一種利用熒光探針檢測dna單核苷酸多態(tài)性的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種DNA單核苷酸多態(tài)性的檢測方法。本發(fā)明提供的方法是用熒光物質(zhì)標(biāo)記待測樣本的DNA，通過所述熒光物質(zhì)與水溶性共軛聚合物熒光共振能量轉(zhuǎn)移情況確定所述待測DNA的目標(biāo)單核苷酸多態(tài)位點的核苷酸。本發(fā)明處理簡便，省略了各種分離、純化步驟，利用少量DNA就能夠檢測到單核苷酸多態(tài)位點的核苷酸。
【專利說明】—種利用熒光探針檢測DNA單核苷酸多態(tài)性的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種檢測DNA單核苷酸多態(tài)性的方法，特別涉及一種利用熒光探針檢測DNA單核苷酸多態(tài)性的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism, SNP)，主要是指在基因組水平上由單個核苷酸的變異所引起的DNA序列多態(tài)性。SNP所表現(xiàn)的多態(tài)性只涉及到單個堿基的變異，SNP既可能是二等位多態(tài)性，也可能是3個或4個等位多態(tài)性，但實際上，后兩者非常少見，幾乎可以忽略。因此，通常所說的SNP都是二等位多態(tài)性的。
[0003]單核苷酸多態(tài)性是人類可遺傳的變異中最常見的一種，有90%都可歸因于SNP所引起的基因變異。在人基因組中，每隔100至300個堿基就會存在一處SNP。基因組DNA中單核苷酸多態(tài)性的分析和測定可用來繪制基因圖譜、進(jìn)行基因聯(lián)合研究等。
[0004]單核苷酸多態(tài)性是第三代遺傳診斷標(biāo)記，近幾年被廣泛應(yīng)用于生物以及醫(yī)學(xué)研究的諸多領(lǐng)域，分析方法常采用電泳分析和固相雜交的方法，如=DNA測序、限制酶切片段長度多態(tài)性分析、單鏈DNA構(gòu)象多態(tài)性分析、異源雙鏈核酸分析、等位基因特異性寡聚核苷酸雜交、錯配酶切分析、寡聚核苷酸連接分析等，但上述方法對樣品處理的要求較高，需要進(jìn)行繁瑣的分離或洗滌的程序，增加了樣品的損失以及檢測的時間。為了避免上訴問題，目前常采用一種均相免疫檢測的方法，該方法基于熒光偏振或小分子熒光染料之間的熒光共振能量轉(zhuǎn)移，但偏振化熒光的強度大大降低，導(dǎo)致了基于熒光偏振的方法靈敏度不高，除此之外，基于熒光共振能量轉(zhuǎn)移的方法均要對探針分子進(jìn)行雙修飾，導(dǎo)致成本很高。因此，設(shè)計出一種更為靈敏、有效的單核苷酸多態(tài)性檢測方法是極為迫切的。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是提供一種克服上述缺點，高效、靈敏、簡便、快速、無需分離的利用熒光探針檢測DNA單核苷酸多態(tài)性的方法。
[0006]實現(xiàn)本發(fā)明目的的技術(shù)方案是:一種熒光探針用于DNA單核苷酸多態(tài)性的檢測方法，依次包括以下步驟:
[0007]I)以待測樣本的DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并用熒光物質(zhì)標(biāo)記待測樣本的DNA ；
[0008]2)通過所述熒光物質(zhì)與下述式(I)的化合物熒光共振能量轉(zhuǎn)移情況確定所述待測DNA的目標(biāo)單核苷酸多態(tài)位點的核苷酸；所述熒光物質(zhì)的吸收光譜與所述式(I)的化合物發(fā)射光譜有較好的重疊，光譜重疊積分范圍為8.0X 10_16~5.0X 10_13 M'm3。
【權(quán)利要求】
1.一種熒光探針用于DNA單核苷酸多態(tài)性的檢測方法，其特征在于:依次包括以下步驟: 1)以待測樣本的DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并用熒光物質(zhì)標(biāo)記待測樣本的DNA； 2)通過所述熒光物質(zhì)與下述式(I)的化合物熒光共振能量轉(zhuǎn)移情況確定所述待測DNA的目標(biāo)單核苷酸多態(tài)位點的核苷酸；所述熒光物質(zhì)的吸收光譜與所述式(I)的化合物發(fā)射光譜有較好的重疊，光譜重疊積分范圍為8.0X 10-16~5.0X 1(T13 IVT1CnA

2.如權(quán)利要求1所述的一種熒光探針用于DNA單核苷酸多態(tài)性的檢測方法，其特征在于:所述式(I)中，R為6-三甲胺基己基、6-三乙胺基己基、5-三甲胺基戊基、5-三乙胺基戍基、4-二甲胺基丁基、4-二乙胺基丁基、3-二甲胺基丙基和3-二乙胺基丙基中的任意一種。
3.如權(quán)利要求1所述的一種熒光探針用于DNA單核苷酸多態(tài)性的檢測方法，其特征在于:所述式(I)中，X為氯、溴和碘中的任意一種。
4.如權(quán)利要求1至3中任一所述的一種突光探針用于DNA單核苷酸多態(tài)性的檢測方法，其特征在于:所述用熒光物質(zhì)標(biāo)記步驟I)的DNA的方法為:用熒光物質(zhì)標(biāo)記的dNTP或ddNTP對PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行單堿基延伸；所述dNTP或ddNTP為與所述目標(biāo)單核苷酸多態(tài)位點的核苷酸相鄰的一個核苷酸互補的dNTP或ddNTP。
5.如權(quán)利要求4所述的一種熒光探針用于DNA單核苷酸多態(tài)性的檢測方法，其特征在于:所述單堿基延伸中，所用的引物有兩種:野生型特異性引物和突變型特異性引物；所述野生型特異性引物的末端核苷酸與所述目標(biāo)單核苷酸多態(tài)位點的野生型核苷酸互補；所述突變型特異性引物的末端核苷酸與所述目標(biāo)單核苷酸多態(tài)位點的突變型核苷酸互補；所述引物能與目標(biāo)單核苷酸多態(tài)位點相鄰20-25bp的序列互補。
6.如權(quán)利要求5所述的一種熒光探針用于DNA單核苷酸多態(tài)性的檢測方法，其特征在于:確定所述待測DNA的目標(biāo)單核苷酸多態(tài)位點核苷酸的方法為:若只在使用野生型特異性引物時出現(xiàn)熒光共振能量轉(zhuǎn)移，則所述待測DNA的目標(biāo)單核苷酸多態(tài)位點的核苷酸為野生純合型；若只在使用突變型特異性引物時出現(xiàn)熒光共振能量轉(zhuǎn)移，則所述待測DNA的目標(biāo)單核苷酸多態(tài)位點的核苷酸為突變純合型；若使用兩種引物都出現(xiàn)熒光共振能量轉(zhuǎn)移，則所述待測DNA的目標(biāo)單核苷酸多態(tài)位點的核苷酸為雜合型。
7.如權(quán)利要求1至3中任一所述的一種突光探針用于DNA單核苷酸多態(tài)性的檢測方法，其特征在于:所述用熒光物質(zhì)標(biāo)記步驟I)的DNA的方法為:用熒光物質(zhì)A標(biāo)記與所述目標(biāo)單核苷酸多態(tài)位點的野生型核苷酸互補的dNTP或ddNTP，用熒光物質(zhì)B標(biāo)記與所述目標(biāo)單核苷酸多態(tài)位點的突變型核苷酸的互補dNTP或ddNTP，用所述熒光物質(zhì)A標(biāo)記的dNTP或ddNTP和熒光物質(zhì)B標(biāo)記的dNTP或ddNTP同時對PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行單堿基延伸；在同一激發(fā)光的作用下，所述熒光物質(zhì)A和所述熒光物質(zhì)B產(chǎn)生的熒光的波長至少相差50nm。
8.如權(quán)利要求7所述的一種熒光探針用于DNA單核苷酸多態(tài)性的檢測方法，其特征在于:所述單堿基延伸中，所用的引物能與所述目標(biāo)單核苷酸多態(tài)位點相鄰(上游或下游)20-25bp的序列互補。
9.如權(quán)利要求8所述的一種熒光探針用于DNA單核苷酸多態(tài)性的檢測方法，其特征在于:確定所述待測DNA的目標(biāo)單核苷酸多態(tài)位點核苷酸的方法為:若單獨出現(xiàn)PCP到熒光物質(zhì)A的熒光共振能量轉(zhuǎn)移，則所述待測DNA的目標(biāo)單核苷酸多態(tài)位點的核苷酸為野生純合型；若單獨出現(xiàn)PCP到熒光物質(zhì)B的熒光共振能量轉(zhuǎn)移，則所述待測DNA的目標(biāo)單核苷酸多態(tài)位點的核苷酸為突變純合型；若兩種熒光共振能量轉(zhuǎn)移都出現(xiàn)，則所述待測DNA的目標(biāo)單核苷酸多態(tài)位點的核苷酸為雜合型。
10.如權(quán)利要 求6中任一所述的一種突光探針用于DNA單核苷酸多態(tài)性的檢測方法,其特征在于:所述熒光物質(zhì)為熒光素、羅丹明、溴乙啶、Cy3或Cy5。
【文檔編號】C12Q1/68GK104031979SQ201310071889
【公開日】2014年9月10日 申請日期:2013年3月6日 優(yōu)先權(quán)日:2013年3月6日
【發(fā)明者】王樹 申請人:常州欣宏科生物化學(xué)有限公司