一種利用結(jié)晶紫染色檢測結(jié)核分枝桿菌生物被膜方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于結(jié)核分枝桿菌致機制及耐藥性研宄技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種利用結(jié)晶紫染色檢測結(jié)核分枝桿菌生物被膜方法。
【背景技術(shù)】
[0002]結(jié)核病是一種古老的傳染病，是由結(jié)核分枝桿菌引起的一種人獸共患、慢性、消耗性疾病。目前結(jié)核病是僅次于艾滋病的全球三大傳染性疾病之一。結(jié)核病的最常發(fā)病部位為肺部，可通過空氣傳播。隨著二十世紀四十年代一系列抗結(jié)核藥物的出現(xiàn)，結(jié)核病得到有效控制，但是耐藥菌株隨之出現(xiàn)，近年來又出現(xiàn)多耐藥菌株、泛耐藥菌株，加之部分患者混合感染有艾滋病，導致結(jié)核病感染率、發(fā)病率和死亡率呈逐年上升趨勢。所以近年來結(jié)核分枝桿菌的致病機制以及耐藥性的研宄成為熱點。
[0003]在自然環(huán)境中細菌以浮游或者生物被膜兩種形式存在，細菌生物被膜是指細菌附著于惰性或者活性實體的表面繁殖分化并分泌一些多糖基質(zhì)將菌體群落包裹其中而形成的細菌聚集體膜狀物。大量研宄證明，結(jié)核分枝桿菌可以形成生物被膜，且生物被膜的形成與免疫逃避有密切聯(lián)系，并可以顯著增強結(jié)核分枝桿菌的耐藥性，不同結(jié)核分枝桿菌的成膜能力與其耐藥性成正相關(guān)。
[0004]進行結(jié)核分枝桿菌生物被膜檢測，有助于臨床和藥物研宄人員篩選出有效的抗結(jié)核潛在藥物，為結(jié)核分枝桿菌治病機制以及耐藥性研宄奠定基礎(chǔ)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是為了更精確地研宄結(jié)核分枝桿菌的成膜能力和耐藥性，而提供一種結(jié)晶紫染色檢測結(jié)核分枝桿菌生物被膜方法。
[0006]一種結(jié)晶紫染色檢測結(jié)核分枝桿菌生物被膜方法，它包括:
1)洗滌生物被膜；
2)50攝氏度干燥，在0.5-1.5%結(jié)晶紫溶液中孵育；
3)洗滌后，離心去上清，50攝氏度干燥；
4)加95%乙醇孵育，渦旋震蕩，制備懸液；
5)分光光度計測懸液A570nm的吸光度讀數(shù)；
步驟I)所述的洗滌是用PBS洗滌；
步驟2)所述的結(jié)晶紫溶液為1% ;
步驟2)所述的干燥時間為5min ;步驟3)所述的干燥時間為30min。
[0007]本發(fā)明提供了一種結(jié)晶紫染色檢測結(jié)核分枝桿菌生物被膜方法，它包括:洗滌生物被膜；50攝氏度干燥，在0.5-1.5%結(jié)晶紫溶液中孵育；洗滌后，50攝氏度干燥；加95%乙醇孵育，渦旋震蕩，制備懸液；分光光度計測懸液A570nm的吸光度讀數(shù)；測得的生長曲線具有良好的線型關(guān)系。可以對生物被膜進行更為精準地定量檢測。
[0008]利用結(jié)晶紫染色檢測結(jié)核分枝桿菌生物被膜，其突出的優(yōu)點是:檢測方法步驟簡單，對儀器的要求低；能在短時間內(nèi)，條件簡陋的情況下檢測結(jié)核分枝桿菌生物被膜的生長情況，且較銀染等其他染色方法更加經(jīng)濟，精準地定量檢測生物被膜，對結(jié)核分枝桿菌致病機制、耐藥性研宄以及藥物篩選具有重要的意義。
【附圖說明】
[0009]圖1結(jié)核分枝桿菌生物被膜生長14天的照片；
圖2結(jié)核分枝桿菌生物被膜生長21天的照片；
圖3結(jié)核分枝桿菌生物被膜生長28天的照片；
圖4結(jié)核分枝桿菌生物被膜生長35天的照片；
圖5結(jié)核分枝桿菌生物被膜生長42天的照片；
圖6結(jié)核分枝桿菌生物被膜結(jié)晶紫定量生長曲線圖。
[0010]實施例1結(jié)核分枝桿菌生物被膜的培養(yǎng)
1.參照文獻(Anil K.0jha etc,Growth of Mycobacterium tuberculosis b1filmscontaining free mycolic acids and harbouring drug-tolerant bacteria)在 50ml 滅菌血清瓶中進行結(jié)核分枝桿菌生物被膜培養(yǎng)，培養(yǎng)8瓶。具體操作如下:a.將結(jié)核分枝桿菌標準株單菌落接入還有150ml 7H9B培養(yǎng)基的錐形瓶中，150rpm/min搖動培養(yǎng)I周，生長至對數(shù)期；b.用紫外分光光度計測菌液的0D600吸光度值為1.1，向10份菌液中加入I份新鮮7H9B培養(yǎng)基，測0D600吸光度值至0.9，符合0D600值為0.7-1.0 ；c.分裝15ml蘇通培養(yǎng)基至滅菌血清瓶中，向瓶中加入步驟b中0.5ml稀釋好的菌液，擰緊瓶蓋，37度靜置培養(yǎng)。
[0011]實施例2利用結(jié)晶紫染色檢測結(jié)核分枝桿菌生物被膜生長不同時期的被膜含量分別在第14天，第21天，第28天，第35天，第42天，取I瓶生物被膜進行結(jié)晶紫染色定量，方法如下:
1)用微量移液器將生物被膜下面的培養(yǎng)基吸干，用2mlPBS輕輕洗2次，將浮游菌洗掉；
2)在生物安全柜中50攝氏度干燥5min后，將Iml1%結(jié)晶紫溶液滴至生物被膜上，孵育 1min ；
3)將生物被膜用3ml去離子水漂洗后，13000g離心5min，棄上清，重復3次；
4)加入2ml95%乙醇，孵育lOmin，用移液器反復吹打，渦旋震蕩，制備懸液；
5)用B1-RadSmartSpec Plus分光光度計分別測步驟4懸液A570nm的吸光度讀數(shù)，每個樣本測3次，求平均值，做生長曲線圖(見圖6);結(jié)果表明，在生物被膜開始培養(yǎng)5周內(nèi)，結(jié)核分枝桿菌生物被膜一直呈生長狀態(tài)，且隨著時間的延長生長速度變緩。測得的生長曲線可以如實反映生物被膜的生長情況。
【主權(quán)項】
1.一種結(jié)晶紫染色檢測結(jié)核分枝桿菌生物被膜方法，它包括: 1)洗滌生物被膜； 2)50攝氏度干燥，在0.5-1.5%結(jié)晶紫溶液中孵育； 3)洗滌后，離心去上清，50攝氏度干燥； 4)加95%乙醇孵育，渦旋震蕩，制備懸液； 5)分光光度計測懸液A570nm的吸光度讀數(shù)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種結(jié)晶紫染色檢測結(jié)核分枝桿菌生物被膜方法，其特征在于:步驟I)所述的洗滌是用PBS洗滌。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種結(jié)晶紫染色檢測結(jié)核分枝桿菌生物被膜方法，其特征在于:步驟2)所述的結(jié)晶紫溶液為1%。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種結(jié)晶紫染色檢測結(jié)核分枝桿菌生物被膜方法，其特征在于:步驟2)所述的干燥時間為5min。
5.根據(jù)權(quán)利要求1、2、3或4所述的一種結(jié)晶紫染色檢測結(jié)核分枝桿菌生物被膜方法，其特征在于:步驟3)所述的干燥時間為30min。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種結(jié)晶紫染色檢測結(jié)核分枝桿菌生物被膜方法，它包括：洗滌生物被膜；50攝氏度干燥，在0.5-1.5%結(jié)晶紫溶液中孵育；洗滌后，50攝氏度干燥；加95%乙醇孵育，渦旋震蕩，制備懸液；分光光度計測懸液A570nm的吸光度讀數(shù)；測得的生長曲線具有良好的線型關(guān)系。可以對生物被膜進行更為精準地定量檢測；利用結(jié)晶紫染色檢測結(jié)核分枝桿菌生物被膜，其突出的優(yōu)點是：檢測方法步驟簡單，對儀器的要求低；能在短時間內(nèi)，條件簡陋的情況下檢測結(jié)核分枝桿菌生物被膜的生長情況，且較銀染等其他染色方法更加經(jīng)濟，精準地定量檢測生物被膜，對結(jié)核分枝桿菌治病機制、耐藥性研究以及藥物篩選具有重要的意義。
【IPC分類】C12R1-32, C12Q1-06
【公開號】CN104818315
【申請?zhí)枴緾N201410780003
【發(fā)明人】于錄, 楊志強, 孟日增, 唐旭東, 范君文, 汪楊, 宋宇, 郭娜, 張巧麗, 王超
【申請人】吉林大學
【公開日】2015年8月5日
【申請日】2014年12月17日