太子參環(huán)肽b標準品的制備方法
【專利摘要】提供標準品太子參環(huán)肽B的制備方法，從中藥太子參中提取分離純化標準品太子參環(huán)肽B，太子參干藥材粉碎后用工業(yè)乙醇熱回流提取，浸膏經(jīng)乙醇前處理后，用硅膠柱層析進行太子參環(huán)肽B的富集，洗脫溶劑為氯仿-甲醇系統(tǒng)，最后經(jīng)制備型高效液相色譜制備得到純度在98%以上的太子參環(huán)肽B。本發(fā)明的方法能快捷分離得到太子參環(huán)肽B，樣品損失少，成本較低，操作方便，可控性和重現(xiàn)性好，溶劑可以反復回收利用，適用于工業(yè)生產(chǎn)。
【專利說明】太子參環(huán)肽B標準品的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于醫(yī)藥【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種以中藥太子參為原料制備標準品太子參環(huán)肽B的提取分離純化方法。
【背景技術(shù)】
[0002]太子參(PseudostellariaeRadix, ‘Tai Zi Shen’)是石竹科植物孩兒參Pseudostellaria heterophylla (Miq.) Pax ex Pax et Hoffm.的干燥塊根，別名異葉假繁縷，是常用中藥?，F(xiàn)市售太子參主要來自安徽、貴州、福建、江蘇、山東等種植基地。味甘、微苦，平，歸脾、肺經(jīng)，具有益氣健脾、生津潤肺等功效，用于脾虛體倦，食欲不振，病后虛弱，氣陰不足，自汗口渴，肺燥干咳，為補氣中藥中的一味清補之品，特別適合作為少兒、老年人、久病恢復病人的滋補佳品?，F(xiàn)代藥理研究表明，太子參具有增強免疫、抗疲勞、抗應激、抗氧化、抗衰老、抗真菌等多種藥理活性，而且在治療白細胞減少癥、心絞痛、肺炎、淋巴結(jié)核、糖尿病、繼發(fā)性再生障礙性貧血等癥方面取得了突破。
[0003]目前已報道從太子參中分離得到的化合物類型有環(huán)肽、皂苷、氨基酸、糖、油脂、揮發(fā)性物質(zhì)、磷脂及脂肪酸等，其成分與功效之間的關(guān)系至今尚不夠明確。很多學者認為環(huán)肽類成分是太子參的特征性成分，1993年譚寧華等首先從太子參中發(fā)現(xiàn)了 2個新環(huán)肽類成分太子參環(huán)肽A和B (Heterophyllin A, B),現(xiàn)已從太子參中分離報道10多個環(huán)肽類成分，2010年版《中華人民共和國藥典》新增加了太子參環(huán)肽B含量測定指標，建立了其HPLC含量測定方法，用于太子參藥材的質(zhì)量控制。
[0004]有關(guān)標準品太子 參環(huán)肽B的制備工藝的國內(nèi)外報道較少，現(xiàn)有技術(shù)中未見有可應用于工業(yè)生產(chǎn)的太子參環(huán)肽B的制備方法。因此，有必要尋找一種簡便、安全、經(jīng)濟高效、可應用于工業(yè)化生產(chǎn)的太子參環(huán)肽B的制備方法。

【發(fā)明內(nèi)容】
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[0005]本發(fā)明的目的旨在針對現(xiàn)有技術(shù)的上述不足，提供一種簡單快速、樣品損失少、成本低、可控性和重現(xiàn)性好、適用于工業(yè)化生產(chǎn)的太子參環(huán)肽B標準品的制備方法，建立一種通過多種現(xiàn)代分離分析技術(shù)手段相結(jié)合的方法。
[0006]本發(fā)明的上述目的是通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn)的:
[0007]太子參環(huán)肽B標準品的制備方法，包括以下步驟:
[0008](I)提取:太子參藥材曬干，粉碎至粒徑20-80目，加入4-10倍體積的95%工業(yè)乙醇進行熱回流提取，熱回流溫度75-85°C，提取時間2-4h，每次過濾后將殘渣重復提取過程2-3次，合并提取液，減壓濃縮至比重1.1-1.2 ；
[0009](2)前處理:向浸膏中加入5-15倍體積的95%工業(yè)乙醇于75_85°C熱回流溶解l-3h，冷卻靜置8-24h，過濾濃縮濾液，得到太子參環(huán)肽總提物；
[0010](3)富集:將上述太子參環(huán)肽總提物用少量甲醇溶解，拌入拌樣用柱層析硅膠，干燥，加載于分離用層析硅膠柱床頂端，用氯仿-甲醇溶劑梯度洗脫，收集流出液，TLC檢測環(huán)肽成分，合并所有含環(huán)肽部分，回收溶劑，干燥得到太子參環(huán)肽B粗品，HPLC-MS分析，快速鎖定目標產(chǎn)物；
[0011](4)分離純化:取上述富集產(chǎn)物，甲醇溶解過濾，用制備型高效液相色譜進行跟蹤分離純化，流動相為乙腈-水溶液，根據(jù)HPLC-MS分析結(jié)果，收集太子參環(huán)肽B色譜峰流出液，回收溶劑，干燥得到純度98%以上的太子參環(huán)肽B純品。
[0012]上述步驟(1)中的太子參為石竹科植物孩兒參Pseudostellariaheterophylla (Miq.)Pax ex Pax et Hoffm.的干燥塊根。
[0013]上述步驟(1)中熱回流提取所用溶劑為原藥材4-10倍體積的95%工業(yè)乙醇，提取時間2-4h，溫度75-85°C，每次過濾后將殘渣重復提取過程2-3次，合并提取液，減壓濃縮至比重 1.1-1.2。
[0014]上述步驟(2)中前處理所用溶劑為浸膏5-15倍體積的95%工業(yè)乙醇，熱回流溶解時間為l_3h，溫度75-85°C，冷卻靜置時間為8-24h。
[0015]上述步驟(3)中所用拌樣用柱層析硅膠為100-200目，用量為太子參環(huán)肽總提物重量的1-1.5倍，分離用柱層析硅膠為200-300目，用量為太子參環(huán)肽總提物的15-40倍。
[0016]上述步驟(3)中所用洗脫溶劑為氯仿-甲醇溶劑系統(tǒng)，梯度或等度洗脫:20-40:1 (6-14BV)，6-12:1(6-14BV)。
[0017]上述步驟(3)中所用TLC環(huán)肽檢測方法:薄層板為硅膠G板，樣品點于硅膠G板上，用氯仿-甲醇(8:2-9:1)展開，揮掉溶劑后，在100-120°C用4-8NHC1溶液水解30_60min后，再噴灑2%-5%茚三酮乙醇溶液顯色劑，加熱后顯桔黃色至橙紅色斑點。
[0018]上述步驟(3)中所述HPLC-MS檢測分析太子參環(huán)肽B的方法，HPLC色譜條件為:色譜柱:C18柱，柱溫:室溫，流動相:乙腈-7K，乙腈在流動相中的比例為:0-20min，20%-32% ；20-40min, 32% ；40-50min, 32%_45%，流速:1.0ml/min,檢測:DAD 檢測器，檢測波長:203nm。質(zhì)譜條件為:電離方式為電噴霧離子源(ESI)正離子模式，噴霧電壓3kV，椎孔電壓42V，離子源為450°C，霧化氣流速650L/Hr，輔助氣流量50L/Hr，碰撞能量38V，0.2秒內(nèi)的質(zhì)量掃描范圍為 m/z100-1000。
[0019]上述步驟(4)中制備型液相色譜色譜柱為:C18柱，流動相為乙腈-水體系，乙腈在流動相中的比例為0-20min: 15-32%, 20-40min:32%，檢測波長203nm。
[0020]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)益性和顯著優(yōu)點在于:
[0021](I)采用工業(yè)乙醇提取，減少了太子參中糖類、苷類等大極性物質(zhì)的溶出，促進了環(huán)肽類成分的溶出，提取率高，且毒性低。
[0022](2)采用乙醇熱回流溶解對提取浸膏進行前處理，可快速除掉大部分糖類、苷類等大極性物質(zhì)，與傳統(tǒng)有機溶劑萃取相比，具有操作簡單、溶劑用量少、穩(wěn)定性好等優(yōu)點。
[0023](3)用制備型HPLC分離前，先用硅膠柱層析方法對太子參環(huán)肽進行富集，可除掉大部分雜質(zhì)，避免干擾，使上樣量得到很大提高，并減少對色譜柱的污染。
[0024](4)將HPLC-MS連用技術(shù)與制備型HPLC相結(jié)合，實現(xiàn)了太子參環(huán)肽B的快速識別和高通量快速制備，大大簡化了物質(zhì)分離純化步驟，快速、高效，適合工業(yè)化生產(chǎn)。
【專利附圖】

【附圖說明】:
[0025]圖1為太子參環(huán)肽B制備工藝流程圖；[0026]圖2為太子參環(huán)肽B化學結(jié)構(gòu)；
[0027]圖3為硅膠富集得到太子參環(huán)肽B粗品的HPLC液相色譜圖(A)和HPLC-MS總離子流圖(B)。
【具體實施方式】:
[0028]下面結(jié)合附圖，用本發(fā)明的具體實例來進一步闡述本發(fā)明的實質(zhì)性內(nèi)容，但是本發(fā)明的保護范圍并不限于這些實例，根據(jù)本發(fā)明的實質(zhì)對本發(fā)明進行的改進都屬于本發(fā)明的范圍。
[0029]實施例1:
[0030](I)取太子參藥材原料500g，粉碎至粒徑60目后，加入6倍體積的95%工業(yè)乙醇后，于80°C進行熱回流提取，提取時間3h，提取后將提取液抽濾出來，再重復以上過程2次，合并三次提取液，減壓濃縮至比重1.15，得到乙醇浸膏65.00g，太子參環(huán)肽B的含量為
0.23%。向浸膏中加入10倍體積的95%工業(yè)乙醇熱回流溶解2h，冷卻靜置10h，過濾，收集濾液，濃縮回收溶劑得到太子參總環(huán)肽提取物16.50g，太子參環(huán)肽B的含量為0.86%，富集率為 93.09%ο
[0031](2)硅膠柱層析富集太子參環(huán)肽B:上述太子參總環(huán)肽提取物用少量甲醇溶解后與等量100-200目硅膠拌樣，揮干溶劑后，稱取30倍量200-300目硅膠，濕法裝柱，徑高比(1:9)，干法上樣，用氯仿-甲醇梯度洗脫:25:1 (9BV),10:1 (10BV)收集洗脫液，每1/2BV收集一份，TLC檢測環(huán)肽，合并所有含環(huán)肽部分，回收溶劑干燥得到太子環(huán)肽B粗品1.15g，HPLC, HPLC-MS分析檢測，太子參環(huán)肽B含量為11.12%，富集率為83.14%。
[0032](3)制備型高效液相色譜分離純化太子參環(huán)肽B:色譜柱為SunFierprep C18 (5 μ m, 19mm X 250mm),流動相為乙腈-水體系，乙腈在流動相中的比例為15%(Omin) -32%(20min) -32%(40min);流速:10ml/min ;檢測波長:203nm，收集太子參環(huán)肽 B色譜峰流出液，減壓回收溶劑得到太子參環(huán)肽B116mg，純度在98%以上，富集率為91.07%。
[0033]實施例2:
[0034](I)取太子參藥材原料500g，粉碎至粒徑80目后，加入5倍體積95%工業(yè)乙醇后，于85°C進行熱回流提取，提取時間3h，提取后將提取液抽濾出來，再重復以上過程2次，合并三次提取液，減壓濃縮至比重1.2，得到乙醇浸膏64.50g，太子參環(huán)肽B的含量為0.24%。向浸膏中加入9倍體積95%工業(yè)乙醇熱回流溶解2h，冷卻靜置10h，過濾，收集濾液，濃縮回收溶劑得到太子參總環(huán)肽提取物17.50g，太子參環(huán)肽B的含量為0.84%，富集率為93.44%。
[0035](2)硅膠柱層析富集太子參環(huán)肽B:上述太子參總環(huán)肽提取物用少量甲醇溶解后與等量100-200目硅膠拌樣，揮干溶劑后，稱取25倍量200-300目硅膠，濕法裝柱，徑高比(1:8)，干法上樣，用氯仿-甲醇梯度洗脫:30:1 (9BV),9:1 (10BV)收集洗脫液，每1/2BV收集一份，TLC檢測環(huán)肽，合并所有含環(huán)肽部分，回收溶劑干燥得到太子環(huán)肽B粗品1.08g，HPLC, HPLC-MS分析檢測，太子參環(huán)肽B含量為10.05%,富集率為75.93%。
[0036] (3)制備型高效液相色譜分離純化太子參環(huán)肽B:色譜柱為SunFierprep C18 (5 μ m, 19mm X 250mm),流動相為乙腈-水體系，乙腈在流動相中的比例為15%(Omin) -32%(20min) -32%(40min);流速:10ml/min ;檢測波長:203nm，收集太子參環(huán)肽 B色譜峰流出液，減壓回收溶劑得到太子參環(huán)肽B99mg，純度在98%以上，富集率為92.01%。[0037]實施例3:
[0038](I)取太子參藥材原料500g，粉碎至粒徑40目后，加入7倍體積95%工業(yè)乙醇后，于85°C進行熱回流提取，提取時間3h，提取后將提取液抽濾出來，再重復以上過程2次，合并三次提取液，減壓濃縮至比重1.15，得到乙醇浸膏66.00g，太子參環(huán)肽B的含量為0.23%。向浸膏中加入11倍體積95%工業(yè)乙醇熱回流溶解1.5h，冷卻靜置12h，過濾，收集濾液，濃縮回收溶劑得到太子參總環(huán)肽提取物17.00g，太子參環(huán)肽B的含量為0.83%，富集率為93.25%。
[0039](2)硅膠柱層析富集太子參環(huán)肽B:上述太子參總環(huán)肽提取物用少量甲醇溶解后與等量100-200目硅膠拌樣，揮干溶劑后，稱取25倍量200-300目硅膠，濕法裝柱，徑高比(1:8)，干法上樣，用氯仿-甲醇梯度洗脫:30:1 (10BV),9:1 (10BV)收集洗脫液，每1/2BV收集一份，TLC檢測環(huán)肽，合并所有含環(huán)肽部分，回收溶劑干燥得到太子環(huán)肽B粗品1.05g，HPLC, HPLC-MS分析檢測，太子參環(huán)肽B含量為10.78%，富集率為76.43%。
[0040](3)制備型高效液相色譜分離純化太子參環(huán)肽B:色譜柱為SunFierprep C18 (5 μ m, 19mm X 250mm),流動相為乙腈-水體系，乙腈在流動相中的比例為15%(Omin) -32 %(20min) -32%(40min);流速:10ml/min ;檢測波長:203nm，收集太子參環(huán)肽 B色譜峰流出液，減壓回收溶劑得到太子參環(huán)肽B107mg，純度在98%以上，富集率為89.54%。
[0041]實施例4:
[0042](I)取太子參藥材原料4kg，粉碎至粒徑60目后，加入6倍體積95%工業(yè)乙醇后，于85°C進行熱回流提取，提取時間3h，提取后將提取液抽濾出來，再重復以上過程2次，合并三次提取液，減壓濃縮至比重1.2，得到乙醇浸膏544.00g，太子參環(huán)肽B的含量為0.22%。向浸膏中加入10倍體積95%工業(yè)乙醇熱回流溶解2h，冷卻靜置10h，過濾，收集濾液，濃縮回收溶劑得到太子參總環(huán)肽提取物139.40g，太子參環(huán)肽B的含量為0.83%，富集率為94.83%。
[0043](2)硅膠柱層析富集太子參環(huán)肽B:上述太子參總環(huán)肽提取物用少量甲醇溶解后與等量100-200目硅膠拌樣，揮干溶劑后，稱取30倍量200-300目硅膠，濕法裝柱，徑高比(1:10)，干法上樣，用氯仿-甲醇梯度洗脫:30:1(1(?￥)，10:1(1(?￥)收集洗脫液，每1/28￥收集一份，TLC檢測環(huán)肽，合并所有含環(huán)肽部分，回收溶劑干燥得到太子環(huán)肽B粗品8.80g,HPLC, HPLC-MS分析檢測，太子參環(huán)肽B含量為9.06%,富集率為68.89%。
[0044](3)制備型高效液相色譜分離純化太子參環(huán)肽B:色譜柱為SunFierprep C18 (5 μ m, 19mm X 250mm),流動相為乙腈-水體系，乙腈在流動相中的比例為15%(Omin) -32%(20min) -32%(40min);流速:10ml/min ;檢測波長:203nm，收集太子參環(huán)肽 B色譜峰流出液，減壓回收溶劑得到太子參環(huán)肽B717mg，純度在98%以上，富集率為90.35%。
【權(quán)利要求】
1.太子參環(huán)肽B標準品的制備方法，包括以下步驟: (1)提取:太子參藥材曬干，粉碎至粒徑20-80目，加入太子參藥材4-10倍體積的95%工業(yè)乙醇進行熱回流提取，合并提取液、濃縮至比重為1.1-1.2的浸膏； (2)前處理:向浸膏中加入5-15倍體積的95%工業(yè)乙醇熱回流溶解l-3h，冷卻靜置8_24h，過濾濃縮濾液，得到太子參環(huán)肽總提物； (3)富集:將上述太子參環(huán)肽總提物用少量甲醇溶解，拌入拌樣用柱層析硅膠，干燥，加載于分離用層析硅膠柱床頂端，用氯仿-甲醇溶劑梯度洗脫，收集流出液，TLC檢測環(huán)肽成分，合并所有環(huán)肽部分，回收溶劑，干燥得到太子參環(huán)肽B粗品，HPLC-MS分析，快速鎖定目標產(chǎn)物； (4)分離純化:取上述富集產(chǎn)物，甲醇溶解過濾，用制備型高效液相色譜進行跟蹤分離純化，流動相為乙腈-水溶液，根據(jù)HPLC-MS分析結(jié)果，收集太子參環(huán)肽B色譜峰流出液，回收溶劑，干燥得到純度98%以上的太子參環(huán)肽B純品。
2.按照權(quán)利要求1所述的太子參環(huán)肽B標準品的制備方法，其特征在于所述的步驟(1)中太子參為石竹科植物孩兒參Pseudostellaria heterophylla (Miq.) Pax ex Pax etHoffm.的干燥塊根。
3.按照權(quán)利要求1所述的太子參環(huán)肽B標準品的制備方法，其特征在于所述的步驟(I)中熱回流提取所用溶劑為原料4-10倍體積的95%工業(yè)乙醇，提取時間2-4h，溫度75-85°C，每次過濾后將殘渣重復提取過程2-3次，合并提取液，減壓濃縮至比重1.1-1.2。
4.按照權(quán)利要求1所述的太子參環(huán)肽B標準品的制備方法，其特征在于所述的步驟(2)中前處理所用溶劑為浸膏5-15倍體積的95%工業(yè)乙醇，熱回流溶解時間為l_3h，溫度75-85°C，冷卻靜置時間為8-24h。
5.按照權(quán)利要求1所述的太子參環(huán)肽B標準品的制備方法，其特征在于所述的步驟(3)中富集目標產(chǎn)物所用層析柱為硅膠柱，裝柱方法為濕法裝住，所用裝柱硅膠為200-300目柱層析硅膠，用量為太子參環(huán)肽總提物的15-40倍重量，上樣方法為干法上樣，拌樣用硅膠為100-200目柱層析硅膠，用量為太子參環(huán)肽總提物的1-1.5倍重量，洗脫溶劑為氯仿-甲醇溶劑梯度洗脫:20-40:1 (6-14BV)，6-12:1 (6-14BV)。
6.按照權(quán)利要求1所述的太子參環(huán)肽B標準品的制備方法，其特征在于所述的步驟(3)中TLC檢測環(huán)肽所用薄層板為硅膠G板，樣品點于硅膠G板上，用8:2-9:1的氯仿-甲醇展開，揮掉溶劑后，在100-120°C用4-8N HCl溶液水解30_60min后，再噴灑2%_5%茚三酮乙醇溶液顯色劑，加熱后顯桔黃色至橙紅色斑點。
7.按照權(quán)利要求1所述的太子參環(huán)肽B標準品的制備方法，其特征在于所述的步驟(3)中HPLC-MS分析方法:HPLC色譜條件為:色譜柱:C18柱，柱溫:室溫，流動相:乙腈-/K，乙腈在流動相中的比例為:0-20min,20%-32% ；20-40min, 32% ；40-50min, 32%-45%,流速:l.0ml/min,檢測:DAD檢測器,檢測波長:203nm ;質(zhì)譜條件為:電離方式為電噴霧離子源正離子模式，噴霧電壓3kV，椎孔電壓42V，離子源為450°C，霧化氣流速650L/Hr，輔助氣流量50L/Hr，碰撞能量38V，0.2秒內(nèi)的質(zhì)量掃描范圍為m/z100-1000。
8.按照權(quán)利要求1所述的太子參環(huán)肽B標準品的制備方法，其特征在于所述的步驟(4)中制備型高效液相色譜分離純化所用色譜柱為:C18柱，流動相為乙腈-水體系，乙腈在流動相中的比例為0-20min: 15-32%, 20-40min:32%，檢測波長203nm。
【文檔編號】C07K1/16GK103923191SQ201410174961
【公開日】2014年7月16日 申請日期:2014年4月28日 優(yōu)先權(quán)日:2014年4月28日
【發(fā)明者】譚寧華, 趙麗梅, 宋衛(wèi)武 申請人:中國科學院昆明植物研究所