專利名稱：一株石油降解菌及其在三元采油污水處理中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于石油微生物領(lǐng)域，具體涉及一株能夠在高度復(fù)雜的三元采油污水環(huán)境中以原油為唯一碳源生長(zhǎng)的石油降解菌株以及其在三元采油污水處理中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
“堿-表面活性劑-聚合物”三元復(fù)合驅(qū)(ASP)是繼聚合物驅(qū)后的又一項(xiàng)提高原油采收率的新技術(shù)。與聚合物驅(qū)相比，它在擴(kuò)大波及體積的基礎(chǔ)上，能夠進(jìn)一步提高洗油效率。大慶油田在二十世紀(jì)九十年代完成的5個(gè)三元復(fù)合驅(qū)先導(dǎo)性礦場(chǎng)試驗(yàn)結(jié)果已表明，三元復(fù)合驅(qū)可比水驅(qū)提高采收率20%以上，該項(xiàng)技術(shù)已逐漸成為油田可持續(xù)發(fā)展的關(guān)鍵技術(shù)
之一 O截至目前，我國(guó)已經(jīng)有很多復(fù)合驅(qū)油項(xiàng)目，分布于大慶、勝利、新疆、吉林、遼河、河南、江漢和大港等油田。復(fù)合驅(qū)已經(jīng)大規(guī)模應(yīng)用，而且一些沒(méi)有注聚合物的區(qū)塊也已經(jīng)檢測(cè)到聚合物，但與其相匹配的采出水處理工藝卻明顯滯后。三元復(fù)合驅(qū)的采出污水的組分十分復(fù)雜，水中含有大量的聚合物、表面活性劑和堿等化學(xué)藥劑。油在水中形成0/W型乳化油，表面覆蓋一層帶負(fù)電荷的雙電層，體系十分穩(wěn)定，不易上浮到水面，特別是堿的加入使得污水的PH值高達(dá)10以上，造成常規(guī)水處理藥劑失效。另外，聚合物的存在使得采出水粘度增加，采出水中膠態(tài)物質(zhì)更加穩(wěn)定，油珠上浮的阻力增大，且相互之間碰撞、聚并機(jī)會(huì)減少，給油水分離帶來(lái)很大困難。目前復(fù)合驅(qū)污水主要采用“絮凝+沉降+過(guò)濾”的處理工藝，已不能適應(yīng)復(fù)合驅(qū)采出水的水質(zhì)狀況，因此，開(kāi)發(fā)一種高效的復(fù)合物驅(qū)采出水處理工藝和配套設(shè)備是我國(guó)油田開(kāi)發(fā)面臨的一個(gè)重要挑戰(zhàn)。在采出水處理工藝中，微生物處理技術(shù)因其具有成本低、操作簡(jiǎn)便、無(wú)二次污染、治理徹底等優(yōu)勢(shì)而越來(lái)越受到廣泛的重視。微生物處理技術(shù)的核心就是獲得適宜的菌種，但是由于三元復(fù)合驅(qū)采出水組分復(fù)雜，尤其是其高濃度的聚合物和高PH值環(huán)境對(duì)微生物具有極強(qiáng)的毒性作用，因而能夠耐受三元復(fù)合驅(qū)采出水復(fù)雜環(huán)境的石油降解菌株沿不多見(jiàn)。這也是開(kāi)發(fā)利用微生物技術(shù)處理三元采出污水工藝的最大障礙。因此，獲得具有能在高濃度聚合物和高PH值環(huán)境中生長(zhǎng)的石油降解菌株對(duì)于三元污水處理技術(shù)具有重要意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目是為了解決目前缺少可應(yīng)用到三元采油污水處理技術(shù)中的微生物菌種的問(wèn)題，而提供一株石油降解菌及其在三元采油污水處理中的應(yīng)用。本發(fā)明的石油降解菌為假單胞菌sp. )JNS01,保藏在中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號(hào)為CCTCC NO M 2012021。所述的假單胞菌JNSOl在三元采油污水處理中的應(yīng)用。該假單胞菌JNSOl來(lái)源于大慶油田采油廠的采出水，經(jīng)富集培養(yǎng)、分離得到。該菌株的菌落呈亮白色、圓形、邊緣整齊、光滑濕潤(rùn)，為革蘭氏陰性，桿狀。本發(fā)明的石油降解菌，它為假單胞菌(/^訊/o麗瓜as sp. )JNS01，其16S rDNA基因
3序列參照《Bergey’ s Mannual of Systematic Bacteriology)) Vol. VtO 內(nèi)容,根據(jù)其生理生化特征和16S rDNA基因序列，通過(guò)NCBI BLASTn程序比對(duì)，本發(fā)明假單胞菌JNSOl與Pseudomonas aeruginosa S25的16S rDNA基因序列同源為99%,因此鑒定本發(fā)明的菌株為假單胞菌屬的一個(gè)新菌種。本發(fā)明的假單胞菌JNSOl能夠在含有高濃度聚合物的高堿性無(wú)機(jī)鹽富集培養(yǎng)基中利用石油為唯一碳源生長(zhǎng)。所述的富集培養(yǎng)基的配方為每IOOOml去離子水中含有 K2HPO4 · 3H20 5. 2g, KH2PO4 3. 7g, Na2SO4 I. 0g, MgSO4 · 7H20 0. 2g, NH4Cl 2. 0g，微量金屬鹽溶液Iml ;所述的微量金屬鹽溶液配方為1000ml去離子水中含有FeCl2 · 4H20 0. 3g，CoCl2 · 6H20 0. 038g, MnCl2 · 4H20 0. 02g, ZnCl2 0. 014g, H3BO3 0. 0124g, Na2MoO4 · 2H20 0. 04g，CuCl2 · 2H20 0. 0034 g。該富集培養(yǎng)基中加入的唯一碳源是石油，其濃度為2 g/L。本發(fā)明的假單胞菌JNS01的培養(yǎng)溫度優(yōu)選為30°C，培養(yǎng)搖床轉(zhuǎn)速優(yōu)選為200rpm。本發(fā)明的假單胞菌JNS01能夠在濃度高達(dá)1800mg/L、pH值為10. 5的聚丙烯酰胺堿性溶液中生長(zhǎng)良好。以往報(bào)道的石油降解菌株在這種高濃度聚丙烯酰胺的堿性環(huán)境下很難存活，并且達(dá)不到降解石油的效果。本發(fā)明的假單胞菌JNS01與現(xiàn)有的石油降解菌株相比，同時(shí)具有耐受高濃度聚丙烯酰胺和高濃度堿的優(yōu)點(diǎn)，對(duì)于石油降解菌株在三元采油污水處理的實(shí)際應(yīng)用中更具優(yōu)勢(shì)。本發(fā)明假單胞菌sp. ) JNS01屬于假單胞菌屬保藏在中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏地址為中國(guó).武漢.武漢大學(xué)，保藏日期為2012年2月 16 日，保藏號(hào)為 CCTCC NO M 2012021。本發(fā)明的假單胞菌JNS01能夠以石油為唯一碳源生長(zhǎng)，并將其礦化為CO2和H20。在純培養(yǎng)條件下，本發(fā)明假單胞菌JNS01能夠在24h內(nèi)將無(wú)機(jī)鹽富集培養(yǎng)基中含量為2g/L的石油降解95%以上，菌液的OD62tl值可由0. I增加到0. 8。將單胞菌JNS01實(shí)際應(yīng)用于三元復(fù)合驅(qū)采出液的處理技術(shù)中，通過(guò)測(cè)定可知，經(jīng)過(guò)假單胞菌JNS01處理后的采出液中的原油含量可降低至25mg/L，降解率可達(dá)到92%。
具體實(shí)施例方式具體實(shí)施方式
一本實(shí)施方式提供一株石油降解菌，該菌株為假單胞菌{Pseudomonas sp. ) JNSOI，保藏在中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號(hào)為CCTCC NO M2012021。該菌株的菌落呈亮白色、圓形、邊緣整齊、光滑濕潤(rùn)，為革蘭氏陰性，桿狀。本實(shí)施方式的假單胞菌JNS01來(lái)源于大慶油田采油廠的采出水，經(jīng)富集培養(yǎng)、分離得到。具體步驟如下將采集到的大慶油田采油廠采出水加入到無(wú)機(jī)鹽富集培養(yǎng)基中，并加入2g/L原油進(jìn)行富集培養(yǎng)，培養(yǎng)10天后開(kāi)始傳代培養(yǎng)，培養(yǎng)條件同上，每三天轉(zhuǎn)接一次，轉(zhuǎn)接10次后將培養(yǎng)液適當(dāng)稀釋后用LB固體平板培養(yǎng)基培養(yǎng)，篩選能夠生長(zhǎng)的菌株，選取生長(zhǎng)最快的一株菌轉(zhuǎn)接到無(wú)機(jī)鹽液體培養(yǎng)基中，并加入2g/L的石油培養(yǎng)。所述的富集培養(yǎng)基的配方為每 1000ml 去離子水中含有 K2HPO4 · 3H20 5. 2g，KH2PO4 3. 7g，Na2SO4 I. 0g,MgSO4 ·7Η20 0. 2g, NH4Cl 2. 0g，微量金屬鹽溶液Iml ;所述的微量金屬鹽溶液配方為1000ml去離子水中含有 FeCl2 ·4Η20 0. 3g，CoCl2 ·6Η20 0. 038g，MnCl2 · 4Η20 0. 02g, ZnCl2 0. 014g,H3BO3 0. 0124g，Na2MoO4 ·2Η20 0. 04 g，CuCl2 ·2Η20 0. 0034 g。該富集培養(yǎng)基中加入的唯一碳源是石油。所述的LB固體平板培養(yǎng)基的配方為每1000ml去離子水中含有酵母膏5g、
4蛋白胨5g、NaCl 10g、瓊脂粉20g，用NaOH溶液調(diào)pH值為7. O0將上述菌株進(jìn)行16S rDNA基因提取并測(cè)序，其基因序列長(zhǎng)度為1452 bp，核苷酸序列如SEQ ID N0:1所示。該菌株的16S rDNA基因序列參照《Bergey’ s Mannual ofSystematic Bacteriology》Vol. VII[內(nèi)容,根據(jù)其生理生化特征和16S rDNA基因序列，通過(guò) NCBI BLASTn 程序比對(duì),本發(fā)明假單胞菌 JNSOl 與 Pseudomonas aeruginosa S25 的 16SrDNA基因序列同源為99%，因此鑒定本發(fā)明的菌株為假單胞菌屬的一個(gè)新菌種，并將其命名為假單胞菌 iPseudomorms sp. ) JNSOl。本實(shí)施方式的假單胞菌JNSOl的培養(yǎng)溫度優(yōu)選為30°C，培養(yǎng)搖床轉(zhuǎn)速優(yōu)選為200rpm。本實(shí)施方式的假單胞菌JNSOl能夠在濃度高達(dá)1800mg/L、pH值為10. 5的聚丙烯酰胺堿性溶液中生長(zhǎng)良好。以往報(bào)道的石油降解菌株在這種高濃度聚丙烯酰胺的堿性環(huán)境下很難存活，并且達(dá)不到降解石油的效果。本實(shí)施方式的假單胞菌JNSOl與現(xiàn)有的石油降解菌株相比，同時(shí)具有耐受高濃度聚丙烯酰胺和高濃度堿的優(yōu)點(diǎn)，對(duì)于石油降解菌株在三元采油污水處理的實(shí)際應(yīng)用中更具優(yōu)勢(shì)。本實(shí)施方式的假單胞菌JNSOl能夠以石油為唯一碳源生長(zhǎng)，并將其礦化為CO2和H2O0在純培養(yǎng)條件下，本發(fā)明假單胞菌JNSOl能夠在24h內(nèi)將無(wú)機(jī)鹽富集培養(yǎng)基中含量為2g/L的石油降解95%以上，菌液的OD62tl值可由O. I增加到O. 8。將單胞菌JNSOl實(shí)際應(yīng)用于三元復(fù)合驅(qū)采出液的處理技術(shù)中，通過(guò)測(cè)定可知，經(jīng)過(guò)假單胞菌JNSOl處理后的采出液中的原油含量可降低至25mg/L，降解率可達(dá)到92%。本實(shí)施方式的假單胞菌iPsoudomorms sp. ) JNSOl屬于假單胞菌屬(.Pseudomonas )，保藏在中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心,保藏地址為中國(guó).武漢.武漢大學(xué),保藏日期為2012年2月16日，保藏號(hào)為CCTCC NO M 2012021。
具體實(shí)施方式
二 本實(shí)施方式將假單胞菌JNSOl應(yīng)用于三元復(fù)合驅(qū)采出液的處理
實(shí)驗(yàn)樣品大慶油田采油三廠某聚驅(qū)單井采出液，其表面活性劑濃度為335mg/L，聚合物濃度為1800mg/L，總堿為3595mg/L，礦化度為6239mg/L，pH值為10. 5，油含量為570 mg/L ；
實(shí)驗(yàn)方法取200mL采出液，放到500mL三角瓶中，加入細(xì)胞濃度為OD62tl=L 2的假單胞菌JNSOl培養(yǎng)液20mL，30°C培養(yǎng)18h，測(cè)定采出液中原油含量；
實(shí)驗(yàn)結(jié)果通過(guò)測(cè)定發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過(guò)本發(fā)明的假單胞菌JNSOl處理后，采出液中的原油含量為118mg/L，原油降解率為79%。
具體實(shí)施方式
三本實(shí)施方式將假單胞菌JNSOl應(yīng)用于三元復(fù)合驅(qū)采出液的處理
實(shí)驗(yàn)樣品大慶油田采油三廠某聚驅(qū)單井采出液，表面活性劑濃度為465mg/L，聚合物濃度為1363mg/L，總堿為3742mg/L，礦化度5375 mg/L, pH值為8. 46，油含量為412mg/L ；實(shí)驗(yàn)方法取200 mL采出液，放到500mL三角瓶中，加入細(xì)胞濃度為OD62tl=L 2的假單胞菌JNSOl培養(yǎng)液20mL，30°C培養(yǎng)18h，測(cè)定采出液中原油含量；
實(shí)驗(yàn)結(jié)果通過(guò)測(cè)定發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過(guò)本發(fā)明的假單胞菌JNSOl處理后，采出液中的原油含量為97mg/L，原油降解率為79. 1%。
具體實(shí)施方式
四本實(shí)施方式將假單胞菌JNSOl應(yīng)用于三元復(fù)合驅(qū)采出液的處理
實(shí)驗(yàn)樣品大慶油田采油三廠某聚驅(qū)單井采出液，表面活性劑濃度為292mg/L，聚合物濃度為1281mg/L，總堿為2340mg/L，礦化度為5877mg/L，pH值為8. 41，油含量為379 mg/L ；實(shí)驗(yàn)方法取200mL采出液，放到500mL三角瓶中，加入細(xì)胞濃度為OD62tl=L 2的假單胞菌JNSOl培養(yǎng)液20mL，30°C培養(yǎng)18h，測(cè)定采出液中原油含量；
實(shí)驗(yàn)結(jié)果通過(guò)測(cè)定發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過(guò)本發(fā)明的假單胞菌JNSOl處理后，采出液中的原油含量為83mg/L，降解率為78%。
具體實(shí)施方式
五本實(shí)施方式將假單胞菌JNSOl應(yīng)用于三元復(fù)合驅(qū)采出液的處理
實(shí)驗(yàn)樣品大慶油田采油三廠某聚驅(qū)單井采出液，表面活性劑濃度為315mg/L，聚合物濃度為1316mg/L，總堿為2057mg/L，礦化度為5699 mg/L, pH值為8. 69，油含量為4130mg/L ；
實(shí)驗(yàn)方法取200mL采出液，放到500mL三角瓶中，加入細(xì)胞濃度為OD62tl=L 2的假單胞菌JNSOl培養(yǎng)液20mL，30°C培養(yǎng)18h，測(cè)定采出液中原油含量；
實(shí)驗(yàn)結(jié)果通過(guò)測(cè)定發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過(guò)本發(fā)明的假單胞菌JNSOl處理后，采出液中的原油含量為2045mg/L，降解率為50. 5%。
具體實(shí)施方式
六本實(shí)施方式將假單胞菌JNSOl應(yīng)用于三元復(fù)合驅(qū)采出液的處理
實(shí)驗(yàn)樣品大慶油田采油四廠某聚驅(qū)單井采出液，表面活性劑濃度為35mg/L，聚合物濃度為299mg/L，總堿為2575mg/L，礦化度為含油量為6050mg/L，pH值為8. 95，油含量為330mg/L ；
實(shí)驗(yàn)方法取200mL采出液，放到500mL三角瓶中，加入細(xì)胞濃度為OD62tl=L 2的假單胞菌JNSOl培養(yǎng)液20mL，30°C培養(yǎng)27h，測(cè)定采出液中原油含量；
結(jié)果通過(guò)測(cè)定發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過(guò)本發(fā)明的假單胞菌JNSOl處理后，采出液中的原油含量為25mg/L，降解率為92%。
具體實(shí)施方式
七本實(shí)施方式將假單胞菌JNSOl應(yīng)用于三元復(fù)合驅(qū)采出液的處理
實(shí)驗(yàn)樣品大慶油田采油四廠某聚驅(qū)單井采出液，表面活性劑濃度為51mg/L，聚合物濃度為475mg/L，總堿為3011mg/L，礦化度為含油量為6218mg/L，pH值為9. 07，油含量為1520mg/L ；
實(shí)驗(yàn)方法取200mL采出液，放到500mL三角瓶中，加入細(xì)胞濃度為OD62tl=L 2的假單胞菌JNSOl培養(yǎng)液20mL，30°C培養(yǎng)28h，測(cè)定采出液中原油含量；
實(shí)驗(yàn)結(jié)果通過(guò)測(cè)定發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過(guò)本發(fā)明的假單胞菌JNSOl處理后，采出液中的原油含量為335 mg/L,降解率為78. 9%。
具體實(shí)施方式
八本實(shí)施方式將假單胞菌JNSOl應(yīng)用于三元復(fù)合驅(qū)采出液的處理
實(shí)驗(yàn)樣品大慶油田采油四廠某聚驅(qū)單井采出液，表面活性劑濃度為37mg/L，聚合物濃度為539mg/L，總堿為2877mg/L，礦化度為含油量為5799mg/L，pH值為9. 13，油含量為
6420mg/L ；
實(shí)驗(yàn)方法取200 mL采出液，放到500mL三角瓶中，加入細(xì)胞濃度為OD62tl=L 2的假單胞菌JNSOl培養(yǎng)液20mL，30°C培養(yǎng)18h，測(cè)定采出液中原油含量；
實(shí)驗(yàn)結(jié)果通過(guò)測(cè)定發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過(guò)本發(fā)明的假單胞菌JNSOl處理后，采出液中的原油含量為51mg/L,降解率為87. 8%。
權(quán)利要求
1.一株石油降解菌,該菌株為假單胞菌sp. ) JNS01,保藏在中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號(hào)為CCTCC NO M 2012021。
2.如權(quán)利要求I所述的石油降解菌在三元采油污水處理中的應(yīng)用。
全文摘要
一株石油降解菌及其在三元采油污水處理中的應(yīng)用。屬于石油微生物領(lǐng)域。它解決了目前缺少可應(yīng)用到三元采油污水處理技術(shù)中的微生物菌種的問(wèn)題。本發(fā)明石油降解菌為假單胞菌(Pseudomonassp.)JNS01，保藏在中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號(hào)為CCTCCNOM2012021。本發(fā)明假單胞菌JNS01能夠在濃度高達(dá)1800mg/L、pH值為10.5的聚丙烯酰胺堿性溶液中生長(zhǎng)良好，經(jīng)過(guò)假單胞菌JNS01處理后的采出液中的原油含量可降低至25mg/L，降解率可達(dá)到92%。
文檔編號(hào)C12N1/20GK102911892SQ201210138258
公開(kāi)日2013年2月6日 申請(qǐng)日期2012年5月7日 優(yōu)先權(quán)日2012年5月7日
發(fā)明者蔣立民, 蓋忠輝 申請(qǐng)人:黑龍江吉納森生物工程股份有限公司