均有市
隹實施例1
本發(fā)明用的菌種為iTremella fuciformis CGMCCC5. 466購于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心。先把菌種轉(zhuǎn)接到銀耳芽孢斜面保藏培養(yǎng)基中培養(yǎng)4天，溫度要求 25°C，斜面保藏培養(yǎng)基為(土豆200g/L，葡萄糖20g/L，蛋白胨5g/L，硫酸鎂0.3g/L，磷酸 ニ氫鉀2g/L，瓊脂20g/L);然后把培養(yǎng)好的斜面菌種轉(zhuǎn)接到甘油保藏培養(yǎng)基中進行-70°C 保存，保存時間為一年，甘油保藏培養(yǎng)基為(甘油300g/L)；
在甘油保藏培養(yǎng)好的菌種以10%接種量轉(zhuǎn)接到搖瓶種子培養(yǎng)基中培養(yǎng)1天，培養(yǎng)溫度25°C，搖床轉(zhuǎn)速160rpm，種子培養(yǎng)基為(葡萄糖20g/L，蛋白胨8g/L，硫酸鎂2. 5g/L， YNB(無氨基酵母氮源)1.5 g/L，磷酸ニ氫鉀0.5g/L，PH要求6.0);將培養(yǎng)好的種子以10% 接種量接入到發(fā)酵罐中，發(fā)酵裝液量5L，發(fā)酵溫度25°C，攪拌轉(zhuǎn)速200rpm，根據(jù)細胞的生長情況把溶氧控制在50%，通氣速率3vvm，用氨水控制PH6. 0 ；當發(fā)酵時間到4 進行調(diào)攪拌轉(zhuǎn)速到300rpm，發(fā)酵培養(yǎng)周期到7 結(jié)束，發(fā)酵培養(yǎng)基為(葡萄糖30g/L，蛋白胨8g/L，硫酸鎂2. 5g/L，磷酸ニ氫鉀2. 5g/L，YNB (無氨基酵母氮源)2g/L，PH要求6. 0)；
把發(fā)酵液進行離心收集細胞和上清液，離心轉(zhuǎn)速為3000 rpm,時間為20min ；將收集好的發(fā)酵上清進行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮，濃縮溫度75°C ；加三倍體積乙醇進行多糖沉淀，靜置 IOmin后離心收集沉淀，離心轉(zhuǎn)速為3000 rpm，時間為20min，沉淀用少許乙醚洗進行脫色， 用溫箱50°C烘干，收集得到高產(chǎn)多糖9. 5g/L。實施例2
(1)菌種銀耳芽抱！1remella fuciformis CGMCCC5. 466購于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心；
(2)培養(yǎng)基配制
銀耳芽孢甘油保藏培養(yǎng)基甘油300g/L ；
銀耳芽孢斜面保藏培養(yǎng)基土豆200g/L，葡萄糖20g/L，蛋白胨5g/L，硫酸鎂0. 3g/L, 磷酸ニ氫鉀2g/L，瓊脂20g/L ；
銀耳芽孢種子培養(yǎng)基葡萄糖20g/L，蛋白胨8 g/L，硫酸鎂2.5 g/L，YNB(無氨基酵母氮源)1. 5g/L，磷酸ニ氫鉀0. 5g/L，PH要求6. 0 ；
銀耳芽孢發(fā)酵培養(yǎng)基葡萄糖30g/L，蛋白胨8g/L，硫酸鎂2.5 g/L, YNB(無氨基酵母氮源)2g/L，磷酸ニ氫鉀0.5g/L，PH要求6.0 ；
(3)制備エ藝
菌種保藏用甘油保藏培養(yǎng)基，-70°C保存一年；
種子搖瓶培養(yǎng)接種量以5%菌液接入到種子培養(yǎng)基中培養(yǎng)1天，培養(yǎng)溫度25°C ； 發(fā)酵培養(yǎng)將培養(yǎng)好的種子以10%接種量接入到發(fā)酵罐中，發(fā)酵裝液量5L，發(fā)酵溫度 25°C，攪拌轉(zhuǎn)速200rpm，溶氧控制50%，用氨水控制PH6. 0 ；發(fā)酵時間到48h，調(diào)攪拌轉(zhuǎn)速到 300rpm，發(fā)酵培養(yǎng)周期到7 結(jié)束，把發(fā)酵液進行離心收集細胞和上清液，離心轉(zhuǎn)速為3000 rpm，時間為20min ；將收集好的發(fā)酵上清進行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮，濃縮溫度75°C ；加三倍體積乙醇進行多糖沉淀，靜置IOmin后離心收集沉淀，離心轉(zhuǎn)速為3000 rpm,時間為20min，沉淀用少許乙醚洗進行脫色，用溫箱50°C烘干，收集得到高產(chǎn)多糖9. 5g/L。實施例3比較試驗常規(guī)方法
(1)方法液體深層發(fā)酵
(2)步驟先用種子培養(yǎng)基培養(yǎng)種子，種子培養(yǎng)基為麥芽糖10g/L，葡萄糖10g/L，蛋白胨4g/L，磷酸ニ氫鉀0. 46g/L，磷酸氫ニ鉀lg/L，硫酸鎂lg/L，PH自然；培養(yǎng)好的種子在轉(zhuǎn)接到發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)，發(fā)酵培養(yǎng)基為麥芽糖10g/L，葡萄糖20g/L，豆粕20g/L，磷酸ニ氫鉀0. 46g/L，磷酸氫ニ鉀lg/L，硫酸鎂lg/L，PH自然；培養(yǎng)120h收集發(fā)酵液進行濃縮，醇沉， 收集多糖。(3)結(jié)果收集得到多糖4 g/L左右。本發(fā)明的方法
(1)方法液體深層發(fā)酵
(2)步驟先用種子培養(yǎng)基培養(yǎng)種子，種子培養(yǎng)基為葡萄糖20g/L，蛋白胨8g/L，硫酸鎂2. 5 g/L, YNB (無氨基酵母氮源)1. 5g/L，磷酸ニ氫鉀0. 5g/L，PH要求6. 0 ；培養(yǎng)好的種子在轉(zhuǎn)接到發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)，發(fā)酵培養(yǎng)基為葡萄糖30g/L，蛋白胨8g/L，硫酸鎂2.5 g/ L, YNB (無氨基酵母氮源)2g/L，磷酸ニ氫鉀0. 5g/L，PH要求6. 0 ；培養(yǎng)7 收集發(fā)酵液進行濃縮，醇沉，收集多糖。(3)結(jié)果收集得到高產(chǎn)多糖9. 5 g/L。
權(quán)利要求
1. 一種培養(yǎng)基發(fā)酵高產(chǎn)銀耳多糖的方法，其特征在于按如下的步驟進行(1)菌種銀耳芽孢Tremella fuciformis CGMCCC5. 466購于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心；(2)培養(yǎng)基配制銀耳芽孢甘油保藏培養(yǎng)基甘油300g/L ；銀耳芽孢斜面保藏培養(yǎng)基土豆200g/L，葡萄糖20g/L，蛋白胨5g/L，硫酸鎂0. 3g/L, 磷酸ニ氫鉀2g/L，瓊脂20g/L ；銀耳芽孢種子培養(yǎng)基葡萄糖20g/L，蛋白胨8 g/L，硫酸鎂2.5 g/L，YNB(無氨基酵母氮源)1. 5g/L，磷酸ニ氫鉀0. 5g/L，PH要求6. 0 ；銀耳芽孢發(fā)酵培養(yǎng)基葡萄糖30g/L，蛋白胨8g/L，硫酸鎂2.5 g/L, YNB(無氨基酵母氮源)2g/L，磷酸ニ氫鉀0.5g/L，PH要求6.0 ；(3)制備エ藝菌種保藏用甘油保藏培養(yǎng)基，-70°C保存一年；種子搖瓶培養(yǎng)接種量以5 10%菌液接入到種子培養(yǎng)基中培養(yǎng)1天，培養(yǎng)溫度25°C ；發(fā)酵培養(yǎng)將培養(yǎng)好的種子以8 10%接種量接入到發(fā)酵罐中，發(fā)酵裝液量5L，發(fā)酵溫度25°C，攪拌轉(zhuǎn)速200rpm，用氨水控制PH6. 0 ；發(fā)酵時間到48h，調(diào)攪拌轉(zhuǎn)速到300rpm，發(fā)酵培養(yǎng)周期到72h結(jié)束，離心收集上清液，濃縮，醇沉得到銀耳多糖。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種培養(yǎng)基發(fā)酵高產(chǎn)銀耳多糖的方法，屬于微生物發(fā)酵培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明用于Tremellafuciformis CGMCCC5.466作為菌種，先接入種子培養(yǎng)基中培養(yǎng)一天，將培養(yǎng)好的種子接入到發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)，發(fā)酵裝液量5L,發(fā)酵周期72h，然后把發(fā)酵液進行離心，收集，濃縮，醇沉，乙醚洗，烘干，得到高產(chǎn)多糖9.5g/L，本發(fā)明的方法有效的縮短了發(fā)酵周期、具有工藝簡單易操作、環(huán)境污染小、能得到高產(chǎn)的多糖及容易實現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化的特點。
文檔編號C12R1/645GK102559802SQ20121000409
公開日2012年7月11日 申請日期2012年1月9日 優(yōu)先權(quán)日2012年1月9日
發(fā)明者孫長海, 李建, 楊珺, 王昌華, 王玉香, 童應凱, 黃海東 申請人:天津超然生物技術(shù)有限公司