專(zhuān)利名稱(chēng)：梅毒螺旋體tpn47基因fq-pcr檢測(cè)試劑盒及其制備的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種試劑盒，尤其是涉及一種梅毒螺旋體TPN47基因FQ-PCR檢測(cè)試劑盒及其制備方法。
背景技術(shù)：
梅毒(Syphilis)是一種由梅毒螺旋體(Treponema pallidum, TP)引起的性傳播疾病，其病原體是梅毒螺旋體，屬螺旋體科。梅毒螺旋體主要通過(guò)性接觸、輸血、創(chuàng)口或者胎盤(pán)等途徑傳播。梅毒螺旋體從感染區(qū)附近的淋巴結(jié)進(jìn)入血液播散全身，使機(jī)體幾乎所有的組織及器官受累，臨床表現(xiàn)為全身性的，可分為不同臨床階段，包括一期、二期、三期和潛伏期。世界衛(wèi)生組織(WHO)曾樂(lè)觀(guān)地預(yù)言([1]WH0. Global prevalence andincidence of selected curable sexually transmitted infections:Overview andestimates [J] · Geneva: WHO, WH0/HIV/AIDS, 2001:1-30.):“ 由于有高靈敏度檢測(cè)方法和高效的治療方案，梅毒是一種能夠通過(guò)公共衛(wèi)生措施得到成功控制的性傳播性疾病”。遺憾的是，由于至今仍然缺乏高靈敏的檢測(cè)方法和高效的治療方案，梅毒依然是嚴(yán)重危害人類(lèi)健康的全世界范圍的公共衛(wèi)生問(wèn)題。中國(guó)疾病控制中心的官方數(shù)據(jù)顯示2010年我國(guó)梅毒(Syphilis)的發(fā)病數(shù)為375309例，比2009年同期增長(zhǎng)24. 50%。報(bào)告發(fā)病數(shù)僅次于病毒性肝炎和肺結(jié)核居第三位，居于性傳播疾病首位(中國(guó)疾控中心http://www.chinacdc. net. cn)。近年來(lái),有關(guān)梅毒與艾滋病之間存在著互相促進(jìn)的研究結(jié)果([2]Buchacz, K. , Klausner, J. D. , Kerndt, P. R. , et al. McElroy, P. D. and Schwendemann, J. HIVincidence among men diagnosed with early syphilis in Atlanta, San Francisco, andLos Angeles, 2004to 2005[J] · Jaids-J Acq Tmm Def,2008, 47(2):234-240. [3]Ghanem, K.G. , Erbelding, E. J. , Wiener, Z. S. , et al. Serological response to syphilis treatmentin HIV-positive and HIV-negative patients attending sexually transmitteddiseases clinics [J]. Sex Transm Infect, 2007，83 (2) :97-101.),使得梅毒的控制越發(fā)困難而且重要。無(wú)疑，人們對(duì)梅毒的防控過(guò)于樂(lè)觀(guān)，對(duì)梅毒的認(rèn)識(shí)遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠。盡管青霉素成功應(yīng)用于治療各期梅毒已經(jīng)有50年歷史，但治療失敗可見(jiàn)于任何一種被推薦的治療方案。林麗蓉等([4]林麗蓉，楊波，潘錫濤，等.潛在的血源傳播患者梅毒血清學(xué)檢測(cè)方法的選擇[J].中華醫(yī)院感染學(xué)雜志，2010，. 20(10) :1491-1494)在對(duì)健康體檢者、門(mén)診患者和潛在血源傳播患者梅毒血清學(xué)調(diào)查中均發(fā)現(xiàn)，這些人群存在一定比例的梅毒感染率，推測(cè)本地區(qū)人群梅毒的檢出率應(yīng)該在2. 59%以上。顯然，梅毒感染者已經(jīng)較廣泛地存在于普通人群中。梅毒正以過(guò)去500年任何國(guó)家和地區(qū)都未曾有過(guò)的速度在中國(guó)傳 播，由于存在隱性感染以及無(wú)法統(tǒng)計(jì)的私人診所患者患病率，目前看到的梅毒發(fā)病率或許只是梅毒現(xiàn)狀的冰山一角([5]Lin, L. R. , Fu, Z. G. , Dan, B. , Jing, et al. Developmentof a colloidal gold—immunochromatography assay to detect immunoglobulin Gantibodies to Treponema pallidum with TPNl7and TPN47[J]. Diagn Micr InfecDis, 2010，68(3) : 193-200. [6]Tucker JD, C. X. , Peeling RW. Syphilis and socialupheaval in china[J]. N Engl J Med, 2010, 362(18):1658-1661. [7]Chen, Z. Q. , Zhang, G.C. , Gong, X. D. , Lin, C. , Gao, X. , Liang, G. J. , Chen, X. S. , and Cohen, M. S. Syphilis inchina:Results of a national surveillance programme[J]. Lancet, 2007, 369:132-138.[8]Li-Rong Lin, Man-Li Tong,Zuo-Gen Fu,et al.Evaluation of acolloidalgold-immunochromatography assay in the detection of Treponema Pallidm specificIgM antibody in syphilis serofast reaction patients:a serologic marker for therelapse and infection of syphilis[J]. Diagnostic Microbiology and InfectiousDisease. 2011, 70:10-16)。實(shí)驗(yàn)室檢查是診斷梅毒必不可少的方法，也是判斷療效和復(fù)發(fā)的重要依據(jù)，包括暗視野顯微鏡檢查和血清學(xué)試驗(yàn)。梅毒螺旋體感染早期，梅毒抗體還未產(chǎn)生或含量 較低時(shí)，暗視野顯微鏡查找螺旋體成為最早的實(shí)驗(yàn)室診斷方法，但敏感度較低，且易受肛門(mén)周?chē)侵虏÷菪w的影響而產(chǎn)生假陽(yáng)性。梅毒螺旋體尚不能進(jìn)行體外培養(yǎng)，梅毒診斷與流行病學(xué)調(diào)查主要依賴(lài)于血清學(xué)試驗(yàn)，包括特異性抗體和反應(yīng)素檢測(cè)兩大類(lèi)型。反應(yīng)素檢測(cè)對(duì)早期梅毒檢測(cè)靈敏度不高，而且生物假陽(yáng)性率較高，是主要用于療效觀(guān)察的一項(xiàng)血清學(xué)指標(biāo)([9]林麗蓉，但冰，付左根，等.潛在血源傳播患者梅毒血清學(xué)TRUST/TPPA與IgM抗體聯(lián)合檢測(cè).中國(guó)皮膚性病學(xué)雜志.2010，152(05):446-448)。梅毒特異性抗體檢測(cè)的敏感性和特異性均較反應(yīng)素高。但是，梅毒特異性抗體檢測(cè)仍然存在著靈敏度不足的缺陷，尤其是早期梅毒患者抗體滴度較低。如果能建立一種方法能靈敏、特異和快速檢測(cè)到梅毒患者各類(lèi)組織、體液中存在梅毒螺旋體，能證明梅毒螺旋體存在，那么這些棘手問(wèn)題將迎刃而解。兔睪丸是梅毒螺旋體易感器官，少量梅毒螺旋體即可導(dǎo)致兔睪丸炎，因此，兔感染試驗(yàn)被視為梅毒螺旋體檢測(cè)的最靈敏的方法。然而，兔感染試驗(yàn)操作繁瑣，觀(guān)察時(shí)間要求3個(gè)月，甚至更長(zhǎng)時(shí)間才能得到結(jié)果，臨床可操作性差。PCR擴(kuò)增技術(shù)以梅毒螺旋體特異性的基因片段做為擴(kuò)增模板，通過(guò)指數(shù)擴(kuò)增實(shí)現(xiàn)了病原體的快速檢測(cè)，具有高效、靈敏和特異等優(yōu)勢(shì)。從理論上分析，通過(guò)優(yōu)化、改良PCR擴(kuò)增技術(shù)，其檢測(cè)的靈敏度和特異性可以媲美兔感染試驗(yàn)，而檢測(cè)時(shí)間僅僅需要2個(gè)小時(shí)([10]HAYP E, CLARKE JR,TAYL0R-R0BINS0N D, et al. Detection of treponemal DNA in the csf of patientswith syphilis and hiv infection using tte polymerase chain reaction [J].Genitourin Med, 1990，66 (6) : 428-32)，有望成為解決這些棘手問(wèn)題的最佳方法。.盡管?chē)?guó)內(nèi)外有些企業(yè)研發(fā)出梅毒PCR檢測(cè)試劑，但尚未有進(jìn)入臨床應(yīng)用的有注冊(cè)文號(hào)PCR檢測(cè)試劑，而僅僅停留在科研應(yīng)用。更嚴(yán)重的是，目前的PCR檢測(cè)試劑在研發(fā)過(guò)程中由于未經(jīng)嚴(yán)格的比對(duì)試驗(yàn)，無(wú)一例外的存在靈敏度和特異性嚴(yán)重不足，其準(zhǔn)確性不高，是目前梅毒PCR技術(shù)在臨床中應(yīng)用的瓶頸。梅毒螺旋體基因TPN47 (47kDa lipoprotein gene)為特異性47-kDa脂蛋白基因，是梅毒螺旋體蒼白株最常見(jiàn)的表達(dá)基因具有高度的特異性，該47-kDa蛋白為青霉素結(jié)合蛋白，與青霉素類(lèi)的治療密切相關(guān)([II]Smajs, D.，M. McKevitt, J. K. Howell,，etal.Transcriptome of Treponema pallidum:gene expression profile duringexperimental rabbit infection. J.Bacteriol. 2005. 187:1866 - 1874. Transcriptomeof Treponema pallidum:gene expression profile during experimental rabbitinfection. J. Bacteriol. 2005. 187:1866 - 1874.)。在梅毒早期快速診斷、療效判斷、療程選擇、神經(jīng)梅毒確診、胎傳梅毒診斷，以及獻(xiàn)血員、孕產(chǎn)婦、婚前體檢、手術(shù)患者和輸血前篩查等領(lǐng)域發(fā)揮重大作用，有著目前常用的血清學(xué)檢測(cè)不可比擬的優(yōu)勢(shì)，將逐漸替代這些方法或作為這些方法的驗(yàn)證試驗(yàn)，具有廣闊的應(yīng)用前景和重要的社會(huì)、經(jīng)濟(jì)價(jià)值。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供 一種梅毒螺旋體TPN47基因FQ-PCR檢測(cè)試劑盒及其制備方法。所述梅毒螺旋體TPN47基因FQ-PCR檢測(cè)試劑盒設(shè)有DNA提取試劑瓶、耐熱DNA聚合酶瓶、PCR反應(yīng)液瓶、標(biāo)準(zhǔn)品瓶、質(zhì)控品瓶和包裝盒；所述DNA提取試劑瓶、耐熱DNA聚合酶瓶、PCR反應(yīng)液瓶、標(biāo)準(zhǔn)品瓶和質(zhì)控品瓶設(shè)在包裝盒內(nèi)；所述DNA提取試劑瓶設(shè)有蛋白酶K瓶、裂解液瓶、無(wú)水乙醇瓶、抑制物去除液瓶、第I清洗緩沖液瓶、洗脫液瓶、第2清洗緩沖液瓶和含收集管的尚心柱；所述標(biāo)準(zhǔn)品瓶設(shè)有6個(gè)含TPN47基因的標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒瓶；所述質(zhì)控品瓶設(shè)有陰性質(zhì)控品瓶和陽(yáng)性質(zhì)控品瓶。所述耐熱DNA聚合酶瓶可采用Tag酶瓶。所述陰性質(zhì)控品為不含梅毒螺旋體DNA的樣品，陽(yáng)性質(zhì)控品為含梅毒螺旋體DNA的樣品。所述6個(gè)含TPN47基因的標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒的濃度可分別為I. O X 102copies/mL、I. OX IO3Cop ies/mL、I. OX 104copi es/mL、I. 0X105cop ies/mL、I. OXlO6Cop ies/mL 和1.0X 107copies/mL,共 6 個(gè)濃度。所述PCR反應(yīng)液的成份含有PCR緩沖液、MgCl2、dNTPs和TPN47基因引物、探針組成的混合物。所述耐熱DNA聚合酶(Tag酶)具有V - DNA聚合酶活性、5 ^ — 3' DNA外切核酸酶活性和可耐受高溫的聚合酶；所述耐熱DNA聚合酶(Tag酶)最好是半衰期>45min的高溫聚合酶。所述梅毒螺旋體TPN47基因FQ-PCR檢測(cè)試劑盒的制備方法，包括以下步驟I)靶基因篩選，具體方法如下從基因庫(kù)(GENBANK)中篩選梅毒螺旋體TPN47基因，TPN47基因探針和引物的設(shè)計(jì)米用 PCR 引物探針設(shè)計(jì)軟件 primer premier 5.0、Oligo 6· O、TM Utility vl. 3、ClustalX等設(shè)計(jì)軟件輔助完成，然后通過(guò)Basic Local Alignment Search Tool (BLAST)進(jìn)行同源性比對(duì)以保證其特異性，合成的引物和探針用TE溶解，使用ND-1000UV-VIS波長(zhǎng)紫外/可見(jiàn)光掃描分光光度計(jì)進(jìn)行濃度測(cè)定后，保存，所述TE為IOmM Tri-HCl，pH5. 0,0. ImM TA ；2) TPN47基因標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒的構(gòu)建，具體方法如下以硅膠膜-離心柱法提取梅毒螺旋體Nichols株DNA作為模板，采用步驟I)中的TPN47基因的引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，具體過(guò)程如下將擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)過(guò)回收及純化后，在微量離心管中配制DNA溶液，后加入5 μ L等量的Solution I，16°C反應(yīng)30min，與pMD18_T載體連接將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至DH5a中，冰中放置30min，42°C加熱45s后，再在冰中放置lmin，力口入LB培養(yǎng)基，37°C震蕩培養(yǎng)60min后，在含有X_Gal、IPTG、Amp的LB瓊脂平板培養(yǎng)基上培養(yǎng)，形成單菌落，挑選白色菌落，進(jìn)行增殖培養(yǎng)，提取質(zhì)粒并對(duì)其進(jìn)行PCR，Xab I和Sal I雙酶切及測(cè)序鑒定后，將構(gòu)建好的質(zhì)粒進(jìn)行單酶切線(xiàn)性化處理，再用紫外分光光度計(jì)定量并-20°C保存作為FQ-PCR的標(biāo)準(zhǔn)品；3) TPN47基因檢測(cè)試劑標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)制作，其具體方法如下包含TPN47基因的陽(yáng)性克隆大腸桿菌在含Amp LB肉湯增菌，提取質(zhì)粒，取10 μ L質(zhì)粒用雙蒸水稀釋100倍,260nm, 280nm比色，純度=A26(I/A28(I,濃度=A260X 50 X 2 X 100 X IO-6X 6. 02 X IO23/(2806 X 324. 5 X 2) copies/mL,根據(jù)質(zhì)粒濃度，進(jìn)行梯度稀釋?zhuān)悦總€(gè)濃度標(biāo)準(zhǔn)品作模板進(jìn)行熒光定量反應(yīng)，確定線(xiàn)性范圍；4)制備PCR反應(yīng)液，其具體方法如下采用PCR緩沖液、MgCl2、dNTPs、TPN47基因引物、探針的混合物共同組成PCR反應(yīng)液；5)制備耐熱DNA聚合酶，其具體方法如下大腸桿菌用異丙基硫代_β-D半乳糖苷(IPTG)進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，誘導(dǎo)后的菌懸液IOOml 經(jīng) 5000r/min, 4°C離心 5min,以 IOml 緩沖液 I 重懸菌液，4°C，5000r/min,離心 5min,細(xì)菌沉淀再懸于5ml緩沖液I中，加入溶菌酶(Lys)使?jié)舛冗_(dá)5mg/ml，37°C水浴20min ;力口入5ml緩沖液II, 75°C水浴45min, 4°C , 15000r/min離心IOmin ;上清加入硫酸銨使達(dá)30%,4°C,1500r/min離心lOmin，沉淀溶于Iml緩沖液III中，并對(duì)緩沖液III在4°C條件下透析，每6h換液I次共4次，離心除去不溶物后，-20°C凍存；6)建立樣品處理方法，其具體方法如下使用梅毒螺旋體TPN47基因FQ-PCR檢測(cè)試劑檢測(cè)梅毒螺旋體的樣本，采用硅膠膜-離心柱法提取模板DNA ；7)制備質(zhì)控品，其具體方法如下制備陰性質(zhì)控品選擇經(jīng)過(guò)臨床確認(rèn)為陰性的臨床標(biāo)本；制備陽(yáng)性質(zhì)控品選擇經(jīng)過(guò)臨床確認(rèn)為陽(yáng)性的臨床標(biāo)本經(jīng)稀釋獲得陽(yáng)性質(zhì)控品；8)制備梅毒螺旋體TPN47基因FQ-PCR檢測(cè)試劑盒，將DNA提取試劑、耐熱DNA聚合酶、PCR反應(yīng)液、標(biāo)準(zhǔn)品和質(zhì)控品共同組成梅毒螺旋體TPN47基因FQ-PCR檢測(cè)試劑盒。在步驟I)中，所述TPN47基因探針和引物的序列如表I所不。表I
權(quán)利要求
1.梅毒螺旋體TPN47基因FQ-PCR檢測(cè)試劑盒，其特征在于設(shè)有DNA提取試劑瓶、耐熱DNA聚合酶瓶、PCR反應(yīng)液瓶、標(biāo)準(zhǔn)品瓶、質(zhì)控品瓶和包裝盒；所述DNA提取試劑瓶、耐熱DNA聚合酶瓶、PCR反應(yīng)液瓶、標(biāo)準(zhǔn)品瓶和質(zhì)控品瓶設(shè)在包裝盒內(nèi)；所述DNA提取試劑瓶設(shè)有蛋白酶K瓶、裂解液瓶、無(wú)水乙醇瓶、抑制物去除液瓶、第I清洗緩沖液瓶、洗脫液瓶、第2清洗緩沖液瓶和含收集管的尚心柱；所述標(biāo)準(zhǔn)品瓶設(shè)有6個(gè)含TPN47基因的標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒瓶；所述質(zhì)控品瓶設(shè)有陰性質(zhì)控品瓶和陽(yáng)性質(zhì)控品瓶。
2.如權(quán)利要求I所述的梅毒螺旋體TPN47基因FQ-PCR檢測(cè)試劑盒，其特征在于所述耐熱DNA聚合酶瓶采用Tag酶瓶； 所述6個(gè)含TPN47基因的標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒的濃度可分別為I. OX 102COpieS/mL、I. OX IO3Cop ies/mL、I. OX 104copies/mL、I. 0X105copies/mL、l. 0 X 106copi es/mL 和1.0X 107copies/mL,共 6 個(gè)濃度。
3.如權(quán)利要求I所述的梅毒螺旋體TPN47基因FQ-PCR檢測(cè)試劑盒，其特征在于所述PCR反應(yīng)液的成份含有PCR緩沖液、MgCl2、dNTPs和TPN47基因引物、探針組成的混合物； 所述耐熱DNA聚合酶具有3' —5' DNA聚合酶活性、5' —3' DNA外切核酸酶活性和可耐受高溫的聚合酶；所述耐熱DNA聚合酶最好是半衰期>45min的高溫聚合酶。
4.如權(quán)利要求I所述的梅毒螺旋體TPN47基因FQ-PCR檢測(cè)試劑盒的制備方法，其特征在于包括以下步驟 1)靶基因篩選，具體方法如下 從基因庫(kù)中篩選梅毒螺旋體TPN47基因，TPN47基因探針和引物的設(shè)計(jì)采用PCR引物探針設(shè)計(jì)軟件輔助完成，然后通過(guò)Basic Local Alignment Search Tool進(jìn)行同源性比對(duì)以保證其特異性，合成的引物和探針用TE溶解，使用ND-1000UV-VIS波長(zhǎng)紫外/可見(jiàn)光掃描分光光度計(jì)進(jìn)行濃度測(cè)定后，保存，所述TE為IOmM Tri-HCl，pH5. 0,0. ImM TA； 2)TPN47基因標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒的構(gòu)建，具體方法如下 以硅膠膜-離心柱法提取梅毒螺旋體Nichols株DNA作為模板，采用步驟I)中的TPN47基因的引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，具體過(guò)程如下將擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)過(guò)回收及純化后，在微量離心管中配制DNA溶液，后加入5 μ L等量的Solution I，16°C反應(yīng)30min，與pMD18_T載體連接將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至DH5 α中，冰中放置30min，42°C加熱45s后，再在冰中放置Imin，加入LB培養(yǎng)基，37°C震蕩培養(yǎng)60min后，在含有X_Gal、IPTG、Amp的LB瓊脂平板培養(yǎng)基上培養(yǎng)，形成單菌落，挑選白色菌落，進(jìn)行增殖培養(yǎng)，提取質(zhì)粒并對(duì)其進(jìn)行PCR，Xab I和Sal I雙酶切及測(cè)序鑒定后，將構(gòu)建好的質(zhì)粒進(jìn)行單酶切線(xiàn)性化處理，再用紫外分光光度計(jì)定量并_20°C保存作為FQ-PCR的標(biāo)準(zhǔn)品； 3)TPN47基因檢測(cè)試劑標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)制作，其具體方法如下 包含TPN47基因的陽(yáng)性克隆大腸桿菌在含Amp LB肉湯增菌，提取質(zhì)粒，取IOyL質(zhì)粒用雙蒸水稀釋100倍,260nm, 280nm比色，純度=A26(I/A28(I,濃度=A260X 50 X 2 X 100 X IO-6X 6. 02 X IO23/(2806 X 324. 5 X 2) copies/mL,根據(jù)質(zhì)粒濃度，進(jìn)行梯度稀釋?zhuān)悦總€(gè)濃度標(biāo)準(zhǔn)品作模板進(jìn)行熒光定量反應(yīng)，確定線(xiàn)性范圍； 4)制備PCR反應(yīng)液，其具體方法如下 采用PCR緩沖液、MgCl2、dNTPs、TPN47基因引物、探針的混合物共同組成PCR反應(yīng)液； 5)制備耐熱DNA聚合酶，其具體方法如下大腸桿菌用異丙基硫代-β-D半乳糖苷進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，誘導(dǎo)后的菌懸液IOOml經(jīng)5000r/min, 4°C離心5min,以IOml緩沖液I重懸菌液，4°C, 5000r/min,離心5min,細(xì)菌沉淀再懸于5ml緩沖液I中，加入溶菌酶使?jié)舛冗_(dá)5mg/ml，37°C水浴20min ;加入5ml緩沖液II，75°C水浴 45min, 4°C, 15000r/min 離心 IOmin ;上清加入硫酸銨使達(dá) 30%, 4°C, 1500r/min 離心lOmin，沉淀溶于Iml緩沖液III中，并對(duì)緩沖液III在4°C條件下透析，每6h換液I次共4次，離心除去不溶物后，-20°C凍存； 6)建立樣品處理方法，其具體方法如下 使用梅毒螺旋體TPN47基因FQ-PCR檢測(cè)試劑檢測(cè)梅毒螺旋體的樣本，采用硅膠膜_離心柱法提取模板DNA ； 7)制備質(zhì)控品，其具體方法如下 制備陰性質(zhì)控品選擇經(jīng)過(guò)臨床確認(rèn)為陰性的臨床標(biāo)本； 制備陽(yáng)性質(zhì)控品選擇經(jīng)過(guò)臨床確認(rèn)為陽(yáng)性的臨床標(biāo)本經(jīng)稀釋獲得陽(yáng)性質(zhì)控品； 8)制備梅毒螺旋體TPN47基因FQ-PCR檢測(cè)試劑盒，將DNA提取試劑、耐熱DNA聚合酶、PCR反應(yīng)液、標(biāo)準(zhǔn)品和質(zhì)控品共同組成梅毒螺旋體TPN47基因FQ-PCR檢測(cè)試劑盒。
5.如權(quán)利要求4所述的梅毒螺旋體TPN47基因FQ-PCR檢測(cè)試劑盒的制備方法，其特征在于在步驟I)中，所述TPN47基因探針和引物的序列如下所示 革巴基因序列名稱(chēng)引物/探針序列 TPN47 上游引物序列 5' -CCGTGAGTTCATCGACTATGTGA-3' 下游引物序列 5' -TTGGTGTAGCTCGCGTCATC-3' 熒光探針序列 5' -FAM-TTCAACACGGTCCGCTACGACTACTACGG-BHQ1-3'。
6.如權(quán)利要求4所述的梅毒螺旋體TPN47基因FQ-PCR檢測(cè)試劑盒的制備方法，其特征在于在步驟3)中，所述梯度稀釋選I. OX 102copies/mL、1.0X 103copies/mL、I. O X 104copies/mL、I. O X 105copies/mL、I. O X 106copies/mL、I. O X 107copies/mL 6 個(gè)濃度作標(biāo)準(zhǔn)品。
7.如權(quán)利要求4所述的梅毒螺旋體TPN47基因FQ-PCR檢測(cè)試劑盒的制備方法，其特征在于在步驟4)中，所述PCR緩沖液為ρΗ=5. (ΓΙΟ. O之間的穩(wěn)定緩沖時(shí)，ρΗ=7. (T9. O ;引物的濃度為25ρπι01/μ L，熒光探針的濃度為20ρπιΟ1/μ L，dNTPs的濃度為2mmol/L ;鎂離子的濃度為 15 20mmol/Lo
8.如權(quán)利要求4所述的梅毒螺旋體TPN47基因FQ-PCR檢測(cè)試劑盒的制備方法，其特征在于在步驟 5)中，所述緩沖液 I 為 50mmol/L tris-HCl, 50mmoI /T, Glucose, lmmol/L EDTA,ρΗ8· 0 ;所述緩沖液 II 為 5mmol/L Tris-HCl, 50mmol/L KCl, lmmol/L EDTA, lmmol/L PMSF,0.5%Tween 20,0. 5%NP 40 ;所述緩沖液III為 50ml mol/L Tris-HCl, lOmmol/L KCl, lmmol/LDTT,0. 5%PMSF，50% 甘油。
9.如權(quán)利要求4所述的梅毒螺旋體TPN47基因FQ-PCR檢測(cè)試劑盒的制備方法，其特征在于在步驟6)中，所述樣本包括組織、全血、分泌物臨床標(biāo)本；所述分泌物可包括皮膚、生殖器潰瘍、糜爛部分的分泌物。
10.如權(quán)利要求4所述的梅毒螺旋體TPN47基因FQ-PCR檢測(cè)試劑盒的制備方法，其特征在于在步驟8)中，所述耐熱DNA聚合酶的用量為8 10U/反應(yīng)。
全文摘要
梅毒螺旋體TPN47基因FQ-PCR檢測(cè)試劑盒及其制備，涉及一種試劑盒。試劑盒設(shè)有DNA提取試劑瓶、耐熱DNA聚合酶瓶、PCR反應(yīng)液瓶、標(biāo)準(zhǔn)品瓶、質(zhì)控品瓶和包裝盒；DNA提取試劑瓶設(shè)有蛋白酶K瓶、裂解液瓶、無(wú)水乙醇瓶、抑制物去除液瓶、第1清洗緩沖液瓶、洗脫液瓶、第2清洗緩沖液瓶和含收集管的離心柱；標(biāo)準(zhǔn)品瓶設(shè)有6個(gè)含TPN47基因的標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒瓶；質(zhì)控品瓶設(shè)有陰性質(zhì)控品瓶和陽(yáng)性質(zhì)控品瓶。先篩選靶基因，再構(gòu)建TPN47基因標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒，制作TPN47基因檢測(cè)試劑標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)后，先后制備PCR反應(yīng)液、耐熱DNA聚合酶，建立樣品處理方法后，制備質(zhì)控品，最后完成梅毒螺旋體TPN47基因FQ-PCR檢測(cè)試劑盒。
文檔編號(hào)C12M1/34GK102634452SQ20121014056
公開(kāi)日2012年8月15日 申請(qǐng)日期2012年5月8日 優(yōu)先權(quán)日2012年5月8日
發(fā)明者劉莉莉, 張長(zhǎng)弓, 徐竟波, 楊天賜, 林麗蓉, 童曼莉 申請(qǐng)人:廈門(mén)大學(xué)附屬中山醫(yī)院