專利名稱：轉(zhuǎn)基因大豆bps-cv127-9檢測(cè)用標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒分子及其構(gòu)建方法與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種生物工程技術(shù)領(lǐng)域的質(zhì)粒分子，具體來(lái)說(shuō)，涉及一種轉(zhuǎn)基因大豆 BPS-CV127-9檢測(cè)用標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒分子及其構(gòu)建方法與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
在過(guò)去的幾十年里，隨著分子生物學(xué)各領(lǐng)域的不斷發(fā)展，植物基因的分離、基因工程載體的構(gòu)建、細(xì)胞的基因轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)化細(xì)胞的組織培養(yǎng)、植株再生及外源基因表達(dá)的檢測(cè)等各項(xiàng)技術(shù)日趨成熟和完善，有關(guān)植物基因工程的研究日新月異，許多以前根本不可能的基因轉(zhuǎn)化工作在越來(lái)越多的植物上獲得成功。各種轉(zhuǎn)基因作物新品種的不斷的研究出來(lái)。近十幾年來(lái)，我國(guó)農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物技術(shù)得到了飛速的發(fā)展，我國(guó)轉(zhuǎn)基因抗蟲棉花、延熟番茄、 抗病辣椒、抗蟲楊樹和抗病番木瓜，轉(zhuǎn)植酸玉米等已先后獲得安全證書，進(jìn)入了商業(yè)化生產(chǎn)。轉(zhuǎn)基因大豆BPS-CV127-9是巴斯夫植物科學(xué)公司開發(fā)的耐咪唑啉酮類農(nóng)業(yè)除草劑的大豆作物，該品種含有耐除草劑擬南芥AHASL (csrl-2)編碼序列和擬南芥AHASL終止子。隨著轉(zhuǎn)基因作物的大量種植及應(yīng)用，轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品開始大量進(jìn)入我們的生活。轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品潛在的食品安全、生態(tài)安全問(wèn)題日益引起人們的關(guān)注，各國(guó)紛紛制定相應(yīng)的法律法規(guī)對(duì)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品進(jìn)行監(jiān)管。許多國(guó)家以立法或者其他形式要求對(duì)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品進(jìn)行標(biāo)記。除美國(guó)、加拿大、阿根廷和中國(guó)香港特區(qū)實(shí)行自愿標(biāo)識(shí)制度外，國(guó)際上的大多數(shù)國(guó)家如歐盟各國(guó)、日本、韓國(guó)等國(guó)均制定了一系列強(qiáng)制性的標(biāo)識(shí)標(biāo)準(zhǔn)。我國(guó)分別于2001年、2002年頒布實(shí)施《農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全管理?xiàng)l例》及《農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物標(biāo)識(shí)管理辦法》，并啟動(dòng)了農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物的監(jiān)督監(jiān)管機(jī)制。各國(guó)轉(zhuǎn)基因標(biāo)識(shí)制度的相繼建立和公眾對(duì)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品關(guān)注度的提高，對(duì)轉(zhuǎn)基因檢測(cè)技術(shù)的靈敏度和準(zhǔn)確性提出了嚴(yán)格的要求，因此，各種轉(zhuǎn)基因檢測(cè)技術(shù)也就成了研究熱點(diǎn)。常用的轉(zhuǎn)基因檢測(cè)方法有聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)法，外源蛋白檢測(cè)法，基因芯片檢測(cè)技術(shù)，分子雜交方法等，目前最主要使用的方法是PCR法。根據(jù)不同轉(zhuǎn)基因植物及其檢測(cè)目的的不同，鑒定轉(zhuǎn)基因植物主要包括檢測(cè)篩選基因、目的基因、不同基因間的交聯(lián)結(jié)構(gòu)基因、和轉(zhuǎn)入基因與受體植物間的轉(zhuǎn)化體特異結(jié)構(gòu)基因。轉(zhuǎn)化體特異性檢測(cè)的基礎(chǔ)是轉(zhuǎn)基因構(gòu)建體在基因組DNA序列上的整合位點(diǎn)具有高度特異性，即使是相同的載體多次轉(zhuǎn)化， 整合的位置和整合位點(diǎn)特征也是不可能重復(fù)的。因此根據(jù)不可重復(fù)的整合位點(diǎn)特征序列， 開發(fā)出了轉(zhuǎn)化體特異性檢測(cè)方法。與前三種方法相比，轉(zhuǎn)化體特異性檢測(cè)具有最高的特異性，最適合做轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的定性和定量檢測(cè)。轉(zhuǎn)化事件特異性檢測(cè)是轉(zhuǎn)基因作物及其產(chǎn)品檢測(cè)的發(fā)展趨勢(shì)，必將在轉(zhuǎn)基因檢測(cè)中發(fā)揮重要的作用。在轉(zhuǎn)基因定性、定量PCR檢測(cè)過(guò)程中，陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品是必須的，因此陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品的配置要求非常嚴(yán)格，必須經(jīng)過(guò)多個(gè)實(shí)驗(yàn)室的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證方可應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因定量PCR檢測(cè)。以轉(zhuǎn)基因植物的種子等制作的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，制作過(guò)程復(fù)雜，不易保存，且每個(gè)檢測(cè)都要有相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，極大的阻礙了轉(zhuǎn)基因檢測(cè)的發(fā)展。標(biāo)準(zhǔn)分子的概念由日本科學(xué)家Kuribara等于2002年提出，它是指一種含有轉(zhuǎn)基因檢測(cè)目的外源基因和內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因的特異性片段的線性化重組質(zhì)粒分子。經(jīng)驗(yàn)證質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子在GMO鑒定檢測(cè)中是很好的標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性物質(zhì)替代物。 質(zhì)粒分子的優(yōu)點(diǎn)主要是可以通過(guò)微生物進(jìn)行大量培養(yǎng)，DNA易于擴(kuò)增，所以可提供無(wú)限穩(wěn)定量的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，并且純度較高；且操作容易，穩(wěn)定性高，同一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)分子可以同時(shí)包含多個(gè)外源目的基因，經(jīng)濟(jì)又高效。甚至有學(xué)者將質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子稱為“金標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)”。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供了轉(zhuǎn)基因大豆BPS-CV127-9品系的特異性檢測(cè)用標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒分子及其構(gòu)建方法，使其可以代替轉(zhuǎn)基因大豆BPS-CV127-9的陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)用于轉(zhuǎn)基因大豆BPS-CV127-9特異性的定性、定量PCR檢測(cè)。本發(fā)明的設(shè)計(jì)思路為根據(jù)轉(zhuǎn)基因大豆BPS-CV127-9的品系特異性序列和內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因序列，利用重疊PCR反應(yīng)的原理設(shè)計(jì)特異PCR引物，經(jīng)過(guò)PCR擴(kuò)增獲得轉(zhuǎn)基因大豆 BPS-CV127-9的轉(zhuǎn)化體特異序列和內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因lectin —段序列的重組DNA片段。利用分子克隆技術(shù)重組DNA片段到克隆載體pGM-T載體中，獲得新的質(zhì)粒分子pGMT-CV127。本發(fā)明構(gòu)建的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒分子可以代替轉(zhuǎn)基因大豆BPS-CV127-9原有的陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，用于定性和定量PCR檢測(cè)，徹底解決了轉(zhuǎn)基因大豆BPS-CV127-9檢測(cè)中標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)缺乏的難題。本發(fā)明是通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的轉(zhuǎn)基因大豆BPS-CV127-9檢測(cè)用標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒分子，其空白載體為質(zhì)粒載體pGM_T，包含有轉(zhuǎn)基因大豆BPS-CV127-9的轉(zhuǎn)化體特異序列和大豆內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因lectin的特異性片段。所述轉(zhuǎn)基因大豆BPS-CV127-9的轉(zhuǎn)化體特異序列為 GCCCTCCTTATTTATCCCCTTAGTTTTTATTTTCATTTCTTTCTAATAAAGGGGCAAACTAGTCTCGT AATATATTAGAGGTTAATTAAATTTATATTCCTCAAATAAAACCCAATTTTCATCCTTAAACGAACCTGCTGAAAC CCT ;如序列表中I所示。所述大豆內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因lectin的特異性片段的序列為GCCCTCTACTCCACCCCCATCCACATTTGGGACAAAGAAACCGGTAGCGTTGCCAGCTTCGCCGCTTCC TTCAACTTCACCTTCTATGCCCCTGACACAAAAAGGCTTGCAGATGGGC ;如序列表中 2 所示。所述轉(zhuǎn)基因大豆BPS-CV127-9檢測(cè)用標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒分子的構(gòu)建方法為首先，設(shè)計(jì)特異性PCR引物，從轉(zhuǎn)基因大豆BPS-CV127-9基因組DNA中擴(kuò)增獲得轉(zhuǎn)基因大豆BPS-CV127-9 的轉(zhuǎn)化體特異序列和大豆內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因lectin —段序列的重組DNA片段，然后，利用分子克隆技術(shù)重組DNA片段到克隆載體pGM-T載體中，獲得新的質(zhì)粒分子pGMT-CV127。具體構(gòu)建步驟如下①利用GenBank等數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行生物信息學(xué)分析，獲得大豆內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因lectin、轉(zhuǎn)基因大豆BPS-CV127-9的轉(zhuǎn)化體特異性序列。所述的大豆內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因lectin，指的是大豆凝集素基因，其在大豆基因組中高度保守，具有種間特異性、種內(nèi)非特異性和單拷貝數(shù)的特點(diǎn)。所述的轉(zhuǎn)基因大豆BPS-CV127-9的轉(zhuǎn)化體特異性序列，指的是轉(zhuǎn)基因大豆 BPS-CV127-9外源插入載體與大豆基因組鄰接區(qū)的DNA序列。②設(shè)計(jì)PCR特異性引物。所述的PCR特異性引物，指的是長(zhǎng)度為28±10nt的寡核苷酸鏈，其與大豆lectin基因或者轉(zhuǎn)基因大豆BPS-CV127-9的轉(zhuǎn)化體特異性序列完全相同或者相互補(bǔ)。③特異性的擴(kuò)增大豆內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因lectin和轉(zhuǎn)基因大豆BPS_CV127_9的轉(zhuǎn)化體特異性序列。所述的特異性的擴(kuò)增，指的是利用設(shè)計(jì)的特異性的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增大豆lectin 基因和轉(zhuǎn)基因大豆BPS-CV127-9的轉(zhuǎn)化體特異性序列。④大豆lectin基因和轉(zhuǎn)基因大豆BPS_CV127_9的轉(zhuǎn)化體特異性序列的拼接。所述的拼接，指的是利用重疊PCR技術(shù)將大豆lectin基因和轉(zhuǎn)基因大豆 BPS-CV127-9的轉(zhuǎn)化體特異性序列兩個(gè)獨(dú)立的DNA片段融合成一個(gè)重組的新DNA片段。⑤含有新的重組DNA片段的質(zhì)粒分子克隆。所述的分子克隆，指的是將上述得到的重組特異性DNA片段連接到質(zhì)粒載體 pGM-T上，或得轉(zhuǎn)基因標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒分子pGMT-CV127。⑥標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒分子pGMT-CV127的定性和定量PCR檢測(cè)方法驗(yàn)證所述的定性PCR檢測(cè)方法驗(yàn)證，是指用于標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒分子PGMT-CV127構(gòu)建的品系特異性片段只能在轉(zhuǎn)基因大豆BPS-CV127-9基因組DNA中擴(kuò)增獲得，而不能在其他大豆品種和作物基因組中擴(kuò)增得到。所述的定量PCR檢測(cè)方法驗(yàn)證,是指檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒分子pGMT_CV127在進(jìn)行定量 PCR分析是的特異性、靈敏度、重復(fù)性、和重演性等特性，以鑒定該標(biāo)準(zhǔn)分子替代轉(zhuǎn)基因大豆 BPS-CV127-9陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的能力，以及實(shí)際用于定量PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)基因大豆BPS-CV127-9的測(cè)定有效性。上述構(gòu)建方法中，所述PCR特異性引物為兩對(duì)，序列如下S0E-CV127-1 GCCCTCCTTATTTATCCCCTTAGT ；S0E-CV127-2 GGATGGGGGTGGAGTAGAGGGCAGGGTTTCAGCAGGTTCGTT ；SOE-lec-1 AACGAACCTGCTGAAACCCTGCCCTCTACTCCACCCCCATCC ；S0E-lec-2 :GCCCATCTGCAAGCCTTTTTGTG。本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因大豆BPS-CV127-9檢測(cè)用標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒分子，可以用于轉(zhuǎn)基因大豆 BPS-CV127-9的定性、定量檢測(cè)。定性檢測(cè)時(shí)，檢測(cè)方法為首先，提取待檢測(cè)樣品的基因組DNA，以此為模板，使用特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以轉(zhuǎn)基因大豆BPS-CV127-9檢測(cè)用標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒分子作為陽(yáng)性對(duì)照； 然后，待檢測(cè)樣品的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物以瓊脂糖凝膠電泳分離，EB染色后鑒定是否存在擴(kuò)增產(chǎn)物，若存在擴(kuò)增產(chǎn)物，則待檢測(cè)樣品中含有BPS-CV127-9轉(zhuǎn)化事件；若不存在擴(kuò)增產(chǎn)物，則待檢測(cè)樣品中不含有BPS-CV127-9轉(zhuǎn)化事件。定性檢測(cè)時(shí)，所述特異性引物序列如下CV127-F:5’ -GCCCTCCTTATTTATCCCCTTAGT-3’ ；CV127-R:5， -AGGGTTTCAGCAGGTTCGTT-3，；Iectin-F :5' -GCCCTCTACTCCACCCCCATCC-3'；Iectin-R :5' -GCCCATCTGCAAGCCTTTTTGTG-3'。定量檢測(cè)時(shí)，檢測(cè)方法為首先，以轉(zhuǎn)基因大豆BPS-CV127-9檢測(cè)用標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒分子為標(biāo)準(zhǔn)品，使用特異性引物和TaqMan探針進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增，以Ct為縱坐標(biāo)， 以起始拷貝數(shù)的自然對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，制作大豆內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因lectin標(biāo)準(zhǔn)曲線和轉(zhuǎn)基因大豆BPS-CV127-9的轉(zhuǎn)化體特異性引物標(biāo)準(zhǔn)曲線；然后，提取待檢測(cè)樣品的基因組DNA，以此為模板，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增，將其Ct值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算出樣品的起始拷貝數(shù)，然后利用轉(zhuǎn)基因大豆的拷貝數(shù)與大豆內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因的拷貝數(shù)之比，即可得到樣品中轉(zhuǎn)基因大豆 BPS-CV127-9的百分含量。定量檢測(cè)時(shí)，所述特異性引物和TaqMan探針的序列如下BPS-CV127-9引物和探針序列如下CV127-1F:5’ -GCCCTCCTTATTTATCCCCTTAGT-3’ ；CV127-1R:5， -GCAGGTTCGTTTAAGGATGAAAA-3，；CV127-P :5’ -FAM-TATTCCTCAAATAAAACCC-MGB-3’ ；lectin基因引物和探針序列如下Lectin-IF :5’ -GGCATAGAAGGTGAAGTTGAAGGA-3’ ；Lectin-IR :5，-TCCACCCCCATCCACATTT-3，； Lectin-P : 5，-FAM-ACAAAGAAACCGGTAGCG-MGB-3，。本發(fā)明利用重疊PCR和分子亞克隆的方法首次構(gòu)建了含有大豆lectin基因和轉(zhuǎn)基因大豆BPS-CV127-9的轉(zhuǎn)化體特異性序列的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒分子pGMT-CV127。本發(fā)明中明確提出此標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒分子可以代替轉(zhuǎn)基因大豆BPS-CV127-9的陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)用于該品系特異性定性、定量PCR檢測(cè)，很好的解決了該品系檢測(cè)過(guò)程中陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)缺乏的問(wèn)題。此標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒分子PGMT-CV127對(duì)實(shí)際樣品分析的結(jié)果比較準(zhǔn)確。因此，本發(fā)明中構(gòu)建的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒分子完全適合用于對(duì)轉(zhuǎn)基因大豆BPS-CV127-9樣品及其加工產(chǎn)品的定性定量檢測(cè)。


圖I為本發(fā)明構(gòu)建的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒分子pGMT-CV127的示意圖譜。圖2為PCR擴(kuò)增BPS-CV127-9側(cè)翼序列的電泳圖，其中，M =Mark DL2000 ；1 :標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒分子 PGMT-CV127 ；2 =Conquista ；3 :轉(zhuǎn)基因大豆 GTS40-3-2 ；4 Mon87701 ；5 :A5547_127 ； 6 A5547 ；7 :轉(zhuǎn)基因大豆305423 ；8 :轉(zhuǎn)基因玉米Mon810 ；9 :非轉(zhuǎn)基因玉米鄭單958 ；10 :轉(zhuǎn)基因棉花M0N531 ；11 :非轉(zhuǎn)基因大豆1138-2 ；12 :空白對(duì)照。圖3為lectin基因標(biāo)準(zhǔn)曲線。圖4為BPS-CV127-9特異性序列標(biāo)準(zhǔn)曲線。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說(shuō)明；本實(shí)施例在以本發(fā)明技術(shù)方案為前提下進(jìn)行實(shí)施，給出了詳細(xì)的實(shí)施方式和過(guò)程，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不限于下述的實(shí)施例。實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，按照常規(guī)條件操作。實(shí)施例I :標(biāo)準(zhǔn)分子的構(gòu)建一、實(shí)驗(yàn)試劑DNA提取試劑盒購(gòu)自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司，ex Taq DNA聚合酶及 dNTPs、DNA分子量標(biāo)記(IOObp DNA marker)購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司，X_gal、氨芐青霉素(Amp)、IPTG、pGM-T克隆載體試劑盒、LB培養(yǎng)基購(gòu)自北京天根生化公司。由上海博尚公司合成引物,測(cè)序。
二、實(shí)驗(yàn)儀器恒溫培養(yǎng)箱、渦旋震蕩器、紫外分光光度計(jì)(美國(guó)Beckman公司)、BI0_RAD PCR擴(kuò)增儀、EPS 301凝膠電泳系統(tǒng)、⑶S800凝膠成像系統(tǒng)、Beckman臺(tái)式冷凍離心機(jī)、ESCO生物
安全柜等。三、實(shí)驗(yàn)方法和過(guò)程I、利用GenBank等數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行生物信息學(xué)分析，獲得大豆內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因lectin基因、轉(zhuǎn)基因大豆BPS-CV127-9的轉(zhuǎn)化體特異性序列。2、構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒分子pGMT-CV127的PCR引物設(shè)計(jì)根據(jù)大豆內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因lectin基因和轉(zhuǎn)基因大豆BPS_CV127_9的轉(zhuǎn)化體特異性序列，使用Primer5. 0設(shè)計(jì)兩對(duì)弓I物，一對(duì)弓I物用于擴(kuò)增轉(zhuǎn)基因大豆BPS-CV127-9外源插入載體與大豆基因組鄰接區(qū)特異性序列，另一對(duì)引物用于擴(kuò)增大豆內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因lectin基因的序列。引物序列見表I。表I.構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒分子pGMT-CV127的PCR引物
權(quán)利要求
1.轉(zhuǎn)基因大豆BPS-CV127-9檢測(cè)用標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒分子，其特征在于其空白載體為質(zhì)粒載體pGM-T，包含有轉(zhuǎn)基因大豆BPS-CV127-9的轉(zhuǎn)化體特異序列和大豆內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因lectin的特異性片段。
2.權(quán)利要求I所述的轉(zhuǎn)基因大豆BPS-CV127-9檢測(cè)用標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒分子的構(gòu)建方法，其特征在于首先，設(shè)計(jì)特異性PCR引物，從轉(zhuǎn)基因大豆BPS-CV127-9基因組DNA中擴(kuò)增獲得轉(zhuǎn)基因大豆BPS-CV127-9的轉(zhuǎn)化體特異序列和大豆內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因lectin —段序列的重組DNA 片段，然后，利用分子克隆技術(shù)重組DNA片段到克隆載體pGM-T載體中，獲得新的質(zhì)粒分子 PGMT-CV127。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的構(gòu)建方法，其特征在于步驟如下①設(shè)計(jì)PCR特異性引物；②特異性的擴(kuò)增大豆內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因lectin和轉(zhuǎn)基因大豆BPS-CV127-9的轉(zhuǎn)化體特異性序列；③大豆lectin基因和轉(zhuǎn)基因大豆BPS-CV127-9的轉(zhuǎn)化體特異性序列的拼接；④含有新的重組DNA片段的質(zhì)粒分子克隆，得到標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒分子BPS-CV127-9。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的構(gòu)建方法，其特征在于所述PCR特異性引物為兩對(duì)，序列如下S0E-CV127-1 GCCCTCCTTATTTATCCCCTTAGT ；S0E-CV127-2 GGATGGGGGTGGAGTAGAGGGCAGGGTTTCAGCAGGTTCGTT ；SOE-lec-1 AACGAACCTGCTGAAACCCTGCCCTCTACTCCACCCCCATCC ；S0E-lec-2 :GCCCATCTGCAAGCCTTTTTGTG。
5.權(quán)利要求I所述的轉(zhuǎn)基因大豆BPS-CV127-9檢測(cè)用標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒分子在定性檢測(cè)轉(zhuǎn)基因大豆BPS-CV127-9中的應(yīng)用。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于檢測(cè)方法為首先，提取待檢測(cè)樣品的基因組DNA，以此為模板，使用特異性弓I物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以轉(zhuǎn)基因大豆BPS-CV127-9檢測(cè)用標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒分子作為陽(yáng)性對(duì)照；然后，待檢測(cè)樣品的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物以瓊脂糖凝膠電泳分離，EB染色后鑒定是否存在擴(kuò)增產(chǎn)物，若存在擴(kuò)增產(chǎn)物，則待檢測(cè)樣品中含有BPS-CV127-9轉(zhuǎn)化事件；若不存在擴(kuò)增產(chǎn)物，則待檢測(cè)樣品中不含有BPS-CV127-9轉(zhuǎn)化事件。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于所述特異性引物序列如下CV127-F :5’ -GCCCTCCTTATTTATCCCCTTAGT-3’ ；CV127-R:5’ -AGGGTTTCAGCAGGTTCGTT-3’ ；Iectin-F :5' -GCCCTCTACTCCACCCCCATCC-3'；Iectin-R :5' -GCCCATCTGCAAGCCTTTTTGTG-3'。
8.權(quán)利要求I所述的轉(zhuǎn)基因大豆BPS-CV127-9檢測(cè)用標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒分子在定量檢測(cè)轉(zhuǎn)基因大豆BPS-CV127-9中的應(yīng)用。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其特征在于檢測(cè)方法為首先，以轉(zhuǎn)基因大豆 BPS-CV127-9檢測(cè)用標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒分子為標(biāo)準(zhǔn)品，使用特異性引物和TaqMan探針進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增，以Ct為縱坐標(biāo)，以起始拷貝數(shù)的自然對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，制作大豆內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因lectin標(biāo)準(zhǔn)曲線和轉(zhuǎn)基因大豆BPS-CV127-9的轉(zhuǎn)化體特異性引物標(biāo)準(zhǔn)曲線；然后，提取待檢測(cè)樣品的基因組DNA，以此為模板，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增，將其Ct值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算出樣品的起始拷貝數(shù)，然后利用轉(zhuǎn)基因大豆的拷貝數(shù)與大豆內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因的拷貝數(shù)之比，即可得到樣品中轉(zhuǎn)基因大豆BPS-CV127-9的百分含量。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的應(yīng)用，其特征在于所述特異性引物和TaqMan探針的序列如下BPS-CV127-9引物和探針序列如下CV127-1F:5’ -GCCCTCCTTATTTATCCCCTTAGT-3’ ；CV127-1R:5’ -GCAGGTTCGTTTAAGGATGAAAA-3’ ；CV127-P :5’ -FAM-TATTCCTCAAATAAAACCC-MGB-3’ ； lectin基因引物和探針序列如下Lectin-IF :5，-GGCATAGAAGGTGAAGTTGAAGGA-3，；Lectin-IR :5’ -TCCACCCCCATCCACATTT-3’ ；Lectin-P :5，-FAM-ACAAAGAAACCGGTAGCG-MGB—3，。
全文摘要
本發(fā)明公開了轉(zhuǎn)基因大豆BPS-CV127-9檢測(cè)用標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒分子，其載體為質(zhì)粒載體pGM-T，包含有轉(zhuǎn)基因大豆BPS-CV127-9的轉(zhuǎn)化體特異序列和大豆內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因lectin的特異性片段。其構(gòu)建方法為首先，設(shè)計(jì)特異性PCR引物，從轉(zhuǎn)基因大豆BPS-CV127-9基因組DNA中擴(kuò)增獲得轉(zhuǎn)基因大豆BPS-CV127-9的轉(zhuǎn)化體特異序列和大豆內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因lectin一段序列的重組DNA片段，然后，利用分子克隆技術(shù)重組DNA片段到克隆載體pGM-T載體中，獲得新的質(zhì)粒分子pGMT-CV127。本發(fā)明構(gòu)建的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒分子可以代替轉(zhuǎn)基因大豆BPS-CV127-9原有的陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，用于定性和定量PCR檢測(cè)，徹底解決了轉(zhuǎn)基因大豆BPS-CV127-9檢測(cè)中標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)缺乏的難題。
文檔編號(hào)C12N15/66GK102586306SQ201210053519
公開日2012年7月18日 申請(qǐng)日期2012年3月2日 優(yōu)先權(quán)日2012年3月2日
發(fā)明者孫紅煒, 李凡, 李寧, 楊淑珂, 路興波 申請(qǐng)人:山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所