專利名稱：一株產(chǎn)丁二酸基因工程菌及其發(fā)酵生產(chǎn)丁二酸的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域，涉及一株產(chǎn)丁二酸基因工程菌及其發(fā)酵生產(chǎn)丁二酸的方法，具體是一株高效利用葡萄糖、木糖、阿拉伯糖及果糖等單糖，并且高效利用各種比例混合糖以及纖維素水解液生長(zhǎng)并產(chǎn)丁二酸重組菌株及其利用該菌株發(fā)酵生產(chǎn)丁二酸的方法。
背景技術(shù)：
丁二酸(succinic acid)又稱琥珀酸，被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、農(nóng)藥、染料、香料、油漆、 食品和塑料等行業(yè)，作為C4平臺(tái)化合物，可用于合成1，4-丁二醇、四氫呋喃、Y-丁內(nèi)酯等有機(jī)化學(xué)品以及聚丁二酸丁二醇酯(PBS)類生物可降解材料，被美國(guó)能源部認(rèn)為是未來(lái)12種最有價(jià)值的生物煉制產(chǎn)品之一。丁二酸的生產(chǎn)方法主要包括化學(xué)合成法和微生物發(fā)酵法，利用微生物發(fā)酵法轉(zhuǎn)化可再生資源，由于原料來(lái)源廣泛且價(jià)格低廉，污染小，環(huán)境友好，且在發(fā)酵過(guò)程中可以吸收固定CO2，能有效緩解溫室效應(yīng)，開辟了溫室氣體二氧化碳利用的新途徑，今年來(lái)成為研究的熱點(diǎn)。丁二酸的生產(chǎn)菌株主要集中在Anaerobiospirillum succiniciproducens、Actinobacillus succinogenes、Mannheimia succiniciproducens、重組谷氨酸棒桿菌和重組大腸桿菌。其中利用野生菌株生產(chǎn)丁二酸雖然獲得了較高的產(chǎn)物濃度，但培養(yǎng)過(guò)程培養(yǎng)基成本較高，且甲酸、乙酸等副產(chǎn)物積累較多，阻礙了其工業(yè)化進(jìn)程。而重組大腸桿菌由于遺傳背景清楚、易操作、易調(diào)控、培養(yǎng)基要求簡(jiǎn)單和生長(zhǎng)迅速等優(yōu)點(diǎn)，近年來(lái)被廣泛用于研究以獲得產(chǎn)丁二酸優(yōu)秀菌株。現(xiàn)有產(chǎn)丁二酸重組大腸桿菌的構(gòu)建思路主要包括失活副產(chǎn)物生成途徑的關(guān)鍵酶(如丙酮酸甲酸裂解酶與乳酸脫氫酶)、增強(qiáng)丁二酸合成途徑中酶(如磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶)的活性以及外源導(dǎo)入可以弓I導(dǎo)合成丁二酸的酶(如丙酮酸羧化酶)提高其對(duì)葡萄糖的利用率以及生產(chǎn)速率。其中，E. coli NZNlll由于同時(shí)失活了丙酮酸甲酸裂解酶與乳酸脫氫酶，NADH不能及時(shí)再生為NAD+，引起胞內(nèi)輔酶NAD 的不平衡(NADH/NAD+比例超過(guò)2)，最終導(dǎo)致厭氧條件下菌株不能利用葡萄糖。其自發(fā)突變株E. coli AFPlll由于突變了葡萄糖專性轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)中的PtsG基因，降低了在EMP途徑中NADH的產(chǎn)生速率，恢復(fù)了 NAD(H)平衡，使得菌株在厭氧條件下能夠利用葡萄糖，且產(chǎn)物主要為丁二酸，在有氧厭氧兩階段發(fā)酵培養(yǎng)AFPll I過(guò)程中，丁二酸質(zhì)量收率達(dá)到96%，生產(chǎn)強(qiáng)度為1.21 g T1 因此，在高產(chǎn)丁二酸大腸桿菌菌株構(gòu)建過(guò)程中，確保胞內(nèi)輔酶NAD(H)的平衡是重組大腸桿菌高產(chǎn)丁二酸的關(guān)鍵因素之一。大腸桿菌中NAD(H)的生物合成及分解途徑如圖I所示，涉及其合成的基因主要有三個(gè)(pncB，nadD，nadE)，涉及分解代謝的基因主要有兩個(gè)(viaD，yrfE)，而NAD+和NADH相互之間的轉(zhuǎn)化反應(yīng)則多達(dá)300多個(gè)。相關(guān)研究表明，利用DNA重組技術(shù)改造NAD(H)生物合成途徑是提高NAD(H)總量的有效手段。San等人(Metab Eng, 2002,4:238-247 ；Metab Eng, 2002, 4:182-192)在研究輔因子調(diào)控對(duì)大腸桿菌代謝流分布的影響過(guò)程中，通過(guò)過(guò)量表達(dá)煙酸轉(zhuǎn)磷酸核糖激酶使胞內(nèi)NAD(H)總量提高了 41. 7% ；Heuser等人(Eng LifeSci, 2007，7:343-353)通過(guò)過(guò)量表達(dá)煙酸轉(zhuǎn)磷酸核糖激酶和NAD合成酶，或者同時(shí)表達(dá)這兩個(gè)酶，使菌株胞內(nèi)NAD(H)總量提高了 2倍多，并將其應(yīng)用到酶轉(zhuǎn)化合成(R)-甲基-3-羥基丁胺過(guò)程中，使得NAD(H)的量不再成為限制因素，從而提高了酶轉(zhuǎn)化的效率。眾多科學(xué)實(shí)踐也證明利用發(fā)酵調(diào)控手段可有效調(diào)節(jié)NAD(H)總量與NADH/NAD+比例，進(jìn)而有效提高底物的利用率和產(chǎn)物生產(chǎn)水平。在利用Saccharomyces cerevisiae TMB3001 (BiotechnolBioeng, 2002，78:172-178)和 Fusarium oxysporum(J Biosci Bioeng, 2004, 97:299-304.Enzyme Micro Technol, 2005，36:100-106)發(fā)酵木糖生產(chǎn)乙醇的過(guò)程中添加乙偶姻作為外源電子受體，有效地增加了胞內(nèi)NAD+含量，提高了乙醇的產(chǎn)率；San等人(MetabEng，2002，4:182-192)在利用大腸桿菌生產(chǎn)1，2-丙二醇過(guò)程中，發(fā)現(xiàn)在稀釋率為0. I IT1恒化厭氧培養(yǎng)系統(tǒng)中，隨著碳源還原性的增大，胞內(nèi)NADH/NAD+比率從0. 51 (葡萄糖酸)增加到0. 75 (葡萄糖)和0. 94 (山梨醇)，并導(dǎo)致中心代謝流產(chǎn)物乙醇(消耗2 mo I NADH)對(duì)乙酸(不消耗NADH)的比率分別為0. 29、I和3. 62。
PTS轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)是大腸桿菌中葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)的主要轉(zhuǎn)運(yùn)方式，但是PTS轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)的存在，使大腸桿菌不能同時(shí)利用葡萄糖和其他各種單糖代謝生長(zhǎng)，而野生型大腸桿菌能夠分別利用葡萄糖、木糖、果糖、阿拉伯糖等單糖在厭氧條件下代謝生長(zhǎng)，但是丁二酸不是其主要代謝產(chǎn)物，為減少副產(chǎn)物生成，大腸桿菌敲除或失活乳酸脫氫酶(LDH)基因，丙酮酸甲酸裂解酶(PFL)基因活性減少副產(chǎn)物的生成。但是當(dāng)以葡萄糖或果糖為碳源時(shí)，由于敲除乳酸脫氫酶(LDH)基因和丙酮酸甲酸裂解酶(PFL)基因，導(dǎo)致菌株輔酶不平衡，并且積累了大量丙酮酸，導(dǎo)致菌體不能利用葡萄糖和果糖厭氧條件下代謝生長(zhǎng)，并生產(chǎn)丁二酸；而以木糖或阿拉伯糖為碳源時(shí)，由于敲除乳酸脫氫酶(LDH)基因和丙酮酸甲酸裂解酶(PFL)基因，減少了丙酮酸和乙酸的生成，從而使伴隨丙酮酸和乙酸生成的ATP減少，最終導(dǎo)致重組大腸桿菌不能利用木糖和阿拉伯糖代謝生長(zhǎng)，并生產(chǎn)丁二酸。玉米芯是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中比較常見的廢棄物，由于其成分含有大量纖維素，因此其水解液對(duì)微生物發(fā)酵來(lái)說(shuō)，是一種很好的可持續(xù)利用的綠色碳源，但其稀酸水解液含有高濃度木糖，因此現(xiàn)有技術(shù)中大多數(shù)產(chǎn)丁二酸大腸桿菌不能利用玉米芯水解液發(fā)酵生產(chǎn)丁二酸。姜岷等將玉米芯按料液比1:5 (質(zhì)量體積比)配制玉米芯料液，物料粒徑250 380 u m,H2SO4用量3%(體積分?jǐn)?shù))，水解溫度126°C，反應(yīng)時(shí)間215 h，利用活性炭吸附及Ca(OH)2中和等方式，對(duì)玉米芯多組分糖液進(jìn)行脫毒脫鹽處理，總糖質(zhì)量濃度為50 g/L，其中木糖占80%以上。稻草秸桿是重要的一類可再生生物質(zhì)資源。目前，除了在造紙業(yè)工業(yè)方面的利用，絕大多數(shù)被廢棄，嚴(yán)重浪費(fèi)了資源并且污染了環(huán)境。其主要成分是纖維素、半纖維素和木質(zhì)素，因此其水解液對(duì)微生物發(fā)酵來(lái)說(shuō)，是一種很好的可持續(xù)利用的綠色碳源，但其水解液含有高濃度木糖，因此現(xiàn)有技術(shù)中大多數(shù)產(chǎn)丁二酸大腸桿菌不能利用稻草秸桿水解液發(fā)酵生產(chǎn)丁二酸，陶文沂等通過(guò)稀硫酸121°C處理稻草秸桿I h，再用20 g/L的NaOH于121°C處理秸桿lh，葡萄糖和木糖二者總質(zhì)量濃度達(dá)50 g/L左右。甘蔗渣是甘蔗制糖時(shí)榨糖之后剩下的主要成分，因此其水解液對(duì)微生物發(fā)酵來(lái)說(shuō)，是一種很好的可持續(xù)利用的綠色碳源，但其水解液含有高濃度木糖，因此現(xiàn)有技術(shù)中大多數(shù)產(chǎn)丁二酸大腸桿菌不能利用稻草秸桿水解液發(fā)酵生產(chǎn)丁二酸，約含有50%的纖維素通過(guò)粉碎以及堿/氧化法預(yù)處理可得到總糖質(zhì)量為50 g/L，其中木糖占80%以上。糖蜜是工業(yè)制糖過(guò)程中，蔗糖結(jié)晶后，剩余的不能結(jié)晶，但仍含有較多糖的液體殘留物。余煒等將糖蜜與水1:1混勻，用濃硫酸(5 mol/L)將其pH調(diào)至2. 0，于100°C加熱20min，并用15%的石灰乳中和處理，總糖質(zhì)量為600 g/L，葡萄糖和果糖各占50%。在大腸桿菌磷酸烯醇式丙酮酸通過(guò)磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PPC)生成草酰乙酸，在此過(guò)程中沒(méi)有ATP的生成,但是在Bacillus subtilis中，磷酸烯醇式丙酮酸是通過(guò)磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶(PCK)生成草酰乙酸的，在此過(guò)程中有ATP的生成，并且Millard等在大腸桿菌中過(guò)量表達(dá)E. coli ppc和pck,研究發(fā)現(xiàn)過(guò)量表達(dá)ppc可以使琥拍酸作為混合酸發(fā)酵的主要產(chǎn)物，且產(chǎn)量較出發(fā)菌株提高3. 5倍，而過(guò)量表達(dá)pck對(duì)發(fā)酵結(jié)果沒(méi)有影響，但在PPC缺陷菌株中，pck的過(guò)量表達(dá)能夠提高琥珀酸的產(chǎn)量，這是由于PPC的Km比PCK小100倍，因此只有在ppc缺陷菌株中，pck的過(guò)量表達(dá)才能夠提高琥珀酸的產(chǎn)量
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的技術(shù)目的在于提供了一株高效利用葡萄糖、木糖、阿拉伯糖及果糖等單糖，并且高效利用各種比例混合糖以及纖維素水解液生長(zhǎng)并產(chǎn)丁二酸重組菌株及其構(gòu)建方法，并利用該菌株厭氧發(fā)酵生產(chǎn)丁二酸，達(dá)到菌株的構(gòu)建方法簡(jiǎn)單方便，構(gòu)建得到的菌株發(fā)酵方法簡(jiǎn)單可行，易于工業(yè)化，產(chǎn)酸能力強(qiáng)的目的，從而大大降低生產(chǎn)成本，提高經(jīng)濟(jì)效益。為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的技術(shù)目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案。一、本發(fā)明提供一株產(chǎn)丁二酸基因工程菌菌株，其分類命名為大腸埃希氏菌(Escherichia coli) BA306，其保藏號(hào)登記號(hào)為 CCTCC NO :M2012103。二、本發(fā)明所述的大腸埃希氏菌BA306的構(gòu)建方法，其特征在于以缺乏乳酸脫氫酶(LDH)基因，丙酮酸甲酸裂解酶(PFL)基因活性的菌株大腸桿菌為出發(fā)菌株，利用同源重組技術(shù)敲除磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PPC)基因和磷酸轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)(PTS)中的ptsG基因，并過(guò)量共表達(dá)磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶和煙酸磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶后，得到高效利用葡萄糖、木糖、阿拉伯糖及果糖等單糖，并且高效利用各種比例混合糖以及纖維素水解液生長(zhǎng)并產(chǎn)丁二酸的大腸埃希氏菌BA306。進(jìn)一步地,所述的具體構(gòu)建步驟如下(I)以缺乏乳酸脫氫酶基因(ldhA)，丙酮酸甲酸裂解酶基因(pflB)活性的E. coliNZNlll菌株為出發(fā)菌株，敲除其中磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PPC)基因和PTS轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)中的PtsG基因，得到同時(shí)缺乏ldhA、pf IB、ppc和ptsG的感受態(tài)菌株；(2)純化擴(kuò)增出磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶基因(pck)，構(gòu)建得到過(guò)量表達(dá)磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶的表達(dá)質(zhì)粒；(3)純化擴(kuò)增出煙酸磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶基因(pncB)，連接到步驟(2)所述的重組質(zhì)粒上，構(gòu)建得到過(guò)量共表達(dá)磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶和煙酸磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶的表達(dá)質(zhì)粒;(4)將步驟(3)所述的質(zhì)粒導(dǎo)入步驟(I)得到的感受態(tài)菌株，獲得陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子；(5)利用步驟(4)的陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子過(guò)量共表達(dá)磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶和煙酸磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶，恢復(fù)其在厭氧條件下代謝，得到能夠高效利用葡萄糖、木糖、阿拉伯糖及果糖等單糖，并且高效利用各種比例混合糖以及纖維素水解液生長(zhǎng)并產(chǎn)丁二酸的大腸埃希氏菌 BA306。三、利用本發(fā)明所述的大腸埃希氏菌BA306發(fā)酵生產(chǎn)丁二酸的方法，其特征在于采用兩階段發(fā)酵方式，有氧階段提高生物量，厭氧階段發(fā)酵產(chǎn)酸。進(jìn)一步地,具體步驟如下。將大腸埃希氏菌BA306按l%(v/v)接種量接種入有氧階段發(fā)酵培養(yǎng)基中有氧培養(yǎng)，當(dāng)有氧培養(yǎng)菌體OD6tltl至0. 4 0. 6用0. 3 mM的IPTG誘導(dǎo)至0D6(I(I=3時(shí)，按接種量10%(v/v)轉(zhuǎn)接至厭氧階段發(fā)酵培養(yǎng)基中厭氧發(fā)酵。其中所述的有氧階段發(fā)酵培養(yǎng)基是現(xiàn)有技術(shù)中有氧培養(yǎng)產(chǎn)丁二酸大腸桿菌的常 規(guī)培養(yǎng)基；所述的厭氧階段發(fā)酵培養(yǎng)基中的碳源包括但不限于葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、果糖或者其組合；還包括玉米芯水解液、稻草秸桿水解液、糖蜜水解液或者甘蔗渣水解液。本發(fā)明的有益效果在于首先，本發(fā)明以缺乏乳酸脫氫酶(LDH)基因，丙酮酸甲酸裂解酶(PFL)基因活性的菌株大腸桿菌NZNlll為出發(fā)菌株，利用同源重組技術(shù)敲除磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PPC)基因和PTS轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)中的ptsG基因，并過(guò)量共表達(dá)磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶和煙酸磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶，使其高效利用葡萄糖、木糖、阿拉伯糖及果糖等單糖，并且高效利用各種比例混合糖以及纖維素水解液生長(zhǎng)并產(chǎn)丁二酸。這種通過(guò)分子生物學(xué)手段提高菌株ATP生物合成能力，提高NAD(H)生成能力，改變胞內(nèi)NADH/NAD+，高效利用葡萄糖、木糖、阿拉伯糖及果糖等單糖，使菌株能夠高效利用各種比例混合糖以及纖維素水解液代謝生長(zhǎng)，大量提高丁二酸的產(chǎn)量及生產(chǎn)能力的方法未見公開，而這種應(yīng)用將大大推進(jìn)丁二酸產(chǎn)業(yè)的進(jìn)步和發(fā)展。其次，利用本發(fā)明所述的菌株大腸埃希氏菌BA306的發(fā)酵結(jié)果表明新構(gòu)建的重組大腸桿菌大腸埃希氏菌BA306能夠高效利用葡萄糖、木糖、阿拉伯糖及果糖等單糖，并且高效利用各種比例混合糖以及纖維素水解液發(fā)酵，并大量積累丁二酸，相比出發(fā)菌株，不能利用葡萄糖、木糖、阿拉伯糖及果糖等單糖，各種比例混合糖和纖維素水解液發(fā)酵，沒(méi)有丁二酸積累的特征，其產(chǎn)酸特征變化巨大。最后，厭氧發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)大量諸如乙酸等對(duì)菌株有毒害作用的副產(chǎn)物，因此考慮兩階段發(fā)酵方式，有氧階段提高生物量，厭氧階段進(jìn)行產(chǎn)酸發(fā)酵。也可以選擇性地采用膜分離技術(shù)，達(dá)到分離菌體的目的，再進(jìn)而用于厭氧發(fā)酵。


圖I大腸桿菌中NAD(H)的生物合成及分解途徑。圖2實(shí)施例I的線性DNA片段的電泳鑒定圖。圖3實(shí)施例I的同源重組陽(yáng)性重組子的電泳鑒定圖。圖4實(shí)施例2的線性DNA片段的電泳鑒定圖。圖5實(shí)施例2的同源重組陽(yáng)性重組子的電泳鑒定圖。圖6質(zhì)粒pTrc99a-pck的雙酶切電泳鑒定圖。圖7質(zhì)粒pTrc99a-pck_pncB的雙酶切電泳鑒定圖。本發(fā)明的微生物的分類命名為大腸埃希氏菌(Escherichia coli) BA306,其保藏日期為2012年4月8日，保藏單位全稱為中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，簡(jiǎn)稱為CCTCC，地址為中國(guó) 武漢 武漢大學(xué)，保藏編號(hào)=CCTCC NO M 2012103。
具體實(shí)施例方式下面的實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作詳細(xì)說(shuō)明，但對(duì)本發(fā)明沒(méi)有限制。本發(fā)明的生物材料的來(lái)源的說(shuō)明I、本發(fā)明所述的安普霉素抗性基因的來(lái)源是pIJ773，南京師范大學(xué)邵蔚藍(lán)教授惠贈(zèng)。
2、本發(fā)明所述的能夠誘導(dǎo)表達(dá)\重組酶的質(zhì)粒的來(lái)源是pKD46，購(gòu)自Introvegen 公司。3、本發(fā)明所述的能夠誘導(dǎo)產(chǎn)生FLP重組酶的質(zhì)粒的來(lái)源是pCP20，購(gòu)自Introvegen 公司。4、本發(fā)明所述的Bacillus subtilis基因組的來(lái)源是購(gòu)自中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心。5、本發(fā)明所述的表達(dá)質(zhì)粒用pTrc99a的來(lái)源是購(gòu)自Introvegen公司。6、出發(fā)菌株E. coli NZNl 11的感受態(tài)菌株的來(lái)源有兩處(I)Biotechnol Bioeng, 2001，74:89 95。申請(qǐng)人首先通過(guò)查閱到該生物材料的上述文獻(xiàn)出處，并聯(lián)系了發(fā)表人系美國(guó)芝加哥大學(xué)的David P. Clark教授，并郵件請(qǐng)求其贈(zèng)與該生物材料，并免費(fèi)獲得了該生物材料；且申請(qǐng)人保證從本申請(qǐng)日起二十年內(nèi)向公眾發(fā)放該生物材料；(2)該生物材料還在中國(guó)專利(申請(qǐng)?zhí)?6198547. X，申請(qǐng)日1996. 10. 31，授權(quán)日2003年I月I日，授權(quán)公告號(hào)CN1097632C)的專利文獻(xiàn)中公開并獲得授權(quán)。7、本發(fā)明的引物的設(shè)計(jì)及合成自行設(shè)計(jì)并外包金斯瑞生物技術(shù)公司合成。實(shí)施例I本實(shí)施例說(shuō)明利用同源重組技術(shù)敲除出發(fā)菌株NZNlll中磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶ppc基因，得到消除安普霉素抗性菌株的過(guò)程。I、利用LB培養(yǎng)基，于37°C、有氧條件下培養(yǎng)大腸桿菌NZNlll至OD6tltl=O. 4 0. 6，制備成電轉(zhuǎn)感受態(tài)。2、將質(zhì)粒pKD46電轉(zhuǎn)入感受態(tài)的大腸桿菌NZNl 11。電擊條件為200 Q,25uF,電擊電壓2. 3 kV，電擊時(shí)間4 5 ms。電擊后迅速將菌體加入預(yù)冷I mL的SOC培養(yǎng)基，150r/min、30°C培養(yǎng)I h之后涂布于帶氨芐青霉素(amp)的LB培養(yǎng)基平板篩選出陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子大腸桿菌 NZNl ll(pKD46)。3、在LB培養(yǎng)基中加入10 mM的L-阿拉伯糖，于30°C下誘導(dǎo)質(zhì)粒pKD46表達(dá)出入
重組酶，制成電轉(zhuǎn)感受態(tài)。4、以兩側(cè)帶有FRT位點(diǎn)的安普霉素抗性基因?yàn)槟０?，利用高保真PCR擴(kuò)增系統(tǒng)，以質(zhì)粒PIJ773為模板，并設(shè)計(jì)兩端帶有PPC同源片段的擴(kuò)增引物，擴(kuò)增出線性DNA同源片段，引物序列如下上游帶同源臂引物H1-P1，下劃線為同源片段5， -ATGAACGAACAATATTCCGCATTGCGTAGTAATGTCAGTATGCTCGGCATTCCGGGGATCCGTCGACC-3 。
下游帶同源臂引物H2-P2，下劃線為同源片段5， -AGCACGAGGGTTTGCAGAAGAGGAAGATTAGCCGGTATTACGCATACCTGTAGGCTGGAGCTGCTTC-3’。反應(yīng)體系帶同源臂的上下游引物(100 pmol/u L)各0. 5 u L ;模板DNA (IOOng/U L)0. 5u L ；10Xbuffer 5u L ；dNTPs(10 mM)各 I y L ;DMS0 (100%) 2. 5 u L ；PyrobestDNA 聚合酶(2. 5 U/ u L) I u L ；ddH20 36/35. 5 u L ;總體積 50 u L0反應(yīng)條件94°C，2min ； (94°C 45 sec ；50°C 45 sec ；72°C 90 sec;10 個(gè)循環(huán))；(94°C 45 sec ；50°C 45 sec ；72°C 90 sec ;15 個(gè)循環(huán))；72°C，5 min。線性DNA片段的鑒定如圖2。5、電轉(zhuǎn)線性DNA片段至已誘導(dǎo)表達(dá)X重組酶的大腸桿菌NZNl ll(pKD46)感受態(tài)，并涂布于帶安普霉素的LB平板篩選出陽(yáng)性重組子，并進(jìn)行了 PCR鑒定，電泳圖如圖3所示。6、陽(yáng)性重組子制成感受態(tài)后倒入能誘導(dǎo)表達(dá)FLP重組酶的質(zhì)粒pCP20，于42°C熱激表達(dá)FLP重組酶后即可消除安普霉素抗性。利用一對(duì)平板，進(jìn)行平行點(diǎn)樣，能夠在無(wú)抗性平板上生長(zhǎng)，但不能在抗性平板上生長(zhǎng)的均極為已經(jīng)敲除抗性的菌株。實(shí)施例2本實(shí)施例說(shuō)明利用實(shí)施案例I得到的已敲除ppc基因的菌株，再次利用同源重組技術(shù)敲除PTS轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)中ptsG基因，得到消除安普霉素抗性菌株的過(guò)程。I、利用LB培養(yǎng)基，于37°C、有氧條件下培養(yǎng)已實(shí)施案例I得到的已敲除ppc基因的菌株至OD6tltl=O. 4 0. 6，制備成電轉(zhuǎn)感受態(tài)。2、將質(zhì)粒pKD46電轉(zhuǎn)入此感受態(tài)細(xì)胞中。電擊條件為200 Q，25 yF，電擊電壓
2.3 kV，電擊時(shí)間4 5 ms。電擊后迅速將菌體加入預(yù)冷I mL的SOC培養(yǎng)基，150 r/min、30°C培養(yǎng)I h之后涂布于帶氨芐青霉素(amp)的LB培養(yǎng)基平板篩選出陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子大腸桿菌 NZNl 11/ A ppc(pKD46)。3、在LB培養(yǎng)基中加入10 mM的L-阿拉伯糖，于30°C下誘導(dǎo)質(zhì)粒pKD46表達(dá)出入
重組酶，制成電轉(zhuǎn)感受態(tài)。4、以兩側(cè)帶有FRT位點(diǎn)的安普霉素抗性基因?yàn)槟０澹酶弑Ｕ鍼CR擴(kuò)增系統(tǒng)，以質(zhì)粒PIJ773為模板，并設(shè)計(jì)兩端帶有ptsG基因同源片段的擴(kuò)增引物，擴(kuò)增出線性DNA同源片段，引物序列如下上游帶同源臂引物H1-P1，下劃線為同源片段5， -ATGTTTAAGAATGCATTTGCTAACCTGCAAAAGGTCGGTAAATCGCTGATTCCGGGGATCCGTCGACC-3，。下游帶同源臂引物H2-P2，下劃線為同源片段5， -TTAGTGGTTACGGATGTACTCATCCATCTCGGTTTTCAGGTTATCGGATGTAGGCTGGAGCTGCTTC-3，。反應(yīng)體系帶同源臂的上下游引物(100 pmol/u L)各0. 5 U L ;模板DNA (IOOng/U L)0. 5 u L ； 10Xbuffer 5 u L ；dNTPs(10 mM)各 I y L ;DMS0(100%) 2. 5 u L ；PyrobestDNA 聚合酶(2. 5 U/ u L) I u L ；ddH20 36/35. 5 uL ;總體積 50 u L0反應(yīng)條件94°C，2min ； (94°C 45 sec ；50°C 45 sec ；72°C 90 sec;10 個(gè)循環(huán))；(94°C 45 sec ；50°C 45 sec ；72°C 90 sec ;15 個(gè)循環(huán))；72°C，5 min。線性DNA片段的鑒定如圖4。5、電轉(zhuǎn)線性DNA片段至已誘導(dǎo)表達(dá)X重組酶的大腸桿菌NZNlll/Appc (pKD46)感受態(tài)，并涂布于帶安普霉素的LB平板篩選出陽(yáng)性重組子，并進(jìn)行了 PCR鑒定，電泳圖如圖5所示。6、陽(yáng)性重組子制成感受態(tài)后倒入能誘導(dǎo)表達(dá)FLP重組酶的質(zhì)粒pCP20，于42°C熱激表達(dá)FLP重組酶后即可消除安普霉素抗性。利用一對(duì)平板，進(jìn)行平行點(diǎn)樣，能夠在無(wú)抗性 平板上生長(zhǎng)，但不能在抗性平板上生長(zhǎng)的均極為已經(jīng)敲除抗性的菌株。實(shí)施例3本實(shí)施例說(shuō)明構(gòu)建過(guò)量表達(dá)磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶的表達(dá)質(zhì)粒。I、構(gòu)建過(guò)量表達(dá)磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶的表達(dá)質(zhì)粒，其過(guò)程包括(I)合成帶有SacI和XbaI酶切位點(diǎn)的引物，上游引物5’-CGAGCTCATGAACTCAGTTGATTTGACCG-3’ ；下游引物5，-GCTCTAGAGCATTCCGTCAATTAAAACAAG-3，。(2) 以Bacillus subtilis基因組為模板，PCR擴(kuò)增目的基因片段，反應(yīng)條件為94°C，5 min ； (94°C 45 s,53°C 45 s,72°C 100 s，35 個(gè)循環(huán))；72°C，10 min。純化擴(kuò)增出的pck基因后，表達(dá)質(zhì)粒用pTrc99a分別用SacI和XbaI雙酶切、連接獲得重組質(zhì)粒pTrc99a_pck。質(zhì)粒pTrc99a_pck的雙酶切電泳鑒定如圖6所示。實(shí)施例4本實(shí)施例說(shuō)明構(gòu)建過(guò)量共表達(dá)磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶和煙酸磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶的表達(dá)質(zhì)粒，使重組菌能夠高效利用葡萄糖、木糖、阿拉伯糖及果糖等單糖，并且高效利用各種比例混合糖以及纖維素水解液發(fā)酵，并大量積累丁二酸，得到菌株大腸埃希氏菌BA306的方法。I、構(gòu)建過(guò)量共表達(dá)磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶和煙酸磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶的表達(dá)質(zhì)粒，其過(guò)程包括(I)合成上下游引物都帶有HindIII酶切位點(diǎn)的引物，上游引物5’ -CCCAAGCTTATGACACAATTCGCTTCTCCTG-3 ’下游引物5，-CCCAAGCTTCACTTGTCCACCCGTAAATGG-3’(2)以大腸桿菌K12系列為模板，PCR擴(kuò)增目的基因片段，反應(yīng)條件為94°C，5min ； (94°C 45 s,55°C 45 s，72°C I min, 35 個(gè)循環(huán))；72°C，10 min。純化擴(kuò)增出的 pncB基因后，質(zhì)粒pTrc99a-pck用HindIII單酶切、連接獲得重組質(zhì)粒pTrc99a-pck_pncB。質(zhì)粒pTrc99a-pck-pncB的雙酶切電泳鑒定如圖7所示。2、將質(zhì)粒pTrc99a-pck_pncB導(dǎo)入實(shí)施案例2中同時(shí)缺乏ldhA、pf lB、ppc和ptsG的感受態(tài)菌株，獲得的陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子即為本發(fā)明的新構(gòu)建菌株Escherichia coliBA306。實(shí)施例5本實(shí)施例說(shuō)明大腸埃希氏菌BA306與出發(fā)菌株發(fā)酵木糖產(chǎn)酸能力的對(duì)比。大腸埃希氏菌BA306能夠高效利用木糖發(fā)酵，并大量積累丁二酸，采用兩階段發(fā)酵方式，其特征在于按l%(v/v)接種量從凍存管接入三角瓶中，當(dāng)有氧培養(yǎng)菌體0D_至0. 4 0. 6左右用0. 3 mM的IPTG誘導(dǎo)至0D6(I(I=3左右時(shí)，按接種量10%轉(zhuǎn)接至血清瓶中厭氧發(fā)酵，發(fā)酵48 h。有氧階段培養(yǎng)基為L(zhǎng)B+Amp (氨芐青霉素50 U g/mL) 0厭氧階段培養(yǎng)基為L(zhǎng)B+木糖(35 g/L) +堿式碳酸鎂0. 6 g+Amp (氨節(jié)青霉素50U g/mL)+0. 3 mM IPTG。發(fā)酵結(jié)果見表I。表I Escherichia coli BA206與出發(fā)菌株發(fā)酵產(chǎn)酸的結(jié)果比較
權(quán)利要求
1.一株產(chǎn)丁二酸基因工程菌菌株,其分類命名為大腸埃希氏菌(Escherichia coli)BA306，其保藏號(hào)編號(hào)為 CCTCC NO :M2012103。
2.權(quán)利要求I所述的大腸埃希氏菌BA306的構(gòu)建方法，其特征在于以缺乏乳酸脫氫酶基因，丙酮酸甲酸裂解酶基因活性的菌株大腸桿菌為出發(fā)菌株，利用同源重組技術(shù)敲除磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因和磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)的PtsG基因，并過(guò)量共表達(dá)磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶和煙酸磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶后，得到大腸埃希氏菌BA306。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的構(gòu)建方法，其特征在于具體構(gòu)建步驟如下 (1)以缺乏乳酸脫氫酶基因，丙酮酸甲酸裂解酶基因活性的E.coli菌株為出發(fā)菌株，敲除其中磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因和磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)的PtsG基因，得到同時(shí)缺乏ldhA、pf IB、ppc和ptsG的感受態(tài)菌株； (2)純化擴(kuò)增出磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶基因，構(gòu)建得到過(guò)量表達(dá)磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶的表達(dá)質(zhì)粒； (3)純化擴(kuò)增出煙酸磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶基因，連接到步驟(2)所述的重組質(zhì)粒上，構(gòu)建得到過(guò)量共表達(dá)磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶和煙酸磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶的表達(dá)質(zhì)粒； (4)將步驟(3)所述的質(zhì)粒導(dǎo)入步驟(I)得到的感受態(tài)菌株，獲得陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子； (5)利用步驟(4)的陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子過(guò)量共表達(dá)磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶和煙酸磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶，恢復(fù)其在厭氧條件下代謝，得到大腸埃希氏菌BA306。
4.利用權(quán)利要求I所述的大腸埃希氏菌BA306發(fā)酵生產(chǎn)丁二酸的方法，其特征在于采用兩階段發(fā)酵方式，有氧階段提高生物量，厭氧階段發(fā)酵產(chǎn)酸。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于將大腸埃希氏菌BA306按1%接種量接種入有氧階段發(fā)酵培養(yǎng)基中有氧培養(yǎng)，當(dāng)有氧培養(yǎng)菌體0D_至0. 4 0. 6用0. 3 mM的IPTG誘導(dǎo)至0D_=3時(shí)，按接種量10%轉(zhuǎn)接至厭氧階段發(fā)酵培養(yǎng)基中厭氧發(fā)酵。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于所述的厭氧階段發(fā)酵培養(yǎng)基的碳源為葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、果糖或者其組合。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于所述的厭氧階段發(fā)酵培養(yǎng)基的碳源為玉米芯水解液、稻草秸桿水解液、糖蜜水解液或者甘蔗渣水解液。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域，涉及一株產(chǎn)丁二酸基因工程菌及其發(fā)酵生產(chǎn)丁二酸的方法。本發(fā)明的產(chǎn)丁二酸基因工程菌菌株分類命名為大腸埃希氏菌(Escherichia coli)BA306，其保藏編號(hào)為CCTCC NOM2012103。其構(gòu)建過(guò)程主要包括失活或敲除磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因和磷酸轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)中的ptsG基因，并過(guò)量共表達(dá)磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶和煙酸磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶，使重組大腸桿菌能夠高效利用葡萄糖、木糖、阿拉伯糖及果糖等單糖，同時(shí)高效利用各種比例混合糖以及纖維素水解液生長(zhǎng)，大幅度提高了丁二酸的合成效率。其發(fā)酵方法采用兩階段發(fā)酵方式，有氧階段提高生物量，厭氧階段發(fā)酵產(chǎn)酸。
文檔編號(hào)C12R1/19GK102643774SQ20121014317
公開日2012年8月22日 申請(qǐng)日期2012年5月10日 優(yōu)先權(quán)日2012年5月10日
發(fā)明者劉嶸明, 吳明科, 姜岷, 曹偉佳, 梁麗亞, 陳可泉, 韋萍, 馬江鋒 申請(qǐng)人:南京工業(yè)大學(xué)