專利名稱：產(chǎn)丁二酸基因工程菌及其發(fā)酵生產(chǎn)丁二酸的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域，涉及ー株產(chǎn)丁ニ酸基因工程菌及其發(fā)酵生產(chǎn)丁ニ酸的方法，具體是ー株高效利用葡萄糖、木糖、阿拉伯糖及果糖等單糖，并且高效利用各種比例混合糖以及纖維素水解液生長并產(chǎn)丁ニ酸重組菌株及其利用該菌株發(fā)酵生產(chǎn)丁ニ酸的方法
背景技術(shù)：
丁ニ酸(succinic acid)又稱琥珀酸，被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、農(nóng)藥、染料、香料、油漆、食品和塑料等行業(yè)，作為C4平臺化合物，可用于合成1，4-丁ニ醇、四氫呋喃、Y-丁內(nèi)酯等有機(jī)化學(xué)品以及聚丁ニ酸丁ニ醇酯(PBS)類生物可降解材料，被美國能源部認(rèn)為是未來12種最有價(jià)值的生物煉制產(chǎn)品之一。丁ニ酸的生產(chǎn)方法主要包括化學(xué)合成法和微生物發(fā)酵法，利用微生物發(fā)酵法轉(zhuǎn)化可再生資源，由于原料來源廣泛且價(jià)格低廉，污染小，環(huán)境友好，且在發(fā)酵過程中可以吸收固定CO2，能有效緩解溫室效應(yīng)，開辟了溫室氣體ニ氧化碳利用的新途徑，今年來成為研究的熱點(diǎn)。丁ニ酸的生產(chǎn)菌株主要集中在Anaerobiospirillum succiniciproducens、Actinobacillus succinogenes、Mannheimia succiniciproducens、重組谷孰酸棒桿菌和重組大腸桿菌。其中利用野生菌株生產(chǎn)丁ニ酸雖然獲得了較高的產(chǎn)物濃度，但培養(yǎng)過程培養(yǎng)基成本較高，且甲酸、こ酸等副產(chǎn)物積累較多，阻礙了其エ業(yè)化進(jìn)程。而重組大腸桿菌由于遺傳背景清楚、易操作、易調(diào)控、培養(yǎng)基要求簡單和生長迅速等優(yōu)點(diǎn)，近年來被廣泛用于研究以獲得產(chǎn)丁ニ酸優(yōu)秀菌株。PTS轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)是大腸桿菌中葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)的主要轉(zhuǎn)運(yùn)方式，但是PTS轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)的存在，使大腸桿菌不能同時利用葡萄糖和其他各種單糖代謝生長，而野生型大腸桿菌能夠分別利用葡萄糖、木糖、果糖、阿拉伯糖等單糖在厭氧條件下代謝生長，但是丁ニ酸不是其主要代謝產(chǎn)物，為減少副產(chǎn)物生成，大腸桿菌敲除或失活乳酸脫氫酶(LDH)基因，丙酮酸甲酸裂解酶(PFL)基因活性減少副產(chǎn)物的生成。但是當(dāng)以葡萄糖或果糖為碳源時，由于敲除乳酸脫氫酶(LDH)基因和丙酮酸甲酸裂解酶(PFL)基因，導(dǎo)致菌株輔酶不平衡，并且積累了大量丙酮酸，導(dǎo)致菌體不能利用葡萄糖和果糖厭氧條件下代謝生長，井生產(chǎn)丁ニ酸；而以木糖或阿拉伯糖為碳源吋，由于敲除乳酸脫氫酶(LDH)基因和丙酮酸甲酸裂解酶(PFL)基因，減少了丙酮酸和こ酸的生成，從而使伴隨丙酮酸和こ酸生成的ATP減少，最終導(dǎo)致重組大腸桿菌不能利用木糖和阿拉伯糖代謝生長，井生產(chǎn)丁ニ酸。玉米芯是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中比較常見的廢棄物，由于其成分含有大量纖維素，因此其水解液對微生物發(fā)酵來說，是ー種很好的可持續(xù)利用的綠色碳源，但其稀酸水解液含有高濃度木糖，因此現(xiàn)有技術(shù)中大多數(shù)產(chǎn)丁ニ酸大腸桿菌不能利用玉米芯水解液發(fā)酵生產(chǎn)丁ニ酸。姜岷等將玉米芯按料液比1:5 (質(zhì)量體積比)配制玉米芯料液，物料粒徑250 380 u m,H2SO4用量3% (體積分?jǐn)?shù))，水解溫度126°C，反應(yīng)時間215h，利用活性炭吸附及Ca(OH)2中和等方式，對玉米芯多組分糖液進(jìn)行脫毒脫鹽處理，總糖質(zhì)量濃度為50g/L，其中木糖占80%以上。稻草秸桿是重要的ー類可再生生物質(zhì)資源。目前，除了在造紙業(yè)エ業(yè)方面的利用，絕大多數(shù)被廢棄，嚴(yán)重浪費(fèi)了資源并且污染了環(huán)境。其主要成分是纖維素、半纖維素和木質(zhì)素，因此其水解液對微生物發(fā)酵來說，是ー種很好的可持續(xù)利用的綠色碳源，但其水解液含有高濃度木糖，因此現(xiàn)有技術(shù)中大多數(shù)產(chǎn)丁ニ酸大腸桿菌不能利用稻草秸桿水解液發(fā)酵生產(chǎn)丁ニ酸，陶文沂等通過稀硫酸121°C處理稻草秸桿lh，再用20g/L的NaOH于121°C處理秸桿lh，葡萄糖和木糖二者總質(zhì)量濃度達(dá)50g/L左右。甘蔗渣是甘蔗制糖時榨糖之后剩下的主要成分，因此其水解液對微生物發(fā)酵來說，是ー種很好的可持續(xù)利 用的綠色碳源，但其水解液含有高濃度木糖，因此現(xiàn)有技術(shù)中大多數(shù)產(chǎn)丁ニ酸大腸桿菌不能利用稻草秸桿水解液發(fā)酵生產(chǎn)丁ニ酸，約含有50%的纖維素通過粉碎以及堿/氧化法預(yù)處理可得到總糖質(zhì)量為50g/L，其中木糖占80%以上。糖蜜是エ業(yè)制糖過程中，蔗糖結(jié)晶后，剰余的不能結(jié)晶，但仍含有較多糖的液體殘留物。余煒等將糖蜜與水I: I混勻，用濃硫酸(5mol/L)將其pH調(diào)至2.0，于100°C加熱20min，并用15%的石灰乳中和處理，總糖質(zhì)量為600g/L，葡萄糖和果糖各占50%。在大腸桿菌磷酸烯醇式丙酮酸通過磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PPC)生成草酰こ酸，在此過程中沒有ATP的生成,但是在Bacillus subtilis中，磷酸烯醇式丙酮酸是通過磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶(PCK)生成草酰こ酸的，在此過程中有ATP的生成，并且Millard等在大腸桿菌中過量表達(dá)E. colippc和pck,研究發(fā)現(xiàn)過量表達(dá)ppc可以使琥拍酸作為混合酸發(fā)酵的主要產(chǎn)物，且產(chǎn)量較出發(fā)菌株提高3. 5倍，而過量表達(dá)pck對發(fā)酵結(jié)果沒有影響，但在ppc缺陷菌株中，pck的過量表達(dá)能夠提高琥珀酸的產(chǎn)量，這是由于PPC的Km比PCK小100倍，因此只有在ppc缺陷菌株中，pck的過量表達(dá)才能夠提高琥珀酸的產(chǎn)量。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供了一株高效利用葡萄糖、木糖、阿拉伯糖及果糖等單糖，并且高效利用各種比例混合糖以及纖維素水解液生長并產(chǎn)丁ニ酸重組菌株及其構(gòu)建方法，并利用該菌株厭氧發(fā)酵生產(chǎn)丁ニ酸，達(dá)到菌株的構(gòu)建方法簡單方便，構(gòu)建得到的菌株發(fā)酵方法簡單可行，易于エ業(yè)化，產(chǎn)酸能力強(qiáng)的目的，從而大大降低生產(chǎn)成本，提高經(jīng)濟(jì)效益。為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案一、本發(fā)明提供一株產(chǎn)丁ニ酸基因工程菌菌株，其分類命名為大腸埃希氏菌(Escherichia coli) BA305，其保藏號編號為 CCTCC NO M 2012102。ニ、本發(fā)明所述的大腸埃希氏菌BA305的構(gòu)建方法，其特征在于以缺乏乳酸脫氫酶(LDH)基因，丙酮酸甲酸裂解酶(PFL)基因活性的菌株大腸桿菌為出發(fā)菌株，利用同源重組技術(shù)敲除磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PPC)基因和磷酸轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)(PTS)中的ptsG基因，并過量表達(dá)磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶(PCK)后，得到高效利用葡萄糖、木糖、阿拉伯糖及果糖等單糖，并且高效利用各種比例混合糖以及纖維素水解液生長并產(chǎn)丁ニ酸的大腸埃希氏菌BA305。重組菌株大腸埃希氏菌BA305的代謝途徑如圖I所示。進(jìn)ー步地,所述的具體構(gòu)建步驟如下(I)以缺乏乳酸脫氫酶基因(ldhA)，丙酮酸甲酸裂解酶基因(pflB)活性的E. coliNZNlll菌株為出發(fā)菌株，敲除其中磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PPC)基因和PTS轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)中的ptsG基因，得到同時缺乏ldhA、pf IB、ppc和ptsG的感受態(tài)菌株；(2)純化擴(kuò)增出磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶(pck)基因，構(gòu)建得到過量表達(dá)磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶的表達(dá)質(zhì)粒；(3)將步驟(2)所述的質(zhì)粒導(dǎo)入步驟(I)得到的感受態(tài)菌株，獲得陽性轉(zhuǎn)化子；(4)利用步驟(3)的陽性轉(zhuǎn)化子過量表達(dá)磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶(PCK)，恢復(fù)其在厭氧條件下代謝葡萄糖、木糖、阿拉伯糖及果糖等單糖，以及各種比例混合糖和纖維素水解液的能力，得到高效利用葡萄糖、木糖、阿拉伯糖及果糖等單糖，并且高效利用各種比例混合糖以及纖維素水解液生長并產(chǎn)丁ニ酸的大腸埃希氏菌BA305。三、利用本發(fā)明所述的大腸埃希氏菌BA305發(fā)酵生產(chǎn)丁ニ酸的方法，其特征在于采用兩階段發(fā)酵方式，有氧階段提高生物量，厭氧階段發(fā)酵產(chǎn)酸。進(jìn)ー步地,具體步驟如下。將大腸埃希氏菌BA305按l%(v/v)接種量接種入有氧階段發(fā)酵培養(yǎng)基中有氧培養(yǎng)，當(dāng)有氧培養(yǎng)菌體OD6tltl至0. 4 0. 6用0. 3mM的IPTG誘導(dǎo)至0D_=3吋，按接種量10%轉(zhuǎn)接至厭氧階段發(fā)酵培養(yǎng)基中厭氧發(fā)酵。其中所述的有氧階段發(fā)酵培養(yǎng)基是現(xiàn)有技術(shù)中有氧培養(yǎng)產(chǎn)丁ニ酸大腸桿菌的常規(guī)培養(yǎng)基；所述的厭氧階段發(fā)酵培養(yǎng)基中的碳源包括但不限于葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、果糖或者其組合；還包括玉米芯水解液、稻草秸桿水解液、糖蜜水解液或者甘蔗渣水解液。本發(fā)明的有益效果在于首先，本發(fā)明以缺乏乳酸脫氫酶(LDH)基因，丙酮酸甲酸裂解酶(PFL)基因活性的菌株大腸桿菌NZNlll為出發(fā)菌株，利用同源重組技術(shù)敲除磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PPC)基因和PTS轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)中的ptsG基因，并過量表達(dá)磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶，使其高效利用葡萄糖、木糖、阿拉伯糖及果糖等單糖，并且高效利用各種比例混合糖以及纖維素水解液生長并產(chǎn)丁ニ酸。這種通過分子生物學(xué)手段提高菌株ATP生物合成能力，高效利用葡萄糖、木糖、阿拉伯糖及果糖等單糖，使菌株能夠高效利用各種比例混合糖以及纖維素水解液代謝生長，大量提高丁ニ酸的產(chǎn)量及生產(chǎn)能力的方法未見公開，而這種應(yīng)用將大大推進(jìn)丁ニ酸產(chǎn)業(yè)的進(jìn)步和發(fā)展。其次，利用本發(fā)明所述的菌株大腸埃希氏菌BA305的發(fā)酵結(jié)果表明新構(gòu)建的重組大腸桿菌大腸埃希氏菌BA305能夠高效利用葡萄糖、木糖、阿拉伯糖及果糖等單糖，并且高效利用各種比例混合糖以及纖維素水解液發(fā)酵，并大量積累丁ニ酸，相比出發(fā)菌株，不能利用葡萄糖、木糖、阿拉伯糖及果糖等單糖，各種比例混合糖和纖維素水解液發(fā)酵，沒有丁ニ酸積累的特征，其產(chǎn)酸特征變化巨大。最后，厭氧發(fā)酵過程中產(chǎn)大量諸如こ酸等對菌株有毒害作用的副產(chǎn)物，因此考慮兩階段發(fā)酵方式，有氧階段提高生物量，厭氧階段進(jìn)行產(chǎn)酸發(fā)酵。也可以選擇性地采用膜分離技木，達(dá)到分離菌體的目的，再進(jìn)而用于厭氧發(fā)酵。


圖IEscherichia coli BA305 的代謝途徑。圖2實(shí)施例I的線性DNA片段的電泳鑒定圖。圖3實(shí)施例I的同源重組陽性重組子的電泳鑒定圖。、
圖4實(shí)施例2的線性DNA片段的電泳鑒定圖。圖5實(shí)施例2的同源重組陽性重組子的電泳鑒定圖。圖6質(zhì)粒pTrc99a-pck的雙酶切電泳鑒定圖。本發(fā)明的微生物的分類命名為大腸埃希氏菌(Escherichia coli) BA305,其保藏日期為2012年4月8日，保藏單位全稱為中國典型培養(yǎng)物保藏中心，簡稱為CCTCC，地址為中國 武漢 武漢大學(xué)，保藏編號=CCTCC NO M 2012102。
具體實(shí)施例方式下面的實(shí)施例對本發(fā)明作詳細(xì)說明，但對本發(fā)明沒有限制。本發(fā)明的生物材料的來源的說明I、本發(fā)明所述的安普霉素抗性基因的來源是PIJ773，南京師范大學(xué)邵蔚藍(lán)教授惠贈。2、本發(fā)明所述的能夠誘導(dǎo)表達(dá)\重組酶的質(zhì)粒的來源是pKD46，購自Introvegen 公 ロJ。3、本發(fā)明所述的能夠誘導(dǎo)產(chǎn)生FLP重組酶的質(zhì)粒的來源是pCP20，購自丄ntrovegen 公 ロJ。4、本發(fā)明所述的Bacillus subtilis基因組的來源是購自中國典型培養(yǎng)物保藏中心。5、本發(fā)明所述的表達(dá)質(zhì)粒用pTrc99a的來源是購自Introvegen公司。6、出發(fā)菌株E. coli NZNlll的感受態(tài)菌株的來源有兩處(I)Biotechnol Bioeng, 2001，74:89 95。申請人首先通過查閱到該生物材料的上述文獻(xiàn)出處，并聯(lián)系了發(fā)表人系美國芝加哥大學(xué)的David P. Clark教授，并郵件請求其贈與該生物材料，并免費(fèi)獲得了該生物材料；且申請人保證從本申請日起二十年內(nèi)向公眾發(fā)放該生物材料；(2)該生物材料還在中國專利(申請?zhí)?6198547. X，申請日1996. 10. 31，授權(quán)日2003年I月I日，授權(quán)公告號CN1097632C)的專利文獻(xiàn)中公開并獲得授權(quán)。7、本發(fā)明的引物的設(shè)計(jì)及合成自行設(shè)計(jì)并外包金斯瑞生物技術(shù)公司合成。實(shí)施例I本實(shí)施例說明利用同源重組技術(shù)敲除出發(fā)菌株NZNlll中磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶ppc基因，得到消除安普霉素抗性菌株的過程。I、利用LB培養(yǎng)基，于37°C、有氧條件下培養(yǎng)大腸桿菌NZNlll至OD6tltl=O. 4 0. 6，制備成電轉(zhuǎn)感受態(tài)。2、將質(zhì)粒pKD46電轉(zhuǎn)入感受態(tài)的大腸桿菌NZNlll。電擊條件為200 Q，25 y F，電擊電壓2. 3kV，電擊時間4 5ms。電擊后迅速將菌體加入預(yù)冷ImL的SOC培養(yǎng)基，150r/min、30°C培養(yǎng)Ih之后涂布于帶氨芐青霉素(amp)的LB培養(yǎng)基平板篩選出陽性轉(zhuǎn)化子大腸桿菌 NZNlll (pKD46)。3、在LB培養(yǎng)基中加入IOmM的L-阿拉伯糖，于30°C下誘導(dǎo)質(zhì)粒pKD46表達(dá)出入
重組酶，制成電轉(zhuǎn)感受態(tài)。4、以兩側(cè)帶有FRT位點(diǎn)的安普霉素抗性基因?yàn)槟０?，利用高保真PCR擴(kuò)增系統(tǒng)，以質(zhì)粒PIJ773為模板，并設(shè)計(jì)兩端帶有PPC同源片段的擴(kuò)增引物，擴(kuò)增出線性DNA同源片段，引物序列如下
上游帶同源臂引物H1-P1，下劃線為同源片段5， -ATGAACGAACAATATTCCGCATTGCGTAGTAATGTCAGTATGCTCGGCATTCCGGGGATCCGTCGACC-3 。下游帶同源臂引物H2-P2，下劃線為同源片段5， -AGCACGAGGGTTTGCAGAAGAGGAAGATTAGCCGGTATTACGCATACCTGTAGGCTGGAGCTGCTTC-3 。反應(yīng)體系帶同源臂的上下游引物(lOOpmol/ii L)各0. 5 ii L ;模板DNA(100ng/U L)0. 5u L ；10Xbuffer 5u L ；dNTPs (IOmM)各 I y L ;DMS0 (100%) 2. 5 y L ;Pyrobest DNA聚合酶(2. 5U/ u L) I u L ；ddH20 36/35. 5 u L ;總體積 50u L0反應(yīng)條件94°C, 2min ； (94 °C 45sec ；50 °C 45sec ；72 °C 90sec ; 10 個循環(huán))；(94°C 45sec ；50°C 45sec ；72°C 90sec ;15 個循環(huán))；72°C，5min。線性DNA片段的鑒定如圖2。5、電轉(zhuǎn)線性DNA片段至已誘導(dǎo)表達(dá)入重組酶的大腸桿菌NZNlll(pKD46)感受態(tài)，并涂布于帶安普霉素的LB平板篩選出陽性重組子，并進(jìn)行了 PCR鑒定，電泳圖如圖3所示。6、陽性重組子制成感受態(tài)后倒入能誘導(dǎo)表達(dá)FLP重組酶的質(zhì)粒pCP20，于42°C熱激表達(dá)FLP重組酶后即可消除安普霉素抗性。利用ー對平板，進(jìn)行平行點(diǎn)樣，能夠在無抗性平板上生長，但不能在抗性平板上生長的均極為已經(jīng)敲除抗性的菌株。實(shí)施例2本實(shí)施例說明利用實(shí)施案例I得到的已敲除ppc基因的菌株，再次利用同源重組技術(shù)敲除PTS轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)中ptsG基因，得到消除安普霉素抗性菌株的過程。I、利用LB培養(yǎng)基，于37°C、有氧條件下培養(yǎng)已實(shí)施案例I得到的已敲除ppc基因的菌株至OD6qq=O. 4 0. 6，制備成電轉(zhuǎn)感受態(tài)。2、將質(zhì)粒pKD46電轉(zhuǎn)入此感受態(tài)細(xì)胞中。電擊條件為200 Q，25 y F，電擊電壓
2.3kV，電擊時間4 5ms。電擊后迅速將菌體加入預(yù)冷ImL的SOC培養(yǎng)基，150r/min、30°C培養(yǎng)Ih之后涂布于帶氨芐青霉素(amp)的LB培養(yǎng)基平板篩選出陽性轉(zhuǎn)化子大腸桿菌NZNlll/ A ppc(pKD46)。3、在LB培養(yǎng)基中加入IOmM的L-阿拉伯糖，于30°C下誘導(dǎo)質(zhì)粒pKD46表達(dá)出入
重組酶，制成電轉(zhuǎn)感受態(tài)。4、以兩側(cè)帶有FRT位點(diǎn)的安普霉素抗性基因?yàn)槟０?，利用高保真PCR擴(kuò)增系統(tǒng)，以質(zhì)粒PIJ773為模板，并設(shè)計(jì)兩端帶有ptsG基因同源片段的擴(kuò)增引物，擴(kuò)增出線性DNA同源片段，引物序列如下上游帶同源臂引物H1-P1，下劃線為同源片段5， -ATGTTTAAGAATGCATTTGCTAACCTGCAAAAGGTCGGTAAATCGCTGATTCCGGGGATCCGTCGACC-3，。下游帶同源臂引物H2-P2，下劃線為同源片段5， -TTAGTGGTTACGGATGTACTCATCCATCTCGGTTTTCAGGTTATCGGATGTAGGCTGGAGCTGCTTC-3，。
反應(yīng)體系帶同源臂的上下游引物(100pmol/ii L)各0. 5 ii L ;模板DNA(100ng/U L)0. 5u L ；10Xbuffer 5u L ；dNTPs (IOmM)各 I y L ;DMS0 (100%) 2. 5 y L ;Pyrobest DNA聚合酶(2. 5U/ u L) I u L ；ddH20 36/35. 5 u L ;總體積 50u L0反應(yīng)條件94°C, 2min ； (94 °C 45sec ；50 °C 45sec ；72 °C 90sec ; 10 個循環(huán))；(94°C 45sec ；50°C 45sec ；72°C 90sec ;15 個循環(huán))；72°C，5min。線性DNA片段的鑒定如圖4。5、電轉(zhuǎn)線性DNA片段至已誘導(dǎo)表達(dá)X重組酶的大腸桿菌NZNlll/A ppc (pKD46)感受態(tài)，并涂布于帶安普霉素的LB平板篩選出陽性重組子，并進(jìn)行了 PCR鑒定，電泳圖如圖5所示。6、陽性重組子制成感受態(tài)后倒入能誘導(dǎo)表達(dá)FLP重組酶的質(zhì)粒pCP20，于42°C熱 激表達(dá)FLP重組酶后即可消除安普霉素抗性。利用ー對平板，進(jìn)行平行點(diǎn)樣，能夠在無抗性平板上生長，但不能在抗性平板上生長的均極為已經(jīng)敲除抗性的菌株。實(shí)施例3本實(shí)施例說明構(gòu)建過量表達(dá)磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶的表達(dá)質(zhì)粒，能夠高效利用葡萄糖、木糖、阿拉伯糖及果糖等單糖，并且高效利用各種比例混合糖以及纖維素水解液發(fā)酵，并大量積累丁ニ酸，得到菌株大腸埃希氏菌BA305的方法。I、構(gòu)建過量表達(dá)磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶的表達(dá)質(zhì)粒，其過程包括(I)合成帶有SacI和XbaI酶切位點(diǎn)的引物，上游引物5’-CGAGCTCATGAACTCAGTTGATTTGACCG-3’ ；下游引物5，-GCTCTAGAGCATTCCGTCAATTAAAACAAG-3，。(2)以Bacillus subtilis基因組為模板，PCR擴(kuò)增目的基因片段，反應(yīng)條件為94°C,5min ；(94°C 45s, 53°C 45s, 72°C 100s，35 個循環(huán));72°C，IOmin。純化擴(kuò)增出的 pck基因后，表達(dá)質(zhì)粒用pTrc99a分別用SacI和XbaI雙酶切、連接獲得重組質(zhì)粒pTrc99a-pck。質(zhì)粒pTrc99a-pck的雙酶切電泳鑒定如圖6所示。(3)將質(zhì)粒pTrc99a_pck導(dǎo)入實(shí)施案例2中同時缺乏ldhA、pflB、ppc和ptsG的感受態(tài)菌株，獲得的陽性轉(zhuǎn)化子即為本發(fā)明的新構(gòu)建菌株Escherichia coliBA305。實(shí)施例4本實(shí)施例說明大腸埃希氏菌BA305與出發(fā)菌株利用木糖發(fā)酵產(chǎn)酸能力的對比。大腸埃希氏菌BA305能夠高效利用木糖發(fā)酵，并大量積累丁ニ酸，采用兩階段發(fā)酵方式，其特征在于按l%(v/v)接種量從凍存管接入三角瓶中，當(dāng)有氧培養(yǎng)菌體OD6tltl至0. 6左右用0. 3mM的IPTG誘導(dǎo)至0D_=3左右吋，按接種量10%轉(zhuǎn)接至血清瓶中厭氧發(fā)酵，發(fā)酵48h。有氧階段培養(yǎng)基為LB+Amp (氨芐青霉素50 U g/mL)。厭氧階段培養(yǎng)基為LB+木糖(30g/L) +堿式碳酸鎂0. 6g+Amp (氨節(jié)青霉素50ii g/mL)+0. 3mM IPTG。發(fā)酵結(jié)果見表I。表IEscherichia coli BA305與出發(fā)菌株發(fā)酵產(chǎn)酸的結(jié)果比較
權(quán)利要求
1.一株產(chǎn)丁ニ酸基因工程菌菌株，其分類命名為大腸埃希氏菌BA305 (Escherichiacoli BA305)，其保藏編號為 CCTCC NO :M2012102。
2.權(quán)利要求I所述的大腸埃希氏菌BA305的構(gòu)建方法，其特征在于以缺乏乳酸脫氫酶基因，丙酮酸甲酸裂解酶基因活性的菌株大腸桿菌為出發(fā)菌株，利用同源重組技術(shù)敲除磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因和磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)的PtsG基因后，過量表達(dá)磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶后，得到大腸埃希氏菌BA305。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的構(gòu)建方法，其特征在于具體構(gòu)建步驟如下 (1)以缺乏乳酸脫氫酶基因，丙酮酸甲酸裂解酶基因活性的E.coli菌株為出發(fā)菌株，敲除其中磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因和磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)的PtsG基因，得到同時缺乏.ldhA、pf IB、ppc和ptsG的感受態(tài)菌株； (2)純化擴(kuò)增出磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶基因，構(gòu)建得到過量表達(dá)磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶的表達(dá)質(zhì)粒； (3)將步驟(2)所述的質(zhì)粒導(dǎo)入步驟(I)得到的感受態(tài)菌株，獲得陽性轉(zhuǎn)化子； (4)利用步驟(3)的陽性轉(zhuǎn)化子過量表達(dá)磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶，恢復(fù)其在厭氧條件下代謝，得到的菌株即大腸埃希氏菌BA305。
4.利用權(quán)利要求I所述的大腸埃希氏菌BA305發(fā)酵生產(chǎn)丁ニ酸的方法，其特征在于采用兩階段發(fā)酵方式，有氧階段提高生物量，厭氧階段發(fā)酵產(chǎn)酸。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于將大腸埃希氏菌BA305按體積比1%接種量接種入有氧階段發(fā)酵培養(yǎng)基中有氧培養(yǎng)，當(dāng)有氧培養(yǎng)菌體0D_至0. 4 0. 6用0. 3mM的IPTG誘導(dǎo)至0D_=3吋，按接種量體積比10%轉(zhuǎn)接至厭氧階段發(fā)酵培養(yǎng)基中厭氧發(fā)酵。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于所述的厭氧階段發(fā)酵培養(yǎng)基的碳源為葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、果糖或者其組合。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于所述的厭氧階段發(fā)酵培養(yǎng)基的碳源為玉米芯水解液、稻草秸桿水解液、糖蜜水解液或者甘蔗渣水解液。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域，涉及一株產(chǎn)丁二酸基因工程菌及其發(fā)酵生產(chǎn)丁二酸的方法。本發(fā)明的產(chǎn)丁二酸基因工程菌菌株分類命名為大腸埃希氏菌(Escherichia coli)BA305，其保藏號編號為CCTCC NOM2012102。其構(gòu)建過程主要包括失活或敲除磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因和磷酸轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)中的ptsG基因，并過量表達(dá)磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶，使重組大腸桿菌能夠高效利用葡萄糖、木糖、阿拉伯糖及果糖等單糖，同時高效利用各種比例混合糖以及纖維素水解液生長，大幅度提高了丁二酸的合成效率。其發(fā)酵方法采用兩階段發(fā)酵方式，有氧階段提高生物量，厭氧階段發(fā)酵產(chǎn)酸。
文檔編號C12N15/70GK102643775SQ20121014317
公開日2012年8月22日 申請日期2012年5月10日 優(yōu)先權(quán)日2012年5月10日
發(fā)明者劉嶸明, 吳明科, 姜岷, 曹偉佳, 梁麗亞, 陳可泉, 韋萍, 馬江鋒 申請人:南京工業(yè)大學(xué)