專(zhuān)利名稱：來(lái)自辣椒疫霉菌的果膠裂解酶pcpel20及其編碼基因與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種果膠裂解酶及其編碼基因與應(yīng)用，特別涉及來(lái)自辣椒疫霉菌的果膠裂解酶及其編碼基因與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
辣椒疫病(Pepper Phytophthora Blight)是在世界范圍內(nèi)普遍發(fā)生的一種毀滅性病害。引起該病的病原為Phytophthora capsici Leonian,屬卵菌門(mén)(Oomycetes),霜霉目(Peronosporales),腐霉科(Pythiaceae),疫霉屬(Phytophthora)。病原菌通常以菌絲體、厚垣孢子及卵孢子在病株殘?bào)w、土壤內(nèi)越冬，也可以在其它寄主植物上越冬，成為第二年初侵染源。條件適宜時(shí)，越冬后的病原隨灌水、氣流等傳到寄主各部位，引起發(fā)病，進(jìn)行再 侵染。在發(fā)病季節(jié)，一般病株率為20%左右，嚴(yán)重的達(dá)到80%以上。近年來(lái)，隨著辣椒在各主產(chǎn)區(qū)的連茬種植，病害有逐漸加重的趨勢(shì)，危害較為顯著。該病原菌除危害辣椒外，也可侵染番茄、茄子、黃瓜、西瓜、南瓜等作物，對(duì)生產(chǎn)威脅極大。植物病原卵菌與寄主互作過(guò)程中分泌多種重要的細(xì)胞壁降解酶或致病酶，其中比較重要的三類(lèi)細(xì)胞壁降解酶為以下三種(I)聚半乳糖醒酸酶(polygalacturonase, PG)能分解半乳糖醒酸中的a_l, 4糖苷鍵。(2)果膠甲基酯酶(pectin methylesterase, PME)可促使果膠脫酯,生成果膠酸。(3)果膠裂解酶(pectate lyase, PL)由β消去反應(yīng)裂解a_l，4糖苷鍵，在反應(yīng)產(chǎn)物的非還原端殘基C-4和C-5之間產(chǎn)生一個(gè)雙鍵。可裂解高度酯化的果膠，能迅速降低粘度。上述三類(lèi)細(xì)胞壁降解酶均屬于果膠酶。果膠酶是指能夠分解果膠物質(zhì)的多種酶的總稱。果膠物質(zhì)在自然界中分布非常廣泛，它是植物體中一類(lèi)復(fù)雜的，膠體性質(zhì)糖類(lèi)，是天然的高分子化合物，分子量約50000-300000。它是植物細(xì)胞壁的重要組成成分，主要存在于細(xì)胞壁的中間層，初生壁也有一部分，而次生壁則很少有果膠物質(zhì)存在。在世界范圍內(nèi)，植物病原卵菌易導(dǎo)致多種植物的病害，給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成了嚴(yán)重的損失。辣椒疫霉病是一種重要的卵菌病害，能導(dǎo)致多種植物發(fā)生嚴(yán)重病害，深入開(kāi)展辣椒疫霉菌(Phytophthora capsici)果膠裂解酶基因分離及祀標(biāo)基因編碼的蛋白制作和功能分析具重要的實(shí)踐意義，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)于植物病原卵菌所導(dǎo)致的多種植物病害的防治與研究。而且，果膠裂解酶可用于食品加工，如在果汁和酒的生產(chǎn)中，果膠裂解酶可用于增加果汁的產(chǎn)量，便于加壓和過(guò)濾，而且可以提高果汁和酒的透明度。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種果膠裂解酶。本發(fā)明所提供的果膠裂解酶，名稱為PCPEL20，來(lái)源于辣椒疫霉菌(Phytophthoracapsici) SD33,是如下 a)或 b)或 c)的蛋白質(zhì)a)由序列表中序列2第22-297位所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；b)由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；c)將序列表中序列2所示的氨基酸序列或序列2第22-297位所示的氨基酸序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有果膠裂解酶活性的由a)衍生的蛋白質(zhì)。其中，序列表中序列2由297個(gè)氨基酸殘基組成，第1-21位氨基酸組成信號(hào)肽。a)所述的蛋白質(zhì)是果膠裂解酶的成熟蛋白，b)所述的蛋白質(zhì)是果膠裂解酶的前體蛋白。為了使上述(a)中的蛋白便于純化，可在由序列表中序列2所示的氨基酸序成的蛋白質(zhì)的氨基末端或羧基末端連接上如表I所示的標(biāo)簽。表I標(biāo)簽的序列
權(quán)利要求
1.ー種蛋白，是如下a)或b)或c)的蛋白質(zhì) a)由序列表中序列2第22-297位所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)； b)由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)； c)將序列表中序列2所示的氨基酸序列或序列2第22-297位所示的氨基酸序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有果膠裂解酶活性的由a)衍生的蛋白質(zhì)。
2.編碼權(quán)利要求I所述蛋白的核酸分子。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的核酸分子，其特征在于所述核酸分子為如下I)或2)或3)或4)所示的基因 1)其編碼序列是序列表中序列I的第64-894位核苷酸的DNA分子； 2)其編碼序列是序列表中序列I的第1-894位核苷酸的DNA分子； 3)在嚴(yán)格條件下與I)或2)限定的DNA分子雜交且編碼權(quán)利要求I所述蛋白的DNA分子; 4)與I)或2)限定的DNA分子具有90%以上的同源性且編碼權(quán)利要求I所述蛋白的DNA分子。
4.下述I)-4)中的任ー種生物材料 1)含有權(quán)利要求2或3所述核酸分子的表達(dá)盒； 2)含有權(quán)利要求2或3所述核酸分子的重組表達(dá)載體； 3)含有權(quán)利要求2或3所述核酸分子的重組微生物； 4)含有權(quán)利要求2或3所述核酸分子的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系。
5.制備權(quán)利要求I所述蛋白質(zhì)的方法，包括將權(quán)利要求I所述的蛋白質(zhì)的編碼基因在生物細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)得到權(quán)利要求I所述蛋白質(zhì)的步驟；所述生物細(xì)胞為微生物細(xì)胞、植物細(xì)胞或非人動(dòng)物細(xì)胞。
6.制備表達(dá)權(quán)利要求I所述蛋白質(zhì)的重組微生物的方法，包括將權(quán)利要求I所述的蛋白質(zhì)的編碼基因?qū)胨拗魑⑸锛?xì)胞，得到表達(dá)權(quán)利要求I所述蛋白質(zhì)的重組微生物的步驟。
7.權(quán)利要求I所述的蛋白質(zhì)在作為果膠裂解酶中的應(yīng)用。
8.權(quán)利要求2或3所述的核酸分子或權(quán)利要求4所述的生物材料在制備果膠裂解酶中的應(yīng)用。
9.權(quán)利要求I所述的蛋白質(zhì)在降解植物細(xì)胞壁中的應(yīng)用。
10.權(quán)利要求I所述的蛋白質(zhì)在降解果膠中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了來(lái)自辣椒疫霉菌的果膠裂解酶PCPEL20及其編碼基因與應(yīng)用。本發(fā)明所提供的果膠裂解酶PCPEL20，是如下a)或b)或c)的蛋白質(zhì)a)由序列表中序列2第22-297位所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；b)由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；c)將序列表中序列2所示的氨基酸序列或序列2第22-297位所示的氨基酸序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有果膠裂解酶活性的由a)衍生的蛋白質(zhì)。果膠裂解酶PCPEL20具有較高的酶活性，其比活力達(dá)29±0.2U/mg蛋白，可用于食品加工，如在果汁和酒的生產(chǎn)中。
文檔編號(hào)C12N9/88GK102676488SQ20121014054
公開(kāi)日2012年9月19日 申請(qǐng)日期2012年5月8日 優(yōu)先權(quán)日2012年5月8日
發(fā)明者張修國(guó) 申請(qǐng)人:山東農(nóng)業(yè)大學(xué)