專利名稱：結(jié)核分枝桿菌Wag31基因及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種結(jié)核分枝桿菌基因Wag31及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
結(jié)核分枝桿菌O^cohcteriWB to力ercWosis)是人類健康的嚴(yán)重威脅。近年來， 中國結(jié)核分枝桿菌感染形式不容樂觀，有愈演愈烈的趨勢。結(jié)核分枝桿菌感染人體后，可侵入巨噬細胞并長期存活，引起肺部肉芽腫的形成，并與巨噬細胞為主的免疫細胞存在復(fù)雜的細菌-宿主相互作用。解析它們之間相互作用機理，對于理解結(jié)核分枝桿菌感染機制，提出新的控制結(jié)核分枝桿菌感染的方法意義重大。Wag31，是DivIVA同源蛋白，在結(jié)核分枝桿菌中保守存在。近期研究表明，wag31廣泛參與到結(jié)核分枝桿菌的極點生長與細胞壁合成，對菌體生長分裂和菌體形態(tài)的維持有重要影響。我們在實驗中發(fā)現(xiàn)，wag31可以結(jié)合淋巴細胞趨化因子)(CL2。)(CL2由巨噬細胞產(chǎn)生，可以趨化影響樹突狀細胞、T細胞等多種免疫細胞。進一步的研究表明，Wag31可以誘導(dǎo))(CL2在巨噬細胞中的表達，這提示我們wag31可能在細菌-宿主相互作用、肺部肉芽腫的形成起到關(guān)鍵作用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種重組表達結(jié)核分枝桿菌Wag31的方法，得到含有 wag31蛋白序列的重組蛋白Wag31。本發(fā)明還提供相應(yīng)的重組質(zhì)粒。本發(fā)明提供一種重組蛋白Wag31，該重組蛋白是將結(jié)核分枝桿菌wag31的基因片段插入pET30a質(zhì)粒中，構(gòu)建表達結(jié)核分枝桿菌Wag31的重組工程菌，轉(zhuǎn)化大腸桿菌表達株 BL21 (DE3)中，表達出的含有wag31蛋白序列的重組蛋白。具體步驟為以標(biāo)準(zhǔn)毒株H37Rv 的基因組作為模板，用PCR法擴增Wag31的基因片段，并將該基因重組到表達型質(zhì)粒pET30a 中，該重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌表達株BL21 (DE3)中表達蛋白Wag31。本發(fā)明提供的重組蛋白Wag31與NCBI中NP_216661. 1蛋白序列相比，加入了表達標(biāo)簽His tag和表達載體上的一小段序列。表達的Wag31蛋白攜帶6X his-tag，分子質(zhì)量四.71 1，用親和純化法得到的蛋白Wag31蛋白純度好，得率高，可為進一步的生物學(xué)研究創(chuàng)造條件。本發(fā)明所用的宿主細胞應(yīng)當(dāng)與表達質(zhì)粒相匹配，可使用原核細胞或者真核細胞等，例如常用的大腸桿菌(Escherichia coli)?？捎糜谵D(zhuǎn)化的宿主細胞可以是BL21 (DE3) 菌株，本發(fā)明的一個實施例中用的是BL21 (DE3)菌株。本發(fā)明還提供一種重組質(zhì)粒，該重組質(zhì)粒是含有原核生物的啟動子序列和結(jié)核分枝桿菌wag31的基因片段。具體是將Wag31基因序列插入一般的商用表達質(zhì)粒中。Wag31 基因的NCBI登錄號為NC_000962. 2，蛋白的NCBI登錄號為NP_216661. 1。本發(fā)明所述的“Wag31基因序列”也包括對NC_000962. 2中一個或多個密碼子被編碼相同氨基酸的簡并密碼子所取代后產(chǎn)生的序列。由于密碼子的簡并性，所以與 NC_000962. 2核苷酸序列同源性低至約70%的兼并序列也能編碼出相同的氨基酸序列，該術(shù)語還包括能在中度嚴(yán)緊條件下，更佳地在高度嚴(yán)緊條件下，與NC_000962. 2的核苷酸序列雜交的核苷酸序列。該術(shù)語還包括與NC_000962. 2的核苷酸序列的同源性至少70%，較佳的至少80%，更佳的至少90%的核苷酸序列。本發(fā)明的重組質(zhì)粒，通常將Wag31基因插入表達質(zhì)粒的多克隆位點即得。重組質(zhì)粒制備過程中，可選用本領(lǐng)域已知的各種載體，如市售的載體，然后將編碼本發(fā)明的核苷酸序列可操作的連于表達調(diào)控序列，可以形成蛋白表達載體。本發(fā)明所采用的載體有PET3M， pET28a, pET30a等。在本發(fā)明的一個實施例中，所用的質(zhì)粒是pET30a。本發(fā)明還提供在真核細胞中表達結(jié)核分枝桿菌Wag31蛋白的方法，具體步驟是以標(biāo)準(zhǔn)毒株H37Rv的基因組作為模板，用PCR法擴增Wag31的基因片段，并將該基因重組到真核表達質(zhì)粒pcDNA3. Ι/HisA中，該重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至THP-I細胞中表達蛋白Wag31。表達的 Wag31蛋白攜帶6X his-tag。可使用His抗體，western blot法檢驗細胞中Wag31蛋白表達水平。本發(fā)明的一個方面，提供了一種新的重組質(zhì)粒，即將Wag31基因序列插入一般的商用真核表達質(zhì)粒中。Wag31基因的NCBI登錄號為NC_000962. 2，蛋白的NCBI登錄號為 NP_216661. 1。本發(fā)明中的“Wag31基因序列”也包括對NC_000962. 2中一個或多個密碼子被編碼相同氨基酸的簡并密碼子所取代后產(chǎn)生的序列。由于密碼子的簡并性，所以與 NC_000962. 2核苷酸序列同源性低至約70%的兼并序列也能編碼出相同的氨基酸序列，該術(shù)語還包括能在中度嚴(yán)緊條件下，更佳地在高度嚴(yán)緊條件下，與NC_000962. 2的核苷酸序列雜交的核苷酸序列。該術(shù)語還包括與NC_000962. 2的核苷酸序列的同源性至少70%，較佳的至少80%，更佳的至少90%的核苷酸序列。本發(fā)明的重組質(zhì)粒，通常將Wag31基因插入表達質(zhì)粒的多克隆位點即得。本發(fā)明的重組質(zhì)粒制備過程中，可選用本領(lǐng)域已知的各種載體，如市售的載體，然后將編碼本發(fā)明的核苷酸序列可操作的連于表達調(diào)控序列，可以形成蛋白表達載體。本發(fā)明的另一方面，提供了一種結(jié)核分枝桿菌相關(guān)的重組蛋白，即重組蛋白是將插入Wag31基因片段的重組表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入宿主細胞而得到的。在本發(fā)明的實施例中，Wag31重組蛋白與NCBI中NP_216661. 1蛋白序列相比，加入了表達標(biāo)簽His tag和表達載體上的一小段序列。所用的宿主細胞應(yīng)當(dāng)與表達質(zhì)粒相匹配，可使用真核細胞等，例如常用的THP-I 細胞。本發(fā)明還提供檢驗Wag31與THPl細胞中)(CL2相互作用的方法，具體步驟如下將以上的pcDNA3. l/HisA-ffag31重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染經(jīng)PMA誘導(dǎo)分化的THPl細胞。在二氧化碳濃度 5%的培養(yǎng)箱中，37度培養(yǎng)，然后進行如下兩種操作1.分時間梯度裂解細胞，并抽提mRNA， 使用real-time PCR法檢測細胞中)(CL2的mRNA水平變化；2.分時間梯度裂解細胞，并使用western blot法檢測細胞中)(CL2蛋白的表達量變化。具體步驟可見實施例3。本發(fā)明還提供所述的wag31重組蛋白在構(gòu)建重組BCG疫苗方面的應(yīng)用，即利用結(jié)核分枝桿菌Wag31的蛋白，作為疫苗組分，構(gòu)建重組BCG疫苗。在該應(yīng)用中，可將wag31基因片段由H37Rv基因組中擴增得到，作為唯一 DNA片段或片段之一插入可在BCG菌株中穩(wěn)定表達的質(zhì)粒，并將該重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入感受態(tài)BCG菌體中，表達wag31蛋白，獲得過表達wag31蛋白的重組BCG疫苗。
本發(fā)明還提供一種DNA疫苗配方，即利用結(jié)核分枝桿菌Wag31的基因片段，作為 DNA疫苗基因片段的一部分，構(gòu)建DNA疫苗。 在該應(yīng)用中，可將wag31基因片段由H37Rv基因組中擴增得到，作為唯一 DNA片段或片段之一插入可在真核細胞中中穩(wěn)定表達的質(zhì)粒(如PVAX系列質(zhì)粒)，并將該重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)移入實驗動物中，使其發(fā)揮免疫保護效果。本發(fā)明還提供一種亞單位疫苗配方，即利用所述表達結(jié)核分枝桿菌Wag31蛋白， 作為亞單位疫苗組分。在該應(yīng)用中，可利用由上述原核細胞表達體系中獲得的wag31蛋白，作為唯一蛋白或蛋白成分之一，伴同一般商用免疫佐劑，注射如實驗動物中，使其發(fā)揮免疫保護效果。


圖1原核表達wag31蛋白電泳圖，泳道7顯示純化后的蛋白條帶。圖2顯示內(nèi)源性)(CL2與wag31的免疫共沉淀實驗。圖 3 wag31 誘導(dǎo) THP-I 細胞表達 XCL2。( β -actin 為內(nèi)參)。
具體實施例方式下面結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明，應(yīng)當(dāng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明，并不限制本發(fā)明的范圍。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明闡述內(nèi)容后，本領(lǐng)域技術(shù)人員對發(fā)明的各種改動或修改，同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。實施例1 原核表達結(jié)核分枝桿菌Wag31蛋白。1)大腸桿菌感受態(tài)制備
大腸桿菌Dffia接種于LB培養(yǎng)基中，37攝氏度，搖床轉(zhuǎn)速200rpm，培養(yǎng)過夜；培養(yǎng)結(jié)束收集菌體，12000rpm, 4攝氏度離心，IOmin0棄掉上清，輕輕振松菌塊，慢慢加入預(yù)冷的 CaCl2溶液重懸菌體，冰浴后離心，棄掉上清。重新使用CaC12溶液重懸菌體，冰浴池，4度保存。2)原核表達質(zhì)粒的構(gòu)建
以標(biāo)準(zhǔn)毒株H37Rv的基因組作為模板，用PCR法擴增Wag31的基因片段，并將該基因重組到表達型質(zhì)粒pET30a中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌Dffia。測序鑒定wag31片段與NCBI序列 NC_000962. 2完全相同的質(zhì)粒作為表達質(zhì)粒。3)表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)。將鑒定好的，攜帶Wag31基因片段的重組質(zhì)粒加入到1)中所述感受態(tài)細胞中，冰浴30min，之后42攝氏度水浴45s，最后冰上靜置aiiin。向熱轉(zhuǎn)化后的感受態(tài)細胞中加入無抗生素的LB培養(yǎng)基中，37攝氏度培養(yǎng)45min，涂布攜帶相應(yīng)抗性的LB平板，在37攝氏度溫箱中倒置培養(yǎng)過夜。4 )表達并純化Wag31蛋白
從轉(zhuǎn)化的平板上挑取單菌落，接種于LB培養(yǎng)基中，37攝氏度培養(yǎng)過夜，至對數(shù)期時，加入IPTG，37攝氏度誘導(dǎo)4h，收集菌體破碎后，如果目的蛋白存在于上清中，16000rpm離心1 小時，收集上清。如果目的蛋白以不溶性的包涵體形式表達，菌體破碎后，離心收集包涵體， 將包涵體溶于含有尿素的緩沖液中，完全溶解后，離心收集上清。
使用鎳柱純化收集到的蛋白溶液，如果目標(biāo)蛋白存在于上清中，則使用Tris緩沖液透析，如果目標(biāo)蛋白以包涵體的形式存在，需要將收集到的目標(biāo)蛋白在復(fù)性緩沖液中透析復(fù)性。實施例2 在THP-I細胞中真核表達結(jié)核分枝桿菌蛋白Wag31。一、細胞培養(yǎng)
THP-I細胞均在RPMI1640(10%胎牛血清)培養(yǎng)液中培養(yǎng)。每隔2到3天換一次新鮮培養(yǎng)液。T HP-I細胞為懸浮培養(yǎng)，鏡檢達到80%以上后，吸取部分到新的培養(yǎng)液中傳代。二、Wag31真核表達質(zhì)粒的構(gòu)建
以標(biāo)準(zhǔn)毒株H37Rv的基因組作為模板，用PCR法擴增Wag31的基因片段，并將該基因重組到表達型質(zhì)粒pcDNA3. Ι/HisA中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌Dffia。測序鑒定wag31片段與NCBI序列NC_000962.2完全相同的質(zhì)粒作為真核表達質(zhì)粒，該質(zhì)粒表達出的wag31蛋白攜帶His tag。三、瞬時細胞轉(zhuǎn)染
細胞以廣2*105每皿(30mm)的密度接種，培養(yǎng)過夜。加入適量PMA，使其終濃度為ΙΟμΜ/ ml，充分混勻，37°C，5%C02培養(yǎng)M小時，誘導(dǎo)THP-I細胞貼壁。將3μ1 FuGENE放入預(yù)先置于室溫的97μ1無血清的培養(yǎng)液中，混勻，室溫放置 5min。將lPgpcDNA3. l/hisA-wag31融合質(zhì)粒加入到FuGENE和培養(yǎng)液的混合液中，充分混勻，室溫靜置20分鐘。吸去THP-I貼壁細胞培養(yǎng)上清，用PBS洗1次，加入Iml無血清的培養(yǎng)液，加入上述轉(zhuǎn)染質(zhì)?；旌弦?。37 °C，5%C02培養(yǎng)。四、細胞總蛋白的提取
以PBS洗滌細胞一次，以IOOu廣200ul每皿(30mm)的量加入細胞總蛋白提取液(組織裂解液TPER+蛋白酶抑制劑(終濃度為1. 2mg/ml)+PMSF終濃度為0. lmg/ml)，用細胞刮子將細胞刮下，轉(zhuǎn)移入EP管中，冰上放置15分鐘。離心(13000rpm，2分鐘)取上清，即為含有總蛋白的細胞裂解液。五、Western bloting
取適量細胞裂解液上樣于SDS-PAGE膠，80/120V電泳。電泳結(jié)束，將膠轉(zhuǎn)移至電轉(zhuǎn)緩沖液(48mM Tris, 39mM甘氨酸，0.0375% w/v SDS)中平衡15分鐘。將PVDF膜用甲醇浸濕， 去離子水沖洗，再轉(zhuǎn)移到電轉(zhuǎn)緩沖液中平衡15分鐘。電轉(zhuǎn)移使用干法，按照正極-6層濾紙-PVDF膜-電泳膠-6層濾紙-負(fù)極的順序安放，電壓23v，電轉(zhuǎn)3(Γ40分鐘。電轉(zhuǎn)結(jié)束后，將PVDF膜置于20ml封閉液中(IXPBS, 0. 05% Tween20, 5%脫脂奶粉)， 室溫封閉1小時。使用廣2ml封閉液以1:1000到1 5000稀釋一抗His抗體，使PVDF膜浸于一抗稀釋液中，室溫結(jié)合1小時。之后使用PBST (1XPBS，0. 05% Tween20)室溫洗滌5次，每次 5min。使用廣2ml封閉液以1:20000稀釋二抗，將PVDF膜浸于二抗稀釋液中，室溫結(jié)合 1小時，使用PBST，室溫洗滌5次，每次5分鐘。焚光底物(supersigna west Femto Maximun Sensitiity Substrate)按比{列混合好，加在PVDF膜上，室溫避光防止5分鐘，之后吸去熒光底物，暗室壓片適當(dāng)時間，顯影在膠片上。根據(jù)顯影條帶確定wag31-his tag融合蛋白在THP-I細胞中的表達。實施例3 檢驗Wag31與THPl細胞中)(CL2相互作用的方法。l)ffag31和內(nèi)源)(CL2蛋白的免疫共沉淀實驗。將pcDNA3. l/HisA_wag31轉(zhuǎn)染到THP-1細胞中。方法同實施例2中，瞬時細胞轉(zhuǎn)
^fe ο轉(zhuǎn)染后48小時，將細胞裂解。在600ul細胞裂解液加入15ul proteinA/GpLUS agarose和2ul鼠抗His的抗體(0. lmg/ml)進行免疫沉淀。同時留取50ul細胞裂解液作為對照。4°C結(jié)合過夜。離心，小心去除上清。加入200ul組織裂解液洗滌1次。離心 (5krpm，2分鐘)，小心去除上清。重復(fù)四次。在沉淀中加入30ul IX蛋白電泳上樣緩沖液。 在沸水浴中煮3分鐘。離心(13. 2krpm，l分鐘)，取上清以鼠抗人)(CL2的抗體進行western 檢測。Western blot方法同實施例2中western blot方法。(附圖2)。2) wag31 誘導(dǎo) THP-1 細胞表達 XCL2。將pcDNA3. l/HisA-wag31轉(zhuǎn)染到THP-1細胞中。方法同實施例2中，瞬時細胞轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染后Muia1和Mh，分別取細胞進行裂解。取等量的各時間的細胞樣品用鼠抗人XCL2的抗體進行western檢測。Western blot方法同實施例2中western blot方法。 轉(zhuǎn)染后Mh，xCLZ蛋白的表達量明顯地提高(圖3)。
權(quán)利要求
1.一種重組蛋白，其特征是將結(jié)核分枝桿菌Wag31的基因片段插入pET30a質(zhì)粒中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌表達株BL21中，表達出的含有wag31蛋白序列的重組蛋白。
2.一種重組質(zhì)粒，其特征是含有原核生物的啟動子序列和結(jié)核分枝桿菌wag31的基因片段。
3.—種在原核細胞中表達如權(quán)利要求1中所述結(jié)核分枝桿菌Wag31蛋白的方法，其特征是將基因片段Wag31插入表達質(zhì)粒pET30a，表達結(jié)核分枝桿菌Wag31的重組工程菌。
4.一種在真核細胞中表達結(jié)核分枝桿菌Wag31蛋白的方法，其特征是在THPl細胞中表達的結(jié)核分枝桿菌蛋白Wag31。
5.一種在真核細胞中，檢驗結(jié)核分枝桿菌Wag31引起巨噬細胞)(CL2分泌并結(jié)合)(CL2 的方法，其特征是在轉(zhuǎn)錄水平和蛋白表達水平檢驗)(CL2的分泌，利用免疫共沉淀法檢驗 Wag31與)(CL2的結(jié)合。
6.一種融合DNA片段，其特征是含有真核生物的啟動子序列和結(jié)核分枝桿菌Wag31的基因片段。
7.如權(quán)利要求1所述的重組蛋白在構(gòu)建重組BCG疫苗方面的應(yīng)用，其特征是利用結(jié)核分枝桿菌Wag31的蛋白，作為疫苗組分，構(gòu)建重組BCG疫苗。
8.—種DNA疫苗配方，其特征是利用結(jié)核分枝桿菌Wag31的基因片段，作為DNA疫苗基因片段的一部分，構(gòu)建DNA疫苗。
9.一種亞單位疫苗配方，其特征是利用表達結(jié)核分枝桿菌Wag31蛋白，作為亞單位疫苗組分。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及結(jié)核分枝桿菌Wag31基因及其用途。Wag31是結(jié)核分枝桿菌抗原，以標(biāo)準(zhǔn)毒株H37Rv的基因組DNA作為模板，用PCR法擴增Wag31的基因片段，并插入到原核表達質(zhì)粒pET30a中，表達純化可獲得Wag31的高純度蛋白；用PCR法擴增Wag31的基因片段，并插入到真核表達質(zhì)粒pcDNA3.1中。將重組質(zhì)粒pcDNA3.1轉(zhuǎn)染至THP1細胞中，發(fā)現(xiàn)Wag31蛋白不但可以引起趨化因子XCL2高表達，也可以結(jié)合XCL2，這表示了Wag31可能對結(jié)核分枝桿菌，細菌-宿主相互作用起到重要作用，是一種可用于DNA疫苗，亞單位疫苗和重組BCG疫苗的候選基因。
文檔編號C12R1/32GK102558319SQ20121001216
公開日2012年7月11日 申請日期2012年1月16日 優(yōu)先權(quán)日2012年1月16日
發(fā)明者呂紅, 張鷺, 徐文璽, 曹煒, 王洪海, 郝珂威 申請人:復(fù)旦大學(xué)